CD19?CAR基因序列在惡性B細胞腫瘤中的應用的制作方法

本發明屬于惡性腫瘤的生物治療技術領域，具體涉及一種CD19-CAR基因序列及利用該序列在惡性B細胞腫瘤治療中的應用。

背景技術：

腫瘤生物免疫治療是繼外科手術、化療和放療以后腫瘤治療的第四種手段。嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細胞技術（CAR-T細胞技術）是近年來獲得重大突破的腫瘤生物免疫治療新手段。CAR-T細胞技術是將可特異性識別腫瘤抗原的基因工程載體導入人體免疫細胞（如殺傷性CD8+T細胞）中，使該群T細胞編碼出腫瘤特異性抗原，進而識別腫瘤細胞表面的受體靶向殺傷腫瘤細胞。同以往的細胞免疫治療手段相比，CAR-T細胞技術具有如下的優勢：首先，CAR-T細胞對抗原的識別不依賴抗原加工和HLA分子的抗原呈遞，免疫逃逸的腫瘤細胞往往具有低表達HLA的和蛋白酶體抗原加工的特點，也能被CAR-T細胞識別，因此CAR-T細胞對腫瘤細胞具有更好的靶向性和殺傷性；第二，CAR-T細胞不僅能識別細胞表面的蛋白，也能識別細胞表面的碳鏈和糖鏈等空間結構，具有更廣泛地識別腫瘤細胞的特點；第三，在CAR-T細胞表面除了特異性抗體的表達還有共刺激分子的表達，共刺激分子的表達以及細胞因子的加入都能有效地促進T細胞的存活和活力，在臨床上更大限度地提高了免疫治療的持久性。目前一系列動物試驗和臨床試驗都證明了CAR-T細胞對血液腫瘤和實體瘤治療的有效性和安全性，CAR-T細胞在腫瘤的臨床治療中具有巨大的應用潛力和發展前景，是未來治愈腫瘤的利器。

B細胞惡性腫瘤主要包括多種類型的白血病和淋巴瘤，目前除了少數接受異體造血干細胞移植的病人，大多數成年慢性淋巴細胞白血病和套淋巴細胞瘤患者無法被目前臨床上常用的治療手段治愈，因此新的治療方法尤其是生物免疫治療的開發對于B 細胞惡性腫瘤極其重要。

技術實現要素：

本發明目的一是提供一種翻譯后可特異性識別B細胞表面CD19分子的CD19-CAR基因序列；二是利用嵌合抗原受體T細胞技術（CAR-T細胞技術）可將CD19-CAR基因序列嵌合進入抗原受體T細胞用于B細胞惡性腫瘤的治療。

本發明所采取的技術方案如下。

一種可特異性識別B細胞表面CD19分子的CD19-CAR基因序列，由CD19基因的scFv片段和由CD28和CD3 zeta片段組成的信號結構域構成，共1635個堿基，其堿基序列如SEQ ID NO.1所示。

利用所述可特異性識別B細胞表面CD19分子的CD19-CAR基因序列，可構建CD19-CAR-BTC載體。

所述CD19-CAR-BTC載體的制備方法，包括以下步驟：

（1）PCR擴增CD19-CAR基因序列；

PCR擴增時，引物序列設計如下：

正向引物序列為：5’-GGACTAGTGCCACC ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGC-3’；

反向引物序列為：5’-CGGAATTCGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTG-3’；

以攜帶有CD19-CAR基因序列的pUC-CD19質粒為模板進行PCR擴增；

（2）將步驟（1）中擴增后的CD19-CAR基因序列與載體質粒pSin-EF2-Pur雙酶切；

（3）將步驟（2）中雙酶切產物進行連接構建CD19-CAR-BTC載體。

所述CD19-CAR-BTC載體在B細胞惡性腫瘤中的應用，應用時，其具體應用步驟如下所述：

（1）T細胞培養和改造，采集B細胞惡性腫瘤病人外周血，分離其T細胞，利用T高效培養技術，在體外快速增值T細胞；

（2）利用慢病毒載體轉染技術，將CD19-CAR-BTC載體轉染構建嵌合抗原受體T細胞；

（3）將步驟（2）構建的抗原受體T細胞輸入B細胞惡性腫瘤病人血液，達到治愈B細胞惡性腫瘤病人的目的。

由于CD19分子只在B細胞表面表達，在B細胞系以外的正常細胞中不表達，因而在治療B淋巴細胞淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤等惡性腫瘤中是較好的特異性識別抗原分子。

本發明設計構建了表達后可特異性識別B細胞惡性腫瘤表面CD19分子的CD19-CAR基因序列，利用CD19-CAR基因序列所構建CD19-CAR-BTC載體，在轉染T細胞后，可特異性的識別B細胞惡性腫瘤相關細胞并使其凋亡，從而達到治愈目的。

為驗證本發明所提供的CD19-CAR基因序列的技術效果，發明人利用CAR-T細胞技術特異性的改造T細胞，與傳統CIK細胞的免疫過繼治療的技術效果進行進一步的對比，結果顯示在所有的效靶比條件下，與CD19-CAR T細胞共培養的Raji細胞的死亡比率高，證明CD19-CAR T細胞對Raji細胞的殺傷作用比CIK強，具有有效力強、特異度高的特點，因而具有較好的推廣應用價值。

附圖說明

圖1為特異性識別B細胞表面CD19分子的CD19-CAR基因序列結構示意圖；

圖2為流式細胞儀檢測對轉染效率的檢測結果；其中左上圖為進入細胞儀中細胞總數，右上圖為檢測結果，下圖為檢測判定數據；

圖3為CD19-CAR T細胞對于Raji細胞的細胞毒性與傳統CIK細胞殺傷效果比較（共培養4小時）。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步的解釋說明。

實施例1

如圖1所示，本發明所提供的可特異性識別B細胞表面CD19分子的CD19-CAR基因序列，由靶向CD19的抗體基因的scFv片段和由CD28和CD3 zeta片段組成的信號結構域構成，共1635個堿基，其序列如序列表（SEQ ID NO.1）所示。

該序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成提供；具體使用前，該序列已由序列合成提供商將該序列與質粒構建pUC-CD19連接提供。

實施例2

根據實施例1所提供的CD19-CAR基因序列，構建CD19-CAR-BTC載體，具體包括以下步驟。

（1）PCR擴增CD19-CAR基因序列

首先，設計PCR擴增用引物序列如下：

正向引物序列為：5’-GGACTAGTGCCACC ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGC-3’；

反向引物序列為：5’-CGGAATTCGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTG-3’；

以攜帶有CD19-CAR基因序列的pUC-CD19質粒為模板，50μL的PCR反應體系設計如下：

正向引物，0.75μL（濃度：10μmol/mL）；

反向引物，0.75μL（濃度：10μmol/mL）；

PrimeSTAR Max Premix（寶生物工程（大連）有限公司），25μL；

攜帶CD19-CAR基因序列的pUC-CD19質粒模板，1.5μL（500ng/μL）；

ddH₂O，22μL；

反應程序：94℃ 預變性 3min；98℃、10s，55℃、5s，72℃、10s，35個循環；4℃延伸 10min。

對PCR擴增產物進行電泳，并回收擴增產物，備用。

（2）將步驟（1）中擴增后的CD19-CAR基因序列與載體質粒pSin-EF2-Pur分別進行雙酶切；

20μL雙酶切體系設計如下：

10X M Buffer（寶生物工程（大連）有限公司），2μL；

Spe I酶（寶生物工程（大連）有限公司），1μL；

EcoR I酶（寶生物工程（大連）有限公司），1μL；

步驟（1）中擴增的CD-19 CAR序列（或pSin-EF2-Pur質粒(Addgene)），1μg；

ddH₂O，補充至20μL；

37℃酶切2h。

酶切結束后，瓊脂糖凝膠電泳分離條帶，凝膠回收試劑盒（MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit，寶生物工程（大連）有限公司）分別回收酶切后的CD19-CAR序列和線性pSin-EF2-Pur質粒。

（3）酶切產物的連接

將步驟（2）中所回收酶切產物進行連接，10μL連接體系設計如下：

DNA 混合物（步驟（2）中回收產物，摩爾比，pSin-EF2-Pur︰CD19-CAR=1︰5），5μL；

Solution I（寶生物工程（大連）有限公司），5μL；

4℃連接過夜。

（4）陽性克隆的篩選

在步驟（3）中連接產物中加入1微升Solution II（寶生物工程（大連）有限公司），然后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；

將轉化后菌株在含氨芐青霉素（1mg/100mL）的瓊脂糖培養基中37℃培養16h，以進行抗性篩選；

挑選陽性克隆菌株進行PCR鑒定和雙酶切鑒定（酶切體系及PCR鑒定參考前述內容即可），對鑒定正確的菌株進一步進行測序鑒定，對測序鑒定正確的菌株進一步培養后，即可提取質粒備用，所提取質粒即為攜帶有CD19-CAR序列的重組的CD19-CAR-BTC載體。

實施例3

為檢驗實施例2中所制得的CD19-CAR-BTC載體在B細胞惡性腫瘤治療中的具體應用效果，發明人進一步的做了體外試驗，簡要介紹如下。

（1）T細胞的采集

采集某身體健康志愿者（鄭大一附院提供）10mL外周血，1500轉/min、離心10 min（亦可根據情況：1500~2000 轉/min，離心7~10 min），棄上清；

PBS緩沖液沖洗一次，棄上清；

將沉淀細胞用30 mL PBS緩沖液重懸細胞后置于15mL淋巴細胞分離液上，進行密度梯度離心，收集單個核細胞并用PBS緩沖液沖洗三次備用。

（2）T細胞的轉染

首先，將用于包裝生產病毒的輔助細胞293T細胞(ATCC細胞庫）按照85%融合度（亦可根據情況選擇80~90%融合度）接種在6孔板中，無抗生素DMEM+10%FBS培養基，37℃過夜培養；

其次，用Lipofectamin 2000轉染試劑（Invitrogen公司）將2μg實施例2中所制備的 CD19-CAR-BTC載體+1.5μg psPAX2（Intrivogen公司）+1.5μg pMD2.G（Intrivogen公司）轉入293T細胞中，轉染48小時；

第三，轉染結束后，用0.45μm濾膜（Millopore公司）過濾細胞懸液，在細胞培養上清中按照每4mL細胞上清加入1mL PEG6000的比例加入PEG6000，重復混勻，4℃放置2天， 8000轉/分鐘離心30分鐘，收集病毒沉淀；

第四，將步驟（1）所采集的濃度為2×10⁵/mL懸浮T細胞接種到6孔板中，加入聚凝胺（polybrene，Sigma公司）至濃度為6 μg/mL，同時加入上述第三步驟中所制備的病毒沉淀，病毒沉淀用量為100μL滴度為10⁶的病毒溶液，充分混勻，37℃孵育培養感染。

感染48小時后，通過流式細胞儀（BD公司FASCanto流式細胞儀）檢測GFP熒光以確定轉染效率。其原理主要是用帶熒光標記的CD19分子作為誘餌篩選細胞表面已經表達抗CD19抗體分子的T細胞（成功轉染了CD19-CAR載體的T細胞才會在細胞表面表達抗CD19的抗體），計算公式為：

轉染效率=有熒光標記的細胞數目/進入流式細胞儀的細胞總數。

檢測結果如圖2所示。對圖2進行分析可知：圖2左上圖中P1相所示的細胞為進入流式細胞儀的活細胞總數，對P1中的細胞按照結合的CD19分子熒光進行進一步篩選，Q4相中所示細胞為被CD19分子標記的成功轉染了CD19-CAR載體的T細胞，流式細胞儀數據分析顯示Q4細胞所占活細胞總數的比率為51.2%，即轉染效率為51.2%。

第五，將轉染了CD19-CAR-BTC載體的T細胞與腫瘤細胞中淋巴瘤細胞的Raji細胞系、Ramos細胞系和K562細胞系(細胞系均來自于ATCC細胞庫）分別按照0.5：1、2：1和10：1的體積比例（體積比設計原則為，以效靶比相同為設計原則）混合培養48小時（37℃、10%二氧化碳條件下細胞培養箱中培養）；同時設置GFP對照（GFP對照是指在構建CD19-CAR-BTC載體時，以GFP替代CD19-CAR序列插入質粒pSin-EF2-Pur中所構建GFP-BTC載體）。

以流式細胞儀，對不同細胞系中腫瘤細胞的凋亡比率進行檢測，具體檢測結果見下表：

。

從上表數據可以看出，CD19-CAR-BTC轉染后T細胞對CD19陽性的B細胞具有較好的選擇性。具體而言，轉染了CAR-CD19-BTC載體的T細胞相比只轉染了GFP對照的T細胞對CD19陽性細胞Raji和Ramos的殺傷能力明顯增高（凋亡比率升高）；而在CD19陰性的K562細胞中，CAR-CD19-BTC細胞對K562的殺傷能力和對照細胞沒有明顯區別。因而從上述數據可以說明，本發明所提供的CD19-CAR基因序列、CD19-CAR-BTC載體在B細胞惡性腫瘤治療方面是有較好的應用前景的。

現有技術中，利用嵌合抗原受體T細胞技術（CAR-T細胞技術）治療B細胞惡性腫瘤所遵循的一般步驟為：

（1）T細胞培養和改造，采集B細胞惡性腫瘤病人外周血，分離其T細胞，利用T高效培養技術，在體外快速增值T細胞；

（2）利用慢病毒載體轉染技術，將相應的病毒載體轉染構建嵌合抗原受體T細胞；

（3）將步驟（2）構建的抗原受體T細胞輸入B細胞惡性腫瘤病人血液，達到治愈B細胞惡性腫瘤病人的目的。

參考現有技術方法檢測CD19-CAR T細胞對淋巴瘤的殺傷作用，以傳統的CIK細胞做為對照，將CD19-CAR T細胞和傳統的CIK細胞分別按照相同的比例（100：1， 50：1， 10：1， 5：1）與淋巴瘤細胞系Raji細胞共同培養48小時（37℃、10%二氧化碳條件下細胞培養箱中培養），應用LDH細胞毒性檢測試劑盒檢測Raji細胞被殺傷過程中產生的標志物乳酸脫氫酶的活性，比較CD-19 CAR T細胞和CIK細胞對Raji細胞系的殺傷效果，實驗結果如圖3所示。

圖3中，橫坐標為轉染了CD19-CAR-BTC載體的T細胞或者傳統的CIK細胞與淋巴瘤Raji細胞的比例（效靶比），縱坐標表示被殺傷的Raji細胞的比例（毒性率）。當效靶比為100：1時，約38%的Raji細胞被傳統CIK殺死，約62%的Raji細胞被CD19-CAR T細胞殺死，被CD19-CAR T細胞殺死的Raji細胞的比率明顯高于被傳統CIK殺死的Raji細胞的比率。同樣在效靶比為50：1， 10：1和5：1時，被CD19-CAR T細胞殺死的Raji細胞的比率都高于被傳統CIK殺死的Raji細胞的比率。該結果證明CD19-CAR T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用優于傳統的CIK細胞。本發明所提供的CD19-CAR基因序列具有效力強、特異度高的特點，具有更好的應用價值。

SEQUENCE LISTING

<110> 鄭州大學第一附屬醫院

<120> CD19-CAR基因序列在惡性B細胞腫瘤中的應用

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1635

<212> DNA

<213> CD19-CAR

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggaggtga aactgcagga gtcaggacct ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc 120

gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag 180

cctccacgaa agggtctgga gtggctggga gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat 240

aattcagctc tcaaatccag actgaccatc atcaaggaca actccaagag ccaagttttc 300

ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac acagccattt actactgtgc caaacattat 360

tactacggtg gtagctatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420

tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgga catccagatg 480

acacagacta catcctccct gtctgcctct ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg 540

gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt 600

aaactcctga tctaccatac atcaagatta cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc 660

agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc attagcaacc tggagcaaga agatattgcc 720

acttactttt gccaacaggg taatacgctt ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg 780

gaaataacac gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtaataag 840

cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 900

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 960

ctggacttcg cctgcaaaat tgaagttatg tatcctcctc cttacctaga caatgagaag 1020

agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc 1080

ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 1140

ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 1200

cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1260

ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1320

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1380

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1440

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1500

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1560

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1620

gccctgcccc ctcgc 1635