一種豬蓋他病毒毒株、疫苗組合物及其制備方法和應用與流程

本發明涉及一種豬蓋他病毒毒株，還涉及由所述豬蓋他病毒毒株制備的滅活疫苗組合物及其制備方法，屬于豬蓋他病毒毒株的分離和應用領域。
背景技術：
：蓋他病毒(Getahvirus，GETV)是一種以蚊蟲為主要傳播媒介的蟲媒病毒，在自然宿主中主要表現為無癥狀或高滴度病毒血癥，但通過蚊蟲傳播給易感動物后則可引起病毒病流行。該病毒最初于1955年從馬來西亞的雪背庫蚊中分離獲得。此后，在日本、前蘇聯的東部、東南亞和澳大利亞等地，從三帶吻庫蚊，刺憂伊蚊和豬的血液中也分離到了蓋他病毒。自本病受到關注后，在歐洲、亞洲、大洋洲一些國家的豬、馬、牛、山羊、犬、兔、袋鼠、雞和部分野鳥體內都檢測到蓋他病毒抗體的存在，并且在部分人的血液中也檢測到了蓋他病毒抗體，因此被視為一種人畜共患病，但對人造成的影響暫無具體報道。該病主要侵害馬和豬，可引起仔豬的發熱、腹瀉、精神不振、身體發抖、后肢麻痹、體表發紅、死亡及妊娠母豬的流產、死產等臨床癥狀；馬感染該病毒后的主要臨床表現為精神沉郁、不食、全身淋巴結腫大淤血、急性發熱、后肢伴有蕁麻疹和腫脹等。2014年該病在日本賽馬中的暴發及危害再度引發了人們的關注，且該病的致病機理及防控措施等有待進一步研究。且本病尚無有效地治療藥物，疫苗免疫接種是預防和控制該病的根本措施。我國對蓋他病毒的研究較晚，雖然已經從蚊子中分離到一些蓋他病毒毒株，但迄今為止尚未從豬體內分離到該病毒，其對豬群的致病性及危害更是不得而知。本發明在我國的發病豬體內分離到一株蓋他病毒，為后續的相關試驗研究提供了材料、奠定了基礎。此外，目前市場上的蓋他病毒疫苗屈指可數，主要為日本于1979年獲批的用于馬的滅活疫苗、日本于1990年報道的用于豬的弱毒活疫苗、日本于1993年報道的蓋他—乙腦—細小三聯弱毒活疫苗及日本于1997年報道的用于馬的蓋他—乙腦二聯滅活疫苗。但日本近兩年分離到的毒株與之前的毒株相比有了一定的變異，進化樹中屬于不同分支，因此這些疫苗是否對新流行的蓋他病毒有很好的防控作用仍不得而知。從以上疫苗可以看出，大部分蓋他疫苗主要用于馬，并且主要為弱毒活疫苗，存在一定的毒力返強風險，況且所用毒株至少為20年前的毒株，與近幾年檢測到的毒株相比存在一定的變異，并不一定對現流行的毒株有很好的保護力，因此尚缺乏一種新的安全、高效的蓋他病毒滅活疫苗，尤其是豬用滅活疫苗。技術實現要素：本發明目的之一是提供一株新分離的豬蓋他病毒毒株。本發明的另一目的是針對現有蓋他病毒疫苗的不足，提供一種安全有效的豬用蓋他病毒滅活疫苗以及該滅活疫苗的制備方法；該滅活疫苗安全性及免疫原性好，攻毒保護率強；所采用的制備方法簡單安全。本發明采用的技術方案如下：本發明首先公開了一株分離的豬蓋他病毒HNJZ-S1株。該豬蓋他病毒HNJZ-S1株，已提交專利認可的機構進行保藏，其微生物保藏編號為CGMCCNO.12550；分類命名：披蓋病毒科甲病毒屬蓋他病毒HNJZ-S1；拉丁文學名：Togaviridae，Alphavirus,SwineGethavirus(SGETV)；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱：CGMCC，保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所，保藏日期：2016年6月2日。本發明采集豬流產胎兒的內臟，取1g樣品，剪碎后加入約5倍體積的無菌PBS緩沖液，用勻漿器研磨至勻漿狀，反復凍融3次，8000r/min離心5min后取上清，按照RNAisoPlus提取試劑的說明書提取病料總RNA，并進行RT-PCR擴增。將RT-PCR檢測為陽性的病料勻漿，經10000r/min離心15min后取上清，上清依次用0.45μm、0.22μm的濾膜過濾，得到濾液。取1mL濾液接種于已鋪滿T25培養瓶瓶底80％-90％的Marc-145細胞，37℃，5％CO2培養箱孵育1h后棄去培養液；加6mL含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素的DMEM培養基，37℃，5％CO2培養，24h即可出現細胞變圓變大的細胞病變特征，培養48h-60h后收獲病毒。并在Marc-145細胞上連續傳至第5代。培養過程中同時設立不接毒的細胞培養物作為陰性對照。傳代過程中，利用GETV特異性引物PF/PR，定性檢測有病變的Marc-145細胞中的SGETV。將豬蓋他病毒HNJZ-S1株傳至第6代，并對第5代病毒進行了病毒滴度TCID50的測定，結果為107.25TCID50/mL。通過理化特性測定、電鏡觀察病毒的形態、分子生物學研究等方法證實分離的病毒為豬蓋他病毒。將豬蓋他病毒HNJZ-S1株接種至懷孕早期母鼠，母鼠出現流產、產死胎及木乃伊胎、產仔量下降等癥狀，表明該毒株對妊娠早期小鼠具有很強的致病性。本發明豬蓋他病毒HNJZ-S1株能夠用于制備預防由豬蓋他病毒所致疾病的疫苗，還能夠用于制備豬蓋他病毒相關的診斷試劑和治療藥物。本發明還公開了一種疫苗組合物，該疫苗組合物含有經滅活的豬蓋他病毒HNJZ-S1株和藥學上可接受的佐劑，其中，所述豬蓋他病毒HNJZ-S1株的微生物保藏號為：CGMCCNO.12550。進一步地，上述疫苗組合物還包括藥學上可接受的載體。本發明還公開了一種疫苗組合物的制備方法，該制備方法包括以下步驟：(1)病毒培養：將豬蓋他病毒HNJZ-S1株接種至Marc-145細胞進行培養，獲得病毒液，其中，所述豬蓋他病毒HNJZ-S1株的微生物保藏號為：CGMCCNO.12550；(2)病毒液滅活：向病毒液中加入滅活劑，將病毒滅活，得到滅活的病毒液；(3)制備水相：按w/v計，向滅活的病毒液中加入吐溫-80至終濃度為4％，混合均勻，得到水相；(4)制備油相：將注射用白油和司本-80按照體積比92:6混合，得到混合液，然后，按w/v計，向混合液中加入硬脂酸鋁至終濃度為2％，得到油相；(5)乳化：按體積比2:1將油相和水相進行混合并乳化，即得疫苗組合物。根據上述的疫苗組合的制備方法，其中，步驟(1)的具體過程為：用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素的DMEM培養基，37℃，5％CO2培養箱貼壁培養Marc-145細胞；待細胞生長覆蓋率達到80％-90％時棄去培養液，按感染復數為0.1接種豬蓋他病毒HNJZ-S1株，然后用含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素的DMEM培養基，37℃，5％CO2培養箱培養，培養48h-60h待細胞病變完全后收獲病毒液。根據上述的疫苗組合的制備方法，步驟(2)中所述滅活劑為甲醛或二乙烯亞胺。根據上述的疫苗組合的制備方法，步驟(2)中所述的滅活劑為甲醛時，按體積比計，病毒液中甲醛的終濃度為0.2％；滅活條件為：37℃滅活24h，期間每隔2h振搖一次；滅活后向病毒液中加入硫代硫酸鈉溶液中和甲醛，按w/v計，所加入的硫代硫酸鈉溶液的終濃度為0.2％。根據上述的疫苗組合的制備方法，步驟(2)中所述的滅活劑為二乙烯亞胺時，按體積比計，病毒液中二乙烯亞胺的終濃度為0.1％；滅活條件為：32℃滅活24h，期間每隔2h振搖一次；滅活后向病毒液中加入硫代硫酸鈉溶液中和二乙烯亞胺，按w/v計，所加入的硫代硫酸鈉溶液的終濃度為2％。本發明的積極有益效果:(1)本發明分離的豬蓋他病毒HNJZ-S1株是中國首例從自然感染發病豬群中分離得到的豬源蓋他病毒，具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產毒株及檢驗用毒種，為后續的相關試驗研究提供了材料、奠定了基礎。(2)本發明的疫苗組合物有良好的免疫原性，免疫后可產生較強免疫力，攻毒保護率強，接種后母豬流產率及死產率明顯減少，仔豬發病率也顯著降低；此外，與國外市場上現有的弱毒活疫苗相比安全性更好，保存、運輸及使用更方便，且所用毒株為近年來剛分離到的毒株，同早期毒株相比，與近年來流行的毒株親緣關系更近，具備了與同類產品競爭的優勢，能有效地預防豬蓋他病毒的流行和傳播，降低本病造成的經濟損失，有著廣闊的應用前景。(3)本發明疫苗組合物所采用的制備方法簡單安全。附圖說明圖1為組織病料中SGETV的RT-PCR擴增結果，其中，泳道1-病料中SGETV的RT-PCR產物；泳道2-陰性對照；泳道M-DNAMarkerDL2000；圖2為各代次Marc-145細胞培養物中SGETV的RT-PCR擴增結果，其中，泳道1-6表示各代次Marc-145細胞培養物中SGETV的RT-PCR產物；泳道7表示陰性對照；泳道M表示DNAMarkerDL2000；圖3為感染SGETV的Marc-145細胞的照片(200×)，其中，A.SGETV感染的Marc-145細胞；B.正常的Marc-145細胞對照；圖4為豬蓋他病毒HNJZ-S1株細胞培養物透射電鏡照片；圖5為小鼠致病性試驗圖，A.攻毒組母鼠所產木乃伊胎；B.對照組母鼠所產胎兒；圖6為豬蓋他病毒HNJZ-S1株全基因擴增結果，泳道M表示DNAMarkerDL2000；泳道1-12表示豬蓋他病毒HNJZ-S1株各片段擴增結果；圖7為豬蓋他病毒HNJZ-S1株與各參考株全基因組核苷酸序列相似性和同源性分析；圖8豬蓋他病毒HNJZ-S1株與各參考株全基因組核苷酸序列的系統進化樹；圖9豬群注射滅活疫苗或乳化的DMEM后各組豬平均體溫隨時間變化情況；圖10豬群注射滅活疫苗或乳化的DMEM后各組豬抗體水平隨時間的變化情況(平均HI值)。具體實施方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明。本實施例中試驗動物是小鼠和豬，是本發明實驗室前期階段試驗動物，不對本發明最終應用有任何限制。在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍。若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規市售試劑，所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。本發明采用豬蓋他病毒HNJZ-S1株制備疫苗，該毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO.12550。實施例1：豬蓋他病毒HNJZ-S1株的分離鑒定和生物學特性研究1.1實驗材料實驗中所用的病料樣本來源于河南焦作豬場流產胎兒樣品，于2016年1月采集；Marc-145單克隆細胞株由本實驗室凍存；雌雄昆明小鼠購自河南省實驗動物中心。1.2引物設計參照GenBank中發表的GETVHB0234(EU015062)基因序列，使用Premier5設計了1對特異性引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所述特異性引物的核苷酸序列如下：PF：5’-AACCCACCCGTGCGCTTGT-3’(SEQIDNO.1)；PR：5’-CGCCGTTGTTGTCTGATTGAGG-3’(SEQIDNO.2)。1.3組織病料中GETVRNA的RT-PCR檢測采集豬流產胎兒的內臟，取1g樣品，剪碎后加入約5倍體積的無菌PBS緩沖液，用勻漿器研磨至勻漿狀，反復凍融3次，8000r/min離心5min后取上清，按照RNAisoPlus提取試劑的說明書提取病料總RNA；以提取的RNA為模板，進行RT-PCR擴增。反轉錄反應體系(20μL)：RNA模板13μL、5×buffer4μL、dNTP(10mmol/μL)1μL、隨機引物random1μL(20pmol/μL)、RNA酶抑制劑(40U/μL)0.5μL、反轉錄酶M-MLV(200U/μL)0.5μL。反轉錄反應條件：42℃1h，95℃5min。以反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增反應體系(50μL)為：2×EsTaqMasterMix25μL、上下游引物各1μL(20pmol/μL)、cDNA模板5μL，補加滅菌雙蒸水至50μL。PCR擴增反應條件為：94℃預變性5min，94℃50s，60℃30s，72℃1min，35個循環；最后72℃延伸10min。取10μLPCR擴增產物用1％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(結果見圖1)。剩余勻漿-80℃保存備用。由圖1可知，擴增出了一條894bp左右的條帶，與預期擴增片段大小相符。1.4病毒的分離與培養將RT-PCR檢測為陽性的病料勻漿，離心、無菌過濾后將濾液接種至Marc-145細胞并進行傳代。具體操作為：將RT-PCR檢測為陽性的病料勻漿，經10000r/min離心15min后取上清，上清依次用0.45μm和0.22μm的濾膜過濾，得到濾液；取1mL濾液接種于已鋪滿T25培養瓶瓶底80％-90％的Marc-145細胞，37℃，5％CO2培養箱孵育1h后棄去培養液；然后加入6mL含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素的DMEM培養基，37℃，5％CO2培養，培養24h即可出現細胞變圓變大的細胞病變特征，培養48h-60h后收獲病毒。在Marc-145細胞上連續傳至第5代。培養過程中同時設立不接毒的細胞培養物作為陰性對照。傳代過程中，利用GETV特異性引物PF/PR，定性檢測有病變的Marc-145細胞中的SGETV。經觀察發現，在傳代培養的過程中，從第2代起各代次均出現明顯的細胞病變，表現為細胞變圓、變大、出現空斑，利用GETV特異性引物PF/PR對細胞毒RNA進行RT-PCR擴增，均能檢測出GETV特異性目的片段(見圖2)，而未接種的Marc-145細胞空白對照擴增結果為陰性。病毒接種第2代后細胞病變穩定，接種24h即出現病變，細胞變圓，變大，脫落(見圖3)。接種48h后細胞脫落可達80％以上。表明病毒已適應Marc-145細胞并能在Marc-145細胞上穩定增殖。將分離的SGETV命名為豬蓋他病毒HNJZ-S1。1.5病毒滴度TCID50的測定將消化吹散的Marc-145細胞懸液接種到96孔板中，每孔200μL，培養24h后，取豬蓋他病毒HNJZ-S1株的第5代細胞培養物以連續倍比稀釋101-1010，每孔接種100μL，并設立不接豬蓋他病毒HNJZ-S1株的空白對照，37℃，5％CO2培養箱孵育1h后，每孔加100μL含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素的DMEM培養基，37℃，5％CO2培養，每個稀釋度各做8個重復，逐日觀察細胞病變情況，并按照Reed-Muench法計算病毒滴度TCID50，最終測得病毒滴度TCID50為107.25。1.6豬蓋他病毒HNJZ-S1株理化特性研究取7只滅菌的EP管，在超凈工作臺內分別加入500μL豬蓋他病毒HNJZ-S1株第5代細胞培養液。第1管(耐氯仿試驗)加入終濃度為4.8％的分析純氯仿混合振蕩，置于4℃作用30min，隨后500rpm/min離心5min，吸取上層液體；第2管(耐酸試驗)用0.1mol/L的鹽酸調PH至3.0，于37℃水浴作用1h，再用0.1mol/L的NaOH溶液將PH調回至7.2；第3管(耐熱試驗)置于60℃水浴鍋中作用1h；第4管(耐甲醛試驗)加入體積比1％的分析純甲醛混合振蕩，37℃作用2d，2000rpm離心20min，吸取下層液體；第5管(耐胰酶試驗)加入等體積的胰蛋白酶置37℃水浴作用1.5h后，用4mL滅活胎牛血清終止其作用；第6管(紫外敏感試驗)紫外照射30min；第7管不處理作為正常對照。然后將7管處理后的豬蓋他病毒HNJZ-S1株細胞培養液分別接種至Marc-145傳代細胞，按常規法測定其TCID50，其結果見表1。從表1可以看出，分離得到的豬蓋他病毒HNJZ-S1株對氯仿敏感，屬于有囊膜病毒；對酸敏感；甲醛、紫外線和60℃加熱，均可在短時間內使病毒滅活；對胰酶有抵抗力。這些理化特性均符合蓋他病毒的理化特性。表1豬蓋他病毒HNJZ-S1株理化特性的檢測結果處理方法實驗組TCID50/mL對照組TCID50/mL對數差值耐氯仿試驗100.75107.256.5耐酸試驗100107.257.25耐熱試驗101.1107.256.15耐甲醛試驗101.25107.256耐胰酶試驗105.75107.251.5紫外敏感試驗101.5107.255.751.7豬蓋他病毒HNJZ-S1株形態學觀察取20mL豬蓋他病毒HNJZ-S1株第6代細胞培養物反復凍融后于4℃、8000r/min離心1h，取上清；將上清于4℃、30000r/min離心2h，棄上清，收集沉淀；用10mLpH7.2的0.01mol/LPBS緩沖液重懸沉淀，然后于4℃、8000r/min離心1h，取上清；將上清于4℃、30000r/min離心2h，棄上清收集沉淀；然后再用20μLpH7.2的0.01mol/LPBS緩沖液重懸沉淀，得到重懸液。取10μL重懸液滴于帶支持膜的銅網上，3-5min后用濾紙從銅網邊緣吸去液體，稍干后用10μL2％磷鎢酸染色2min，再用濾紙吸去染色液，待完全干燥后置于透射電鏡下觀察并拍照。經透射電鏡下觀察，可在視野內看到大小均一、近似圓形的病毒粒子(圖4)，大小約60-70nm，有囊膜，表面有纖突；與已報道的GETV形態基本吻合，而且視野內未見其他形態的病毒粒子。1.8豬蓋他病毒HNJZ-S1株感染小鼠試驗將公母鼠合籠交配5-7天進行檢查，如母鼠奶頭周圍的毛外翻，奶頭顯露，說明已經懷孕。將懷孕母鼠挑出，分試驗組和對照組兩組，每組5只。試驗組接種豬蓋他病毒HNJZ-S1株第5代細胞培養物，接種量為500μL/只，肌肉注射；對照組肌肉注射等體積的DMEM。接種后逐日觀察母鼠的發病情況。對懷孕母鼠攻毒后，實驗組母鼠出現流產、死產、木乃伊胎、產仔數下降等臨床表現，而對照組母豬產仔正常(圖5)，說明此毒株對妊娠小鼠有很強的致病性，并推測其極可能是引起病料來源豬場懷孕母豬繁殖障礙的重要病原。實施例2豬蓋他病毒HNJZ-S1株全基因組的克隆與序列分析2.1引物設計參照GenBank中發表的GETVHB0234(EU015062)基因序列，使用Premier5設計了12對特異性引物(其核苷酸序列見表2)；并根據RACE試劑盒說明書針對5’UTR設計了3條引物(其核苷酸序列見表3)，包括1條反轉錄引物，1條內引物及1條外引物；對3’UTR設計了1條內引物及1條外引物(其核苷酸序列見表3)，引物由上海生物工程有限公司合成。2.2豬蓋他病毒HNJZ-S1株RNA的提取及全基因組的擴增將收獲的SGETV細胞培養物，反復凍融3次以裂解細胞，8000r/min離心5min后取上清，按照RNAisoPlus提取試劑的說明書提取病料總RNA，并進行RT-PCR擴增。反轉錄體系(20μL)：RNA模板13μL、5×buffer4μL、dNTP(10mmol/μL)1μL、隨機引物random1μL(20pmol/μL)、RNA酶抑制劑(40U/μL)0.5μL、反轉錄酶M-MLV(200U/μL)0.5μL。反轉錄反應條件：42℃1h，95℃5min。以反轉錄得到的cDNA為模板，用針對非編碼區設計的引物擴增非編碼區，用針對編碼區設計的12對引物分別進行編碼區的PCR擴增。非編碼區擴增按試劑盒操作進行。編碼區PCR反應體系(50μL)：2×EsTaqMasterMix25μL、上下游引物各1μL(20pmol/μL)、cDNA模板5μL，補加滅菌雙蒸水至50μL。編碼區PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃30s，退火，72℃延伸70s，35個循環；最后72℃延伸10min，循環過程中，退火溫度根據不同引物的不同標準進行。取5μLPCR產物用1％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果見圖6。由圖6可知，擴增片段經過瓊脂糖凝膠電泳檢測，均出現與預期長度相符的條帶，由此說明設計的引物可成功將各片段擴增出來。2.3豬蓋他病毒全基因組的克隆和重組質粒的PCR鑒定將上述用不同引物擴增出的各片段的產物進行回收純化，并連接到pMD18-T克隆載體上，然后將連接產物進行轉化，提取重組質粒，并對重組質粒進行PCR鑒定。表2SGETV基因組編碼區序列擴增引物表3SGETV基因組非編碼區序列擴增引物2.4豬蓋他病毒全基因組的序列測定對PCR鑒定為陽性的各重組質粒進行測序，序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。然后用DNAMAN軟件對豬蓋他病毒HNJZ-S1株全基因序列進行序列拼接，得到全長為11689bp的豬蓋他病毒HNJZ-S1株的全基因組序列(不包括5’端帽子結構和3’端的多聚核苷酸尾)，如SEQIDNo.34所示。GETV基因組具有典型的甲病毒屬基因組結構，分為2個獨立的開放閱讀框架(ORF)，HNJZ-S1株5’端的7404個核苷酸編碼4種非結構蛋白nsP1、nsP2、nsP3、nsP4，3’端的3762個核苷酸編碼5種結構蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白，兩者之間有44個核苷酸為不翻譯的連接區。5’端起始的78個核苷酸和3’端402個核苷酸為非編碼區。2.5豬蓋他病毒HNJZ-S1株全基因組序列相似性和同源性分析用DNAStar軟件將豬蓋他病毒HNJZ-S1株的全基因組序列與從GenBank上下載的12株GETV(該12株GETV均為GenBank上收錄的典型毒株，見表4)全基因組序列進行比對分析。經過對比發現，豬蓋他病毒HNJZ-S1株與這12株參考毒株之間核苷酸序列相似性均較高，介于97.6％-99.3％，其中與韓國株SouthKorea相似性最高(99.3％)，而與俄羅斯株LEIV16275Maq相似性最低(97.6％)，詳見圖7。由上述結果可知，豬蓋他病毒HNJZ-S1株與各參照毒株具有同源性，屬于蓋他病毒。2.6豬蓋他病毒HNJZ-S1株全基因組系統發育進化關系分析利用軟件MEGA6.05繪制GETV全基因組進化樹(圖8)，從圖8進化樹可以看出，豬蓋他病毒HNJZ-S1株與日本株14-I-605-C1、14-I-605-C2及中國株HB0234親緣關系最近，在同一進化分支內；與中國株SC1210、YN0540及韓國株SouthKorea分屬同一大的進化分支，遺傳關系次之；而與日本株MI-110-C1、MI-110-C2、Kochi/01/2005，蒙古株LEIV17741MPR，中國株M1及俄羅斯株LEIV16275Maq分屬不同進化分支，親緣關系較遠。這說明豬蓋他病毒HNJZ-S1株與國內及鄰近國家日本、韓國的毒株親緣關系較近，對于了解和分析我國GETV的起源及流行情況具有重要參考價值。表412株GETV參考毒株登錄號毒株名稱來源地理長度(bp)登錄號SouthKorea豬韓國11597AY702913HB0234蚊中國11686EU01506214-I-605-C2馬日本11690LC07908914-I-605-C1馬日本11689LC079088YN0540蚊中國11690EU015063SC1210蚊中國11690LC107870MI-110-C1馬日本11690LC079086MI-110-C2馬日本11689LC079087LEIV17741MPR蚊蒙古11689EF631999M1蚊中國11696EU015061Kochi/01/2005豬日本11690AB859822LEIV16275Maq蚊俄羅斯11689EF631998實施例3豬蓋他病毒滅活疫苗的制備3.1病毒培養用pH值7.2的含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素的DMEM培養基，37℃，5％CO2培養箱貼壁培養Marc-145細胞；待細胞生長覆蓋率達到80％-90％時棄去培養液，按感染復數為0.1接種豬蓋他病毒HNJZ-S1株第4代細胞傳代株，然后用含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素的DMEM培養基，37℃，5％CO2培養箱培養，培養48h-60h待細胞病變完全后收獲病毒液于-80℃和室溫反復凍融三次，10000×g離心10分鐘，去掉細胞碎片，得取上清，得到豬蓋他病毒液，凍存于-80℃。3.2病毒液的滅活及滅活檢驗在病毒含量合格的病毒液中(優選TCID50≥107/mL)加入甲醛，使甲醛的終濃度達到0.2％(體積濃度)，于37℃作用24h，其間每隔2h搖勻一次；滅活后向病毒液中加入硫代硫酸鈉溶液用來中和甲醛，其中，按w/v計，所加入的硫代硫酸鈉溶液的終濃度為0.2％，充分混勻，獲得滅活的病毒液。將滅活后的病毒液用病毒維持液做10倍稀釋，接種Marc-145細胞(6孔板)，每孔接種500μL，同時設立陰性對照孔(采用病毒維持液作為陰性對照)，37℃、5％CO2溫箱內孵育1h后棄去培養液，補加2mL維持液，37℃、5％CO2溫箱培養，觀察細胞病變，盲傳三代，未出現細胞病變，表明滅活完全。3.3制備含豬蓋他病毒HNJZ-S1株的疫苗組合物(1)制備水相：按w/v計，向滅活后的病毒液中加入吐溫-80，使得吐溫-80終濃度為4％，混合均勻，得到水相；(2)制備油相：將注射用白油和司本-80按照體積比92:6混合，得到混合液，然后，按w/v計，向混合液中后加入硬脂酸鋁至終濃度為2％，得到油相。(3)乳化：按照體積比2:1將油相和水相進行混合并乳化，即得疫苗組合物。乳化質量能夠達到國家規定的質量標準。實施例4豬蓋他病毒滅活疫苗的安全性試驗按照實施例3制備的豬蓋他病毒滅活疫苗的方法制備3批疫苗，3批疫苗分別做安全性試驗。試驗方法：取GETV抗體陰性的2-3個月齡豬、配種后一周內妊娠母豬各10頭。按照表5所示分組情況，隨機選取2-3個月齡豬5頭、妊娠母豬5頭，于頸部肌肉注射2頭份(2mL)；其余10頭，各注射1頭份(1mL)。疫苗從三個批次中各隨機選擇10頭份。免疫前測量體溫，免疫后7d每天測定體溫；免疫后連續14d觀察豬群采食情況，并觸摸注射部位局部有無腫塊。表5滅活疫苗安全性試驗動物分組及免疫情況免疫后豬群體溫沒有出現升高的現象(圖9)，而且豬群采食和精神正常。單倍劑量和雙倍劑量疫苗注射后，經14d觀察均未見注射部位有腫塊出現。試驗結果證明，本發明的滅活疫苗安全性良好。實施例5豬蓋他病毒滅活疫苗的免疫原性試驗5.1試驗方法HI抗體效價測定：試驗共選用GETV抗體陰性的2-3個月齡豬10頭及配種后一周內的妊娠母豬10頭，試驗按表6中所設計進行分組，組B1、B2均頸部肌肉注射1mL滅活疫苗(1頭份，含107TCID50)；組B3、B4為對照組，均頸部肌肉注射乳化后的DMEM培養基1mL。分別于免疫前及免疫后1、2、3、4周采血，測定HI抗體效價。攻毒保護試驗：試驗共選取GETV抗體陰性的1-2個月齡豬10頭、后備母豬10頭及配種前免疫豬蓋他病毒滅活疫苗且抗體陽性的母豬所產3日齡吃初乳和未吃初乳的胎兒各10頭。試驗按表7中所設計的分組、免疫及攻毒方案進行。其中，DMEM為乳化后的DMEM，免疫及攻毒途徑均為頸部肌肉注射。攻毒后連續觀察記錄仔豬的發病及死亡情況，并觀察記錄母豬產仔情況。表6HI抗體效價測定試驗動物分組及免疫情況表7攻毒保護試驗動物分組、免疫及攻毒情況測定HI抗體效價后對數據進行整理，結果見表8及圖10。由表8可知，試驗組(B1、B2)免疫1周后開始出現特異性抗體，2周后HI抗體效價基本達到免疫要求，3-4周仍呈增加趨勢，4周內個別豬HI抗體效價最高可達1:256，對照組(B3、B4)HI抗體效價＜10。圖10可反映出抗體水平的變化趨勢，并可明顯看出，隨著試驗天數增加，免疫組HI抗體效價逐漸高于未免疫組。試驗結果證明該滅活疫苗能很好地使豬群產生抗體應答反應。但考慮到疫苗臨床使用時的復雜情況，為保證疫苗實際使用的免疫保護效果，確定疫苗效力檢驗時，檢驗標準為免疫21日后，其血清HI抗體效價不低于1:64。表8滅活疫苗HI抗體效價測定結果攻毒后連續觀察記錄仔豬的發病及死亡情況，結果見表9。由表9可知，經免疫后的仔豬(組C2)在3-4月齡攻毒后保護率可達100％，而未免疫組(組C5)無保護率。吃經免疫后的母豬初乳的3日齡仔豬(組C1)攻毒后保護率也可達100％，而未吃經免疫后的母豬初乳的3日齡仔豬(組C4)無保護率。待母豬產仔時，觀察并記錄母豬產仔情況，結果見表10。由表10可知，未免疫的母豬(組C6)在配種一周內攻毒后發生流產、死產、木乃伊胎、弱仔等臨床表現，而配種前免疫的母豬(組C3)攻毒后均能正常產仔，保護率可達100％。綜合試驗結果證明，豬蓋他病毒滅活疫苗能很好的為豬群提供保護，免疫原性良好。表9滅活疫苗攻毒保護試驗結果(一)表10滅活疫苗攻毒保護試驗結果(二)SEQUENCELISTING<110>河南農業大學<120>一種豬蓋他病毒毒株、疫苗組合物及其制備方法和應用<130>1<160>34<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>1aacccacccgtgcgcttgt19<210>2<211>22<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>2cgccgttgttgtctgattgagg22<210>3<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>3gctgatagcccattcctt18<210>4<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>4cgtcctaccgttcaccac18<210>5<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>5atgcgaaggttatgtggt18<210>6<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>6aaaggtggattgattaggtc20<210>7<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>7tgaataccgacgaggaaa18<210>8<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>8caagaacttgcaccagaca19<210>9<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>9gaggaatggcaagaagaa18<210>10<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>10aaagttagaaaacagcagga20<210>11<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>11cagagtcagcgagatggt18<210>12<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>12aatggaaaggaggagcac18<210>13<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>13acgccgattcgtctacgc18<210>14<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>14gggccatctgcatctttgc19<210>15<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>15tcgtaaggtcgctactgaa19<210>16<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>16tgatttgtggttggtggt18<210>17<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>17cgcttatctggacttggt18<210>18<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>18agtacggtggtttctcaca19<210>19<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>19gaggtcagacccgctaat18<210>20<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>20catgggtgtactttgaagc19<210>21<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>21gaaatcgagcaagtatgacc20<210>22<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>22cacgttgccactaccaca18<210>23<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>23cgcagcagtcaggtaatg18<210>24<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>24tgattgaggttcccgtag18<210>25<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>25tatgcaagcacgaccatg18<210>26<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>26tgcgttttgttactattcagg21<210>27<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>27tggttgcaggcacataggtac21<210>28<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>28ccgctagtgcctcgaacatg20<210>29<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>29ccatgacgtcttgtaggtccgtt23<210>30<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>30atggcaagataaccctgcatt21<210>31<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>31tgacatgggtgcagcgggtagccg24<210>32<211>22<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>32gaccacgcgtatcgatgtcgac22<210>33<211>38<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>33gaccacgcgtatcgatgtcgactttttttttttttttt38<210>34<211>11689<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>34atggcggacgtgtgacatcaccgttcgctctttctaggatcctttgctactccacatagt60gagagacaaacaacccaaatgaaggtaaccgtggacgttgaggctgatagcccattcctt120aaggcccttcagaaggcgtttcccgcctttgaggttgaatcacagcaggtcacaccgaat180gaccatgctaacgctagagcattttcgcatctggctactaaactgattgagcaagaggtt240ccaacaggcgtcaccatcctggacgtgggtagtgcacccgcaaggaggttgatgtctgac300cacacctaccactgcatctgccccatgaaaagtgcggaagacccagagaggctggcgaat360tacgctcggaagctggcgaaagcatcggggactgtgctagacaagaatgt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