莪術醇衍生物及其制備方法和應用與流程

本發明涉及藥物化學和治療學領域，特別是涉及一種莪術醇衍生物及其制備方法和應用。
背景技術：
：莪術是姜科植物蓬莪術CurcumaphaeocaulisVal.、溫郁金C.wenyujinY.H.ChenetC.Ling、廣西莪術C.kwangsiensisS.leeetC.F.Liang的干燥根莖，是一味重要的中藥材，別名為黑心姜、藍心姜、姜七，主要產于四川、福建、浙江、廣西等地，首載于《藥性論》。中醫理論認為，其味辛、苦，性溫，歸肝、脾經，具有行氣破血、消積止痛的功效。其臨床用于癥瘕積聚、經閉及心腹瘀痛、食積脘腹脹痛等癥狀。其主要成分莪術揮發油具有較好的抗腫瘤作用、抗早孕作用、抗菌作用、保肝作用以及抗炎作用等。莪術揮發油主要為倍半萜和倍半萜烯類化合物，包括莪術醇、莪術二酮、吉馬酮、β-欖香烯、呋喃二烯、莪術烯、新莪術二酮等。而莪術醇是主要的抗癌成分。莪術醇(Curcmol)，又名莪黃醇、姜黃環氧醇，為具有半縮酮的氫化奧類化合物，由五元環和七元環并合而成，其中的七元環通過半縮酮的氧橋又形成了一個五元環和六元環，因而使得三個環的張力變小，形成了具有剛性結構的較穩定的化合物，屬于倍半萜類化合物，莪術醇的化學結構式如下：已有研究表明：50μg/mL、100μg/mL的莪術醇作用于宮頸癌CASKI細胞24h，可阻滯細胞周期于G2/M期，并誘導部分細胞凋亡。電鏡下可見凋亡細胞及凋亡小體，且100μg/mL組細胞凋亡改變較50μg/mL組更明顯。莪術醇能明顯抑制CASKI細胞的體外增殖，且可阻滯CASKI細胞周期于G2/M期并誘導細胞凋亡。另外，莪術醇還具有抗菌、抗病毒、抗血栓、抗潰瘍、抗著床、抗早孕、抗銀屑、保肝及升白等作用。可見，莪術醇是一種很好的天然產物，但其也存在著一些缺點：1、莪術醇的水溶性及差，其在水中的溶解度僅為0.3％，極大地限制了實驗研究和臨床使用；2、莪術醇的抗腫瘤效果與傳統抗腫瘤化療藥物比還是有一定差距；3、局部注射，疼痛感較重；4、抗腫瘤的種類存在局限性。技術實現要素：有鑒于此，本發明的目的在于提出一種莪術醇衍生物及其制備方法和應用，以提高莪術醇衍生物的水溶性、脂溶性和穩定性。基于上述目的，本發明提供的莪術醇衍生物的結構式如下：本發明還提供一種上述莪術醇衍生物的制備方法，包括以下步驟：以莪術醇與甘油為原料，先利用莪術醇與琥珀酸酐反應生成第一中間體，甘油與叔丁基二甲基硅氯烷反應生成第二中間體，再將第一中間體和第二中間體反應生成第三中間體，最后第三中間體脫保護反應得到目標化合物莪術醇衍生物。在本發明的一些實施例中，所述莪術醇衍生物的制備方法包括以下步驟：將琥珀酸酐和4-二甲氨基吡啶加入到莪術醇中，于50～80℃條件下回流反應，得到第一中間體以甘油原料，以叔丁基二甲基硅氯烷作為保護基團，反應得到第二中間體將第一中間體溶解于三氯甲烷中，然后加入第二中間體、二甲氨基吡啶和碳化二亞胺，反應后得到第三中間體在氮氣保護下，將四氫呋喃溶解到第三中間體中，然后滴加四丁基氟化銨，反應后得到莪術醇衍生物。在本發明的一些實施例中，所述第二中間體的制備過程包括以下步驟：將甘油和咪唑混合，在氮氣保護下加入四氫呋喃和叔丁基二甲基硅氯烷，-5～5℃條件下反應，得到第二中間體本發明還提供一種莪術醇衍生物納米粒子，包括上述莪術醇衍生物。本發明還提供一種藥物組合物，包括上述莪術醇衍生物和藥用載體。本發明還提供一種上述莪術醇衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明還提供一種上述莪術醇衍生物在制備抗菌、抗病毒、抗血栓、抗潰瘍、抗著床、抗早孕、抗銀屑、保肝或者升白藥物中的應用。從上面所述可以看出，本發明以莪術醇與甘油為原料，保留莪術醇的結構骨架，對莪術醇8位上的羥基基團進行修飾，合成了新型的具有抗癌、抗菌、抗病毒等作用的莪術醇衍生物，合成方法簡便，產物純度高。與莪術醇比較而言，本發明提供的莪術醇衍生物具有以下優點：1、較好的水溶性與脂溶性；2、穩定性高。3、高效低毒。進一步地，與本發明合成的莪術醇衍生物相比較而言，本發明提供的莪術醇衍生物納米粒子具有以下優點：1、持續釋放的特性；2、生物利用度高。附圖說明圖1為本發明實施例的莪術醇衍生物納米粒子的體外釋放曲線圖；圖2為本發明實施例的莪術醇衍生物納米粒子透射電子顯微鏡；圖3為本發明實施例的莪術醇衍生物納米粒子的粒徑分布圖；圖4為本發明實施例的各樣品的UPLC色譜圖；圖5為本發明實施例的Cur-NS與Cur在大鼠體內的藥-時曲線圖；圖6為莪術醇及本發明的莪術醇衍生物的體外抗腫瘤活性測試結果。具體實施方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，對本發明進一步詳細說明。本發明提供的莪術醇衍生物的結構式如下：本發明還提供一種制備上述莪術醇衍生物的方法，包括：以莪術醇與甘油為原料，先利用莪術醇與琥珀酸酐反應生成第一中間體A1，甘油與叔丁基二甲基硅氯烷(TBSCl)反應生成第二中間體A2，再將第一中間體A1和第二中間體A2反應生成第三中間體A3，最后第三中間體A3脫保護反應得到目標化合物莪術醇衍生物。具體地，所述莪術醇衍生物的合成路線如下：1、第一中間體A1的合成反應2、第二中間體A2的合成反應3、第三中間體A3的合成反應4、目標化合物莪術醇衍生物的合成反應可見，本發明根據莪術醇結構特性，選擇叔丁基二甲基硅氯烷作為保護基團得到第二中間體，合成第三中間體時選用二甲氨基吡啶和碳化二亞胺，本發明提供的莪術醇的制備方法具有合成方法簡便，產物純度高的優點。實施例11、制備第一中間體A1取22.5mg莪術醇(1N)于圓底燒瓶中，加入3ml過夜干燥氯仿攪拌溶解，分別加入27.3mg琥珀酸酐(3N)，2.2mg4-二甲氨基吡啶(即DMAP，0.2N)，于65℃下回流，每間隔1.5h加入1.1mg4-二甲氨基吡啶，TLC檢測至原料反應完全，冷卻至室溫，濃縮溶液，用石油醚-乙酸乙酯體積比15:1進行硅膠柱層析分離產物，得到淡黃色油狀物9.76mg，其為第一中間體A1，收率為19.6％。分子式為C19H28O5，HR-ESI-MSm/z:359.7500[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:4.86(2H,s,H-14),2.66～2.62(4H,m,H-1′,2′),2.52(1H,d,J＝15.0Hz,H-9b),2.34(1H,m,H-9a),2.18(1H,t,J＝9.0,10.8Hz,H-1),2.14(1H,t,J＝12.6,12.6Hz,H-6b),1.94(1H,m,H-3b),1.88(1H,m,H-4),1.78(1H,m,H-11),1.67(2H,m,H-2),1.63(1H,m,H-7),1.49(1H,m,H-3a),1.28(1H,dd,J＝6.6,12.6Hz,H-6a),1.00(3H,d,J＝6.6Hz,H-12),0.94(3H,d,J＝6.6Hz,H-15),0.86(3H,d,J＝6.6Hz,H-13)；13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:176.7,169.5,144.5,113.3,109.4,89.8,54.6,51.6,39.5,36.9,33.5,30.9,30.4,29.4,28.6,28.4,22.9,21.4,12.3。2、制備第二中間體A2取200mg甘油(1N)、290mg咪唑(2N)于50ml圓底燒瓶中，氮氣保護，加入10ml四氫呋喃(THF)攪拌溶解，將633ml叔丁基二甲基硅氯烷(即TBSCl，2N)溶于3ml四氫呋喃中，0℃下緩慢滴加至反應TLC檢測原料反應完全，用1ml蒸餾水焠滅，乙酸乙酯萃取，將有機相用無水Na2SO4干燥，過濾，濃縮，用石油醚-乙酸乙酯體積比50:1進行硅膠柱層析分離產物得到無色油狀物518.12mg，其為第二中間體化合物A2，收率為60.2％。分子式為C15H36O3Si2，HR-ESI-MSm/z:343.3333[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:3.63～3.65(5H,m),2.46(1H,d,J＝5.4Hz),0.89(18H,s),0.06(12H,s),13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:71.96,63.55(C×2),25.99(C×6),18.49(C×2),-5.30(C×4)。3、制備第三中間體A3取7.886mg第一中間體A1(1N)于10ml圓底燒瓶中，加入3ml無水二氯甲烷(DCM)攪拌溶解，分別加入12.7mg第二中間體A2(1.2N)、0.57mg4-二甲氨基吡啶(即DMAP，0.2N)和5.39mg碳化二亞胺(即EDCI，1.2N)，室溫下反應，TLC檢測反應進度，至反應結束，濃縮溶液，用石油醚-乙酸乙酯體積比100:1進行硅膠柱層析分離產物，淡黃色油狀物9.92mg，其為第三中間體A3，收率為48.2％。分子式為C34H62O7Si2，HR-ESI-MSm/z：661.5833[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:4.86(2H,s,H-14),3.69～3.76(5H,m,H-3′,H-4′,4″),2.66～2.61(4H,m,H-1′,2′),2.51(1H,d,J＝14.4Hz,H-9b),2.30(1H,m,H-9a),2.18(1H,t,J＝9.0,10.8Hz,H-1),2.12(1H,t,J＝12.6,12.6Hz,H-6b),1.93(1H,m,H-3b),1.89(1H,m,H-4),1.78(1H,m,H-11),1.71(2H,m,H-2),1.65(1H,m,H-7),1.49(1H,m,H-3a),1.28(1H,dd,J＝6.6,12.6Hz,H-6a),1.00(3H,d,J＝6.6Hz,H-12),0.94(3H,d,J＝6.6Hz,H-15),0.87(18H,m,H-6,7′,8′,6″,7″,8″),0.85(3H,d,J＝6.6Hz,H-13),0.04(12H,m,H-5′,9′,5″,9″)；13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:171.9,169.5,144.6,113.2,109.3,89.8,75.2,61.2(C×2),54.6,51.8,39.5,36.8,33.5,30.9,30.7,29.2,28.4,28.4,25.9(C×6),22.9,21.5,18.3(C×2),12.3,-5.2(C×4)。4、目標化合物A4取22mg第三中間體A3(1N)于10ml圓底燒瓶中，氮氣保護，加入4ml四氫呋喃(THF)攪拌溶解，緩慢滴加29μL四丁基氟化銨(TBAF)，室溫下反應，TLC檢測反應進度，至反應結束，用5ml蒸餾水焠滅，飽和NaCl洗脫，乙酸乙酯萃取，將有機相用無水Na2SO4干燥，過濾，濃縮，用石油醚-乙酸乙酯體積比1.5:1進行硅膠柱層析分離產物，得到淡黃色油狀物7.23mg，其為目標化合物A4，即莪術醇衍生物，收率為32.8％。分子式為C22H34O7，HR-ESI-MSm/z：433.5833[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:4.87(2H,s,H-14),4.09～4.24(5H,m,H-3′,4′4″),2.65～2.61(4H,m,H-1′,2′),2.52(1H,d,J＝15Hz,H-9b),2.33(1H,m,H-9a),2.18(1H,t,J＝9.0,10.8Hz,H-1),2.15(1H,t,J＝12.6,12.6Hz,H-6b),1.93(1H,m,H-3b),1.91(1H,m,H-4),1.78(1H,m,H-11),1.69(2H,m,H-2),1.65(1H,m,H-7),1.49(1H,m,H-3a),1.15(1H,dd,J＝6.6,12.6Hz,H-6a),0.99(3H,d,J＝6.6Hz,H-12),0.93(3H,d,J＝6.6Hz,H-15),0.85(3H,d,J＝6.6Hz,H-13)；13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:172.4,169.9,144.1,113.4,109.5,90.0,75.6,65.7,63.2,54.5,51.6,39.3,36.8,33.4,30.8,30.6,29.1,28.3,28.3,22.8,21.4,12.1。實施例21、制備第一中間體A1取22.5mg莪術醇(1N)于圓底燒瓶中，加入3ml過夜干燥氯仿攪拌溶解，分別加入27.3mg琥珀酸酐(3N)，2.2mg4-二甲氨基吡啶(即DMAP，0.2N)，于70℃下回流，每間隔1.0h加入1.1mg4-二甲氨基吡啶，TLC檢測至原料反應完全，冷卻至室溫，濃縮溶液，用石油醚-乙酸乙酯體積比10:1進行硅膠柱層析分離產物，得到淡黃色油狀物9.76mg，其為第一中間體A1，收率為19.6％。2、制備第二中間體A2取200mg甘油(1N)、290mg咪唑(2N)于50ml圓底燒瓶中，氮氣保護，加入10ml四氫呋喃(THF)攪拌溶解，將633ml叔丁基二甲基硅氯烷(即TBSCl，2N)溶于3ml四氫呋喃中，0℃下緩慢滴加至反應TLC檢測原料反應完全，用1.5ml蒸餾水焠滅，乙酸乙酯萃取，將有機相用無水Na2SO4干燥，過濾，濃縮，用石油醚-乙酸乙酯體積比40:1進行硅膠柱層析分離產物得到無色油狀物518.12mg，其為第二中間體化合物A2，收率為60.2％。3、制備第三中間體A3取7.886mg第一中間體A1(1N)于10ml圓底燒瓶中，加入3ml無水二氯甲烷(DCM)攪拌溶解，分別加入12.7mg第二中間體A2(1.2N)、0.57mg4-二甲氨基吡啶(即DMAP，0.2N)和5.39mg碳化二亞胺(即EDCI，1.2N)，室溫下反應，TLC檢測反應進度，至反應結束，濃縮溶液，用石油醚-乙酸乙酯體積比70:1進行硅膠柱層析分離產物，淡黃色油狀物9.92mg，其為第三中間體A3，收率為48.2％。4、目標化合物A4取22mg第三中間體A3(1N)于10ml圓底燒瓶中，氮氣保護，加入4ml四氫呋喃(THF)攪拌溶解，緩慢滴加29μL四丁基氟化銨(TBAF)，室溫下反應，TLC檢測反應進度，至反應結束，用5ml蒸餾水焠滅，飽和NaCl洗脫，乙酸乙酯萃取，將有機相用無水Na2SO4干燥，過濾，濃縮，用石油醚-乙酸乙酯體積比1:1進行硅膠柱層析分離產物，得到淡黃色油狀物7.23mg，其為目標化合物A4，即莪術醇衍生物，收率為32.8％。實施例31、制備第一中間體A1取1.550g莪術醇(1N)于圓底燒瓶中，加入10ml過夜干燥氯仿攪拌溶解，分別加入1.881g琥珀酸酐(3N)，151.56mg4-二甲氨基吡啶(即DMAP，0.2N)，于65℃下回流，每間隔1.5h加入75.78mg4-二甲氨基吡啶，TLC檢測至原料反應完全，冷卻至室溫，濃縮溶液，用石油醚-乙酸乙酯體積比15:1進行硅膠柱層析分離產物，得到淡黃色油狀物655.32mg，其為第一中間體A1，收率為19.1％。2、制備第二中間體A2取500mg甘油(1N)、725mg咪唑(2N)于100ml圓底燒瓶中，氮氣保護，加入15ml四氫呋喃(THF)攪拌溶解，將1.583L叔丁基二甲基硅氯烷(即TBSCl，2N)溶于8ml四氫呋喃中，0℃下緩慢滴加至反應TLC檢測原料反應完全，用5ml蒸餾水焠滅，乙酸乙酯萃取，將有機相用無水Na2SO4干燥，過濾，濃縮，用石油醚-乙酸乙酯體積比50:1進行硅膠柱層析分離產物得到無色油狀物1.295g，其為第二中間體化合物A2，收率為60.2％。3、制備第三中間體A3取640mg第一中間體A1(1N)于50ml圓底燒瓶中，加入20ml無水二氯甲烷(DCM)攪拌溶解，分別加入1.031g第二中間體A2(1.2N)、46.26mg4-二甲氨基吡啶(即DMAP，0.2N)和437.43mg碳化二亞胺(即EDCI，1.2N)，室溫下反應，TLC檢測反應進度，至反應結束，濃縮溶液，用石油醚-乙酸乙酯體積比100:1進行硅膠柱層析分離產物，淡黃色油狀物788.71mg，其為第三中間體A3，收率為47.2％。4、目標化合物A4取780mg第三中間體A3(1N)于50ml圓底燒瓶中，氮氣保護，加入10ml四氫呋喃(THF)攪拌溶解，緩慢滴加1.028ml四丁基氟化銨(TBAF)，室溫下反應，TLC檢測反應進度，至反應結束，用10ml蒸餾水焠滅，飽和NaCl洗脫，乙酸乙酯萃取，將有機相用無水Na2SO4干燥，過濾，濃縮，用石油醚-乙酸乙酯體積比1.5:1進行硅膠柱層析分離產物，得到淡黃色油狀物241.02mg，其為目標化合物A4，即莪術醇衍生物，收率為30.9％。試驗一：質量濃度線性關系1、色譜條件ACQUITYUPLC:emoji:BEHC18色譜柱(2.1×100mm，1.7μm)；流動相：甲醇-水＝70％-30％；流速：0.2mL·min-1；PDA(光電二極管矩陣)檢測器，Empower3工作站，自動進樣；柱溫：30℃；樣品溫度：10℃；檢測波長：210nm；進樣量10μL。2、標準曲線的制備稱取莪術醇衍生物10.37mg置于50mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，冷卻到室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到質量濃度為0.2074mg·mL-1的貯備液。量取0.05，0.5，1，2，3，4，5mL母液，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到質量濃度分別為0.001037，0.01037，0.02074，0.04148，0.06222，0.08296，0.1037mg·mL-1的標準系列溶液，分別吸取各標準系列溶液10μL注入UPLC，記錄峰面積。以對照品溶液的峰面積(Y)對質量濃度(X，mg·mL-1)進行線性回歸，回歸方程為：Y＝7803261.0272X+3322.3851，R＝0.9996，表明莪術醇衍生物在0.001037～0.1037mg·mL-1范圍內峰面積與質量濃度線性關系良好。試驗二：溶解度的測定量取蒸餾水2mL加入具塞離心管中，加入過量的莪術醇衍生物，置于恒溫水浴搖床中，37℃下振搖72h，達到萃取平衡，10000r·min-1離心10min，靜止后，精密吸取上清液100μL用甲醇稀釋至2mL上清液，采用UPLC法測定莪術醇衍生物在蒸餾水中的濃度，進樣，記錄峰面積。按照外標法以峰面積計算莪術醇衍生物在蒸餾水中的濃度。據報道，莪術醇在蒸餾水中的溶解度僅為0.3％，由結果可知，本發明提供的莪術醇衍生物在37℃下，水中的溶解度為0.04360mg·mL-1，明顯提高了莪術醇的水溶性。試驗三：表觀油水分配系數的測定稱取1.5mg莪術醇衍生物置于5mL量瓶中，用經水飽和的正辛醇溶解并定容，制成約0.3mg·mL-1的溶液。精密量取該溶液200μL置于具塞離心管中，加入經正辛醇飽和的水1.8mL，于37℃下振搖72h，是萃取達到平衡，10000r·min-1離心10min，靜置后，精密吸取油相100μL用甲醇稀釋至2mL，采用UPLC法測定萃取前后油相中的莪術醇衍生物的濃度，并計算表觀油水分配系數。藥物能穿過脂質膜的條件是：-1<logPapp<2，由結果可知，本發明提供的莪術醇衍生物在37℃下，純水中的表觀油水分配系數logPapp為1.250，具有很好的脂溶性。試驗四：穩定性考察測定莪術醇衍生物分別在溫度40℃、相對濕度75％及光照4000±500LX條件下的含量變化，結果表明莪術醇衍生物在5天內穩定性良好。試驗五：莪術醇衍生物納米粒子的性能研究1、莪術醇衍生物納米粒子的制備稱量莪術醇衍生物5mg，并溶解于0.2mL甲醇中，待完全溶解后，在超生的條件下，將莪術醇衍生物的甲醇溶液用注射器緩慢注入5mL的去離子水中，通過超生波的作用乳化，形成水包油乳液，于通風櫥內常壓下攪拌至完全除去有機溶劑，冷凍干燥，4℃保存。2、莪術醇衍生物納米粒子的體外釋放特性研究在透析袋中加入1mL莪術醇衍生物納米乳，扎緊，分為兩組，一組投入50mLPBS釋放介質，另一組投入50mL純水釋放介質，37℃體外培養，定時取樣1mL，并補充等體積釋放介質。UPLC分別檢測各時間點的峰面積，在由上述“標準曲線”公式計算藥物質量濃度，計算累計釋放率。體外釋放累積釋放率計算公式如下：式中：CRP(CumulativeReleasePercentage)—莪術醇衍生物納米粒子的累計釋放率；Ve—釋放介質(PBS，pH＝7.4)的置換體積，Ve＝1mL；V0—釋放介質的體積，V0＝50mL；Ci—第i次置換取樣時釋放液中莪術醇衍生物納米粒子的濃度(mg·mL-1)；MPTX—納米粒子中莪術醇衍生物的質量(mg)；n：取樣次數。得到莪術醇衍生物納米粒子的體外釋放曲線圖，如圖1所示，莪術醇衍生物納米粒子PBS中明顯高于水中的累積釋放率。這一試驗結果證明莪術醇衍生物納米粒子具有持續釋放的特性。3、透射電子顯微鏡觀察莪術醇衍生物納米粒子如圖2所示，通過透射電子顯微鏡觀察，莪術醇衍生物的納米粒子呈圓球狀結構，粒徑在200nm左右。并在不同時間點測室溫與4℃下其粒徑，結果表明，其形態穩定，無明顯變化。4、莪術醇衍生物納米粒子粒度的測定如圖3所示，通過ZetasizerNanoZS型粒度儀測定莪術醇衍生物納米粒子粒徑為162.6±2.12多分散系數PDI為:0.182，Zeta電位為：-24.6mv。試驗六：莪術醇衍生物及其納米粒子的藥代動力學研究1、莪術醇衍生物標準溶液的制備稱取2.5mg莪術醇衍生物，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，其質量濃度為25mg·L-1的儲備液。量取1mL其儲備液用甲醇定容至25mL容量瓶，搖勻，得質量濃度為1mg·L-1，將該對照品溶液用甲醇進行一系列稀釋得到質量濃度分別為0.5，1，2，4，8，16，32，64，128μg·L-1；稱取2mg五味子甲素，置于100mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得質量濃度為20mg·L-1的儲備液。量取1mL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得質量濃度為2mg·L-1的五味子甲素溶液。再將其溶液稀釋得質量濃度為200μg·L-1的內標溶液。將所配置溶液置于4℃冰箱保存。2、莪術醇衍生物納米粒子藥液的給藥方法Wistar雄性大鼠6只，禁食不禁水12h，按照10mg·kg-1的劑量，灌胃給予莪術醇衍生物納米粒子藥液，為實驗組。于灌胃后15min，30min，1h，2h，3h，6h，9h，12h，24h眼眶后靜脈叢取血0.5mL，置預先肝素化的1.5mL離心管中，3000r·min-1，離心10min，吸取上層血漿，置于-20℃冰箱保存，測定前37℃水浴解凍。3、莪術醇衍生物藥液的給藥方法Wistar雄性大鼠6只，禁食不禁水12h，按照10mg·kg-1的劑量，灌胃給予莪術醇衍生物藥液，為對照組。于灌胃后15min，30min，1h，2h，3h，6h，9h，12h，24h眼眶后靜脈叢取血0.5mL，置預先肝素化的1.5mL離心管中，3000r·min-1，離心10min，吸取上層血漿，置于-20℃冰箱保存，測定前37℃水浴解凍。4、血漿樣品處理量取大鼠血漿樣品100μL置于2.5mL具塞離心管中，加100μL內標溶液(200μg·L-1的五味子甲素溶液)及300μL甲醇，渦旋混合2min沉淀蛋白，8000r·min-1離心10min。取上清液于另一具塞離心管中，35℃氮氣吹干，殘渣用100μL甲醇復溶，過0.22μm的微孔濾膜過濾，進UPLC分析。5、色譜條件ACQUITYUPLC:emoji:BEHC18色譜柱(2.1×50mm，1.7μm)；流動相：乙腈-水＝55％-45％；流速：0.2mL·min-1；PDA(光電二極管矩陣)檢測器，Empower3工作站，自動進樣；柱溫：30℃；樣品溫度：10℃；檢測波長：210nm；進樣量10μL。6、工作曲線制備取大鼠空白血漿200μL，加入100μL內標溶液，分別加入100μL不同質量濃度的對照品溶液(0.5，1，2，4，8，16，32，64，128μg·L-1)振搖混合，按上述“血漿樣品處理”操作，建立標準曲線，以待測物質量濃度為橫坐標，待測物與內標物的色譜峰面積比值為縱坐標，線性回歸方程為Y＝0.0078X-0.0002，R＝0.9979，在0.5～128μg·L-1線性關系良好，最低檢測線為0.5μg·L-1。7、方法專屬性考察取空白大鼠血漿100μL，不加入內標溶液，按上述“血漿樣品處理”操作，獲得空白血漿樣品色譜圖；加入100μL內標溶液(200μg·L-1的五味子甲素溶液)于100μL空白大鼠血漿中，按上述“血漿樣品處理”操作，獲得含內標的色譜圖；加入100μL莪術醇衍生物對照品溶液(質量濃度為1mg·L-1)于100μL空白大鼠血漿中，按上述“血漿樣品處理”操作，獲得含樣品的色譜圖；分別加入100μL內標溶液與100μL莪術醇衍生物對照品溶液于100μL空白大鼠血漿中，按上述“血漿樣品處理”操作，獲得相應的色譜圖，見圖4。其中，圖4a為空白血漿的UPLC色譜圖，圖4b為空白血漿+莪術醇衍生物的UPLC色譜圖，圖4c為空白血漿+內標的UPLC色譜圖，圖4d為空白血漿+莪術醇衍生物+內標的UPLC色譜圖，圖4e為大鼠灌胃以10mg·kg-1的Cur-NS藥液后2h的血漿樣品的UPLC色譜圖。結果表明內標與檢測樣品不受血漿中的內源性物質的影響。8、精密度和準確度試驗取100μL空白大鼠血漿，加入高、中、低質量濃度(40，20，10μg·L-1)的對照品溶液按上述“血漿樣品處理“操作，每個質量濃度的樣品分別進樣6次分析，連續測定3天，采用UPLC進行測定莪術醇衍生物的準確度與精密度。結果表明莪術醇衍生物的準確度與精密度良好。見表1。表1莪術醇衍生物血藥濃度測定的準確度與精密度(n＝6)9、回收率試驗取100μL空白大鼠血漿，加入高、中、低質量濃度(40，20，10μg·L-1)的對照品溶液按上述“血漿樣品處理”操作，同時另取100μL空白大鼠血漿，按照“血漿樣品處理”操作，再加入高、中、低質量濃度(40，20，10μg·L-1)的對照品溶液，對每個質量濃度樣品進行3樣本分析，獲得相應色譜峰面積，計算其回收率。結果表明莪術醇衍生物的血漿藥物濃度在40，20，10μg·L-1時的回收率分別為95.73，92.87，96.51，回收率良好。見表2表2莪術醇衍生物血藥濃度測定的回收率質量濃度/μg·L-1回收率％RSD％4095.73±2.652.772092.87±1.221.311096.51±3.003.1110、穩定性考察取100μL空白大鼠血漿，加入高、中、低質量濃度(40，20，10μg·L-1)的對照品溶液按上述“血漿樣品處理”操作，每個質量濃度的樣品分別進樣3次分析，分別將血漿樣品放置室溫3h，-20℃放置30d，將反復凍融3次的血漿樣品放置2h進UPLC分析其穩定性。結果表明，莪術醇衍生物的血漿樣品，在室溫下放置5h，-20℃放置30d，經歷3次反復凍融的血漿樣品放置2h后穩定性，結果表明莪術醇衍生物的血漿樣品分別在放置室溫3h，-20℃放置30d，將反復凍融3次的血漿樣品放置2h后穩定。見表3。表3大鼠血漿中莪術醇衍生物在不同貯存條件下的穩定性11、藥動學參數的測定測得大鼠灌胃以10mg·kg-1的劑量給藥量繪制平均血藥濃度-時間曲線(圖5)。利用Winonlin6.3藥動學程序對實驗所得血藥濃度-時間數據進行處理，即得Cur-NS(莪術醇衍生物納米粒子)與Cur(莪術醇衍生物)藥動學參數(表4)。表4Cur-NS與Cur在大鼠體內的藥動學參數大鼠體內藥代動力學實驗結果表明：口服給藥Cur-NS后，藥-時曲線下的AUC(0-t)的面積為273.9621μg·h·L-1，是Cur原料藥的4.67倍，且Cmax也明顯增高，說明口服給藥Cur-NS與Cur原料藥相比，Cur-NS明顯提高了藥物的口服生物利用度，促進了藥物的吸收。試驗七：莪術醇及其衍生物的生物學活性研究體外抗腫瘤活性測試活性測試MTT法對數生長期細胞培養于96孔培養板內，每孔100μL(含5000～6000個腫瘤細胞：Helacell和HepG2cell)，置37℃，5％CO2溫箱中培養。次日，給藥組加入含有不同濃度的化合物，每種細胞設4～5個劑量組，每組至少設三個平行孔。對照組加入與給藥組等體積的溶劑。置37℃，5％CO2溫箱中培養。48h后棄培養液，每孔加20μL5mg/mLMTT溶液(培養基配制)。37℃孵育4h，棄上清液，每孔加入DMSO150μL溶解甲簪顆粒，輕度振蕩溶解。用酶標儀，在參考波長450nm，檢測波長570nm條件下測定光密度值(OD)，以溶劑對照處理的細胞為對照組，用下面公式計算藥物對細胞的抑制率，并計算抑制率，根據計算得到的各濃度的抑制率通過Logit方法計算得到半數抑制濃度(IC50)，重復測試3次，取平均值為最終結果。如圖6所示，結果顯示在HepG2cell(A)和Helacell(B)上，莪術醇衍生物均表現出優于莪術醇的抗腫瘤活性。由此可見，本發明以莪術醇與甘油為原料，保留莪術醇的結構骨架，對莪術醇8位上的羥基基團進行修飾，合成了新型的具有抗癌、抗菌、抗病毒等作用的莪術醇衍生物，合成方法簡便，產物純度高。與莪術醇比較而言，本發明提供的莪術醇衍生物具有以下優點：1、較好的水溶性與脂溶性；2、穩定性高；3、優于莪術醇的抗腫瘤活性。進一步地，與本發明合成的莪術醇衍生物相比較而言，本發明提供的莪術醇衍生物納米粒子具有以下優點：1、持續釋放的特性；2、生物利用度高。所屬領域的普通技術人員應當理解：以上任何實施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權利要求)被限于這些例子；在本發明的思路下，以上實施例或者不同實施例中的技術特征之間也可以進行組合，并存在如上所述的本發明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細節中提供。因此，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何省略、修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3