一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES?89及培養方法和應用與流程

本發明屬于植物病害生物防治技術領域，具體涉及一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)菌株ES-89，同時還涉及一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89的培養方法，還涉及一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89的用途。

背景技術：

黃連是一種常用的中藥材，在我國川鄂湘黔山地、川西南山區、川滇藏南山地、秦巴山地等地區多有種植。黃連藥用價值高，已報道在抗癌和降血糖等方面具有較好療效，引起了人們廣泛關注。隨著國際社會對天然藥物開發熱度不斷增加，尤其是日本對黃連解毒湯的深入研究和大量應用，我國黃連種植以及出口量逐年增加。近年來，病害問題是影響黃連生產的重要制約因素；在湖北省恩施市調查發現，黃連葉斑病(病原菌為耬斗菜莖點霉Phoma aquilegiicola)發生普遍，一般田塊發病率在10～30％之間，發生嚴重時達到100％，嚴重影響黃連產量，給藥農帶來了巨大的經濟損失。

目前黃連葉斑病的防治主要以化學防治為主，由于長期不合理使用化學農藥，給生態環境和人類健康帶來了不可忽視的危害；另一方面病原菌對常用化學藥劑的抗藥性逐漸增強，使得防效不斷下降。而生物防治因具有對環境、生態和人類健康安全等優點，得到了人們的廣泛重視并已成為研究熱點。我們前期從來自湖北恩施的黃連根際土壤中分離得到一株有抗真菌活性的生防菌伯克霍爾德氏菌ES-89，該菌株對多種植物病原真菌具有較好防效，尤其是對黃連葉斑病防效最好。自20世紀80年代末以來，已有幾株伯克霍爾德氏屬生防菌遞交到美國環保署(EPA)相繼登記作為生物農藥使用，但在國內還未見伯克霍爾德氏菌防治黃連病害的報道。

技術實現要素：

本發明的目的是在于提供了一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89，該菌株的發酵產物能使黃連葉斑病菌菌絲發生畸變，且有效的抑制了菌絲生長，從而達到了大田中防治黃連葉斑病的目的。該菌株已于2016年11月23日送至中國典型培養物保藏中心保藏，分類命名：Burkholderia sp.ES-89；保藏編號：CCTCC NO：M 2016665；地址：中國武漢武漢大學。

本發明的另一個目的是在于提供了一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89的培養方法，通過該菌制備的生防菌劑含有伯克霍爾德氏菌ES-89或含有伯克霍爾德氏菌ES-89發酵液經過濾后得到的無菌濾液，所述的無菌濾液使用伯克霍爾德氏菌ES-89發酵液經過離心取得的上清液再經過細菌過濾器過濾獲得。方法易行，操作簡便，且生產中沒有用到有機溶劑，降低了生產過程中以及產品使用中的污染，也不會產生溶劑的中毒。

本發明還有一個目的是在于提供了一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89在制備治療或植物病原真菌引起的植物病害藥物中的應用。該植物病原真菌為黃連葉斑病病原菌耬斗菜莖點霉(Phoma aquilegiicola)，具有很好的防治效果。

為了達到上述的目的，本發明采用以下技術措施：

一種伯克霍爾德氏菌菌株ES-89，通過以下方式獲得：本發明所用微生物是在湖北省恩施州太山廟黃連GAP種植基地的黃連根際土壤中分離、篩選得到的一株對黃連葉斑病具有較強防治效果的菌株，通過形態學和分子生物學的鑒定，鑒定為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)，申請人將其命名為ES-89，該菌株已于2016年11月23日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保存中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO：M 2016665。

伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)ES-89菌體的菌學特征：伯克霍爾德氏菌ES-89在營養瓊脂(NA)培養基上菌落為乳白色，邊緣整齊，近圓形，表面光滑隆起，不透明，呈油狀，隨著培養時間的增長，菌體培養物較粘稠。細胞橢圓形至圓形，0.5-0.6×1-2μm，革蘭氏染色反應為紅色，為革蘭氏陰性細菌。

一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89的培養方法，其步驟如下：

A、將ES-89菌種1ml接種到100ml營養肉湯(NB)培養液中活化22－26h；

B、將步驟(A)中活化的ES-89菌種1ml接種到含有100ml營養肉湯(NB)培養液的250ml三角瓶中，26－30℃、160rpm、振蕩培養46－50h；

C、將步驟(B)中搖培后獲得的發酵液置于4℃條件下、8000rpm離心18－22min，細菌過濾器(0.22μm)過濾上層發酵液，得到無菌的發酵上清液；

D、用無菌水將菌體洗滌2－4次，制成其菌體懸液。將發酵液、發酵上清液、菌體懸液置于4℃條件下保存，備用；

所述的營養肉湯(NB)培養液組分和配方為：牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，蔗糖10g，補充蒸餾水至1000ml，調pH至7.2-7.4，在121℃高壓蒸汽滅菌30min。

營養瓊脂(NA)培養基組分及配方為：牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，蔗糖10g，加入瓊脂15-20g，補充蒸餾水至1000ml，調pH至7.2-7.4，在121℃高壓蒸汽滅菌28－32min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基組分及配方為：土豆200g，葡萄糖20g，加入瓊脂15-20g，補充蒸餾水至1000ml，自然pH，在121℃高壓蒸汽滅菌30min。

一種伯克霍爾德氏菌菌株ES-89，該菌株含有其序列為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本發明制備的伯克霍爾德氏菌ES-89菌株的保藏：將伯克霍爾德氏菌的菌體保存在25％的甘油中，-20℃冷凍保藏。

一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89在制備治療或預防植物病原真菌藥物中的應用，包括利用該菌株作為主要成分制備成防治黃連葉斑病的藥物，所述的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89特別適用于防治黃連葉斑病病原菌耬斗菜莖點霉的藥物中的應用。其步驟是：

A、一種伯克霍爾德氏菌菌株ES-89與黃連葉斑病病原菌平板對峙試驗；

B、一種伯克霍爾德氏菌菌株ES-89發酵產物對黃連葉斑病菌菌絲生長的抑制作用和菌絲結構的影響；

C、一種伯克霍爾德氏菌菌株ES-89發酵產物對黃連葉斑病室內離體防治效果的研究；

D、一種伯克霍爾德氏菌菌株ES-89發酵產物對黃連葉斑病盆栽防治效果的研究。

所述的植物病原真菌具體為黃連葉斑病菌(Phoma aquilegiicola)、葡萄潰瘍病病菌(Botryosphaeria dothidea)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、崗梅炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum)。

本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果：

1、伯克霍爾德氏菌ES-89是從黃連根系土壤中分離到的生防菌株，對黃連葉斑病防效較好，而使用伯克霍爾德氏菌ES-89的發酵產物處理黃連植株可達到環保、安全、高效的目的。

2、目前，還未見到黃連病害生物防治藥劑的相關報道，本發明中的伯克霍爾德氏菌ES-89可為黃連病害生防藥劑生產提供菌株資源。

3、平板對峙實驗中發現伯克霍爾德氏菌ES-89對黃連葉斑病菌的抑菌帶平均寬度達到1.9cm，平均抑菌率在68％以上；ES-89不同濃度發酵產物均能夠抑制黃連葉斑病菌菌絲生長，且隨著濃度的增加抑制率逐漸加強，在含10％(V/V)發酵上清液的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板上，其抑制百分率達到52％以上；當發酵上清液與PDA體積比在25％時，其抑制百分率已達到95％以上。

4、離體葉片試驗表明，ES-89發酵液處理后，病斑平均大小為僅為0.32cm，相對于對照組的1.5-2.1cm病斑大小，其抑制率達到了80％以上。

5、盆栽防治實驗表明，伯克霍爾德氏菌發酵液處理的黃連葉片病情較輕，其發病率僅為12.5％，平均病情指數為3.1，防治效果達到88％以上。

6、本發明使用的伯克霍爾德氏菌是一種防治黃連葉斑病效果很好的生防菌株，可用于植物病原菌的生物防治；具有綠色安全、環境兼容性好、生產成本低等特點。

7、本發明利用伯克霍爾德氏菌ES-89菌株的發酵液直接防治黃連葉斑病，生產以及適用都十分簡單，生產中沒有用到有機溶劑，降低了生產過程中以及產品使用中的污染，也不會產生溶劑的中毒，具有很廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1為一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89的菌落形態。

圖2為一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89的菌體顯微形態。

圖3為一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89的rDNA-ITS區擴增序列電泳圖。

圖4為一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89對黃連葉斑病病原菌的拮抗作用和對照。

其中：圖4A顯示了ES-89在PDA培養基上對黃連葉斑病菌的拮抗作用，圖4B是對照(未接種生防菌株ES-89)。

圖5為一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89發酵產物對黃連葉斑病菌菌絲生長的影響(柱狀圖)。

圖6為一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89發酵產物對黃連葉斑病菌菌絲生長抑制作用。

其中：6A是對照，6B是發酵產物濃度為5％的抑制結果，6C是發酵產物濃度為15％的抑制結果，6D是發酵產物濃度為25％的抑制結果。

圖7為一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89發酵產物對黃連葉斑病菌菌絲結構的影響40倍鏡下的結果圖。

其中：圖7A、7B顯示含有ES-89發酵產物的PDA培養基上黃連葉斑病菌菌絲的顯微形態，圖7C是對照(不含ES-89發酵產物的PDA培養基)。

圖8為一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89發酵液對黃連葉斑病的抑制作用。

其中：8A是對照(未經ES-89發酵液處理，無菌水處理)，8B、8C顯示了ES-89發酵液對黃連葉斑病的抑制作用。

圖9為一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89發酵液對黃連葉斑病的盆栽防效。其中：9A是陰性對照(未經ES-89發酵液處理，無菌水處理)，9B是經ES-89發酵液處理的黃連發病情況，9C是陽性對照(10％苯醚甲環唑1500倍液處理)。

具體實施方式

本發明所述技術方案，如未作特別說明，均為本領域的常規技術。

實施例1：伯克霍爾德氏菌菌株ES-89的篩選

菌株的篩選：

(1)樣品的采集：本實驗土壤采自中國湖北省恩施州太山廟黃連GAP種植基地，采用五點取樣法進行取樣，取樣的深度在黃連根際周圍以及地下15或17或19或20cm，每點取樣200或240或260或280或300g,然后將樣品裝入滅菌的封口袋中帶回實驗室進行細菌的篩選。

(2)樣品懸液的制備：將采集到土樣研磨(過80目篩)后取5g加入到盛有45ml無菌水的三角瓶中，28℃搖床180rpm充分震蕩20min，然后制成1:10(V/V)的土壤懸浮液。待土粒靜置沉淀后，吸取1ml上清液，移入盛有9ml無菌水的試管中，制成1:100(V/V)濃度的土壤懸液，以此類推，制成1:1000(V/V)、1:10000(V/V)等不同濃度懸液。

(3)細菌的分離：吸取10^-4、10^-5和10^-6梯度的懸浮液各0.2ml在NA(牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，蔗糖10g，加入瓊脂15-20g，蒸餾水1000ml)平板上均勻涂布，培養皿自然風干后在28℃下倒置培養，24h后開始挑取單菌落到新的NA平板上進行純化培養，對全部分離到的待測菌株進行編號，然后對其拮抗活性進行篩選。

(4)生防菌株的篩選：采用傳統的五點對峙平板培養法，檢測上述分離到的各種待測菌株對黃連葉斑病菌的抑菌活性。用6mm打孔器切取25℃培養3天的病原菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板中心，同時在半徑3cm的圓周上等距離接種4個待測菌株，對照為不接種待測菌株。在25℃下培養，逐日觀察記錄，并測量待測菌株與黃連葉斑病菌之間的抑菌帶寬度，作為拮抗活性強弱的指標。經過上述篩選，得到一株對黃連葉斑病具有強烈抑制作用的菌株，編號為ES-89，保存備用。

實施例2：伯克霍爾德氏菌菌株ES-89的鑒定

菌株的鑒定：

申請人從中國湖北省恩施州太山廟黃連GAP種植基地黃連根際土壤中分離、篩選得到一株對黃連葉斑病具有較強防治效果的伯克霍爾德氏菌菌株，申請人將其命名為ES-89。本發明的ES-89菌株的分離和鑒定方法，參照植物病理研究方法(方中達，1998)、伯杰細菌鑒定手冊(第八版)和常見細菌系統鑒定手冊(東秀珠和蔡妙英，2001)等專著中的試驗方法。將ES-89菌株置于NA培養基于28℃過夜培養，采用細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取基因組DNA，采用擴增細菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1494R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGAC TT-3')對其16S rDNA區進行擴增。

ES-89菌株形態鑒定結果：菌落特征如圖1顯示，在NA培養基上培養初期菌落形態光滑，乳白色，菌落不透明，培養48h后，菌落呈現淡黃色，隨著培養時間的延長，菌落變成油漬狀，擴展過程中菌落邊緣融合形成油狀，半膠液體狀；正反顏色相同，與培養基結合不牢固。顯微鏡檢特征圖2顯示，ES-89菌株細胞橢圓形至圓形，0.5-0.6×1-2um；革蘭氏染色反應為紅色，為革蘭氏陰性細菌。

測序獲得1431bp大小的DNA片段(圖3)，序列在NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行BLAST分析，可知其與伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)高度同源，同源性達到100％。該菌株已于2016年11月23日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保存中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO：M 2016665。一種伯克霍爾德氏菌菌株ES-89，該菌株含有其序列為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。平板對峙實驗中發現伯克霍爾德氏菌對黃連葉斑病病原菌的平均抑菌率在68％以上；生防菌株不同濃度發酵產物均能夠抑制黃連葉斑病菌菌絲生長，且隨著濃度的增加抑制率逐漸加強，當在含25％(V/V)發酵上清液的PDA平板上，其抑制百分率已達到95％以上；盆栽防治實驗表明，伯克霍爾德氏菌發酵液處理的黃連葉片病情較輕，其發病率僅為12.5％，平均病情指數為3.1，防治效果達到88％以上；因此伯克霍爾德氏菌是一株防治黃連葉斑病效果很好的生防菌株，可用于植物病原菌的生物防治。并且該菌株具有綠色安全、環境兼容性好、生產成本低等特點，具有很廣闊的應用前景。

實施例3：

一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌ES-89培養方法，其步驟如下：

A、將ES-89菌種1ml接種到100ml NB培養液中活化22或23或24或25或26h；

B、將步驟(A)中活化的ES-89菌種1ml接種到含有100ml NB培養液的250ml三角瓶中，26或27或28或29或30℃、160rpm、振蕩培養46或47或48或49或50h；

C、將步驟(B)中搖培后獲得的發酵液置于4℃條件下、8000rpm離心18或19或20或21或22min，細菌過濾器(0.22um)過濾上層發酵液，得到無菌的發酵上清液；

D、用無菌水將菌體洗滌2或3或4次，制成其菌體懸液。將發酵上清、菌體懸液置于4℃條件下保存備用；

所述的營養肉湯(NB)培養液組分和配方為：牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，蔗糖10g，補充蒸餾水至1000ml，調pH至7.2-7.4，在121℃高壓蒸汽滅菌30min。

營養瓊脂(NA)培養基組分及配方為：牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，蔗糖10g，加入瓊脂15-20g，補充蒸餾水至1000ml，調pH至7.2-7.4，在121℃高壓蒸汽滅菌28－32min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基組分及配方為：土豆200g，葡萄糖20g，加入瓊脂15-20g，補充蒸餾水至1000ml，自然pH，在121℃高壓蒸汽滅菌30min。

本培養方法中所用菌株活化的時間為24h左右，采用振蕩培養時，當菌株培養24h時其生長速率達到最大，活性最強；當菌株培養48h左右時，其生長數量達到峰值，因此此時得到的發酵液效果最好；4℃、8000rpm條件下離心不僅可以最大程度上保持細菌發酵液的活性，還可以更好的分離出菌株的發酵上清液與菌株菌體，便于后續實驗；通過本實驗得到了伯克霍爾德氏菌ES-89的無菌發酵上清液、菌體懸液以及發酵產物，可以更加直接的研究該菌株的發酵機理，進一步明確該菌株的拮抗作用是由發酵上清液中的抗性物質還是菌體中的抑菌物質所決定。

實施例4：ES-89菌株與多種植物病原真菌的平板對峙試驗

用接種環沾取少量ES-89菌株在PDA平板中間劃線，用無菌水代替ES-89發酵液作對照，重復3次，放置超凈工作臺吹干。用內徑6mm的打孔器打取已活化的黃連葉斑病菌(Phoma aquilegiicola)、葡萄潰瘍病病菌(Botryosphaeria dothidea)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、崗梅炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum)菌落邊緣菌絲塊，分別接種于菌株ES-89的兩側，菌絲塊之間的間距為6mm。25℃培養5d后觀察其拮抗作用的大小，并測量其抑菌帶寬度。菌絲生長抑制率(％)＝(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/對照菌落半徑×100％，試驗結果見圖4和表1。

表1ES-89菌株與多種植物病原真菌平板對峙試驗(5d，25℃)

對峙試驗結果如表1所示：伯克霍爾德氏菌ES-89對多種重要的植物病原真菌均有拮抗作用，尤其是對黃連葉斑病病原菌的抑制效果最佳，抑制率達到68％以上，因此ES-89為一株對對植物病原真菌具有強抑制作用的菌株。

實施例5：

ES-89菌株發酵產物對黃連葉斑病菌菌絲生長的抑制作用和菌絲結構的影響

A、將ES-89菌種1ml接種到100ml NB培養液中活化24h，將活化的ES-89菌種1ml接種到含有100ml NB培養液的250ml三角瓶中，28℃，160rpm，振蕩培養48h。搖培后成其發酵液，將發酵液置于4℃條件下，8000rpm離心20min，細菌過濾器(0.22um)過濾上層發酵液，得到無菌的發酵上清液。

B、將發酵上清液按1％、5％、10％、15％、20％、25％加入PDA中倒平板，每個平板上接直徑為6mm的黃連葉斑病菌菌絲塊，每個處理3次重復，3次平行試驗，25℃培養，于5d后測量黃連葉斑病菌的菌落直徑并記錄相關數據，同時挑取菌絲顯微鏡下觀察黃連葉斑病菌菌絲的形態變化。

C、ES-89發酵產物對黃連葉斑病菌菌絲生長的抑制試驗表明(圖5)，ES-89菌株不同濃度發酵產物均能夠抑制黃連葉斑病菌菌絲生長，且隨著濃度的增加抑制率逐漸加強。在含1％、5％、10％、15％、20％、25％(V/V)發酵上清液的PDA平板上，與對照相比，其抑制百分率分別為8％、30％、52％、70％、88％、95％。各處理之間存在顯著差異(P<0.05)。

D、5d時，在顯微鏡下觀察到對照PDA培養基上病原菌菌絲生長旺盛，菌絲著色均勻，形成較致密的菌落，邊緣較為整齊，分支較少；含ES-89發酵產物培養基中黃連葉斑病菌菌絲簇生，且分支較多，菌絲畸形，頂端膨大，菌絲體內細胞質分布不均勻(圖6)。

實施例6：ES-89菌株對黃連葉斑病室內離體防治效果

A、選擇大小一致、無病蟲感染的健康黃連葉片，自來水沖洗干凈后經70％(V/V)酒精表面消毒30s，無菌水沖洗三次，晾干。

B、將ES-89菌種1ml接種到100mlNB中活化24h,將活化的ES-89菌種1ml接種到裝有100ml NB的250ml三角瓶中，28℃，160rpm，振蕩培養48h。搖培后得到其發酵產物，加入1％(V/V)吐溫20。

C、取表面已被酒精消毒的健康的黃連葉片，放在鋪有濕潤吸水紙的瓷盤(35×50cm)中，將ES-89發酵產物均勻噴霧于黃連葉片，自然晾干，以無菌水噴施作為對照，每個處理設10個葉片，3次重復。然后將6mm黃連葉斑病病原菌菌菌絲塊接種到各處理組的黃連葉片上，使用保鮮膜封口保濕，置于25℃恒溫光照培養箱培養，48h后測量病斑大小。試驗結果見圖8和表2。

表2離體條件下ES-89菌株發酵液對黃連葉斑病抑制率(5d，25℃)

離體葉片試驗中，對照組接種黃連葉斑病菌菌絲塊，24h后開始出現小斑點，48h后便形成黑色病斑，之后發病部位開始腐爛，未發病部分呈萎蔫，病斑大小達到1.5-2.1cm的長度。ES-89發酵液處理組病斑平均大小為0.32cm，抑制率達到80.2％。說明ES-89菌株發酵產物對黃連葉斑病的擴展具有很強抑制作用。

實施例7：ES-89菌株對黃連葉斑病盆栽防效試驗

從湖北省恩施州太山廟黃連GAP種植基地移栽健康黃連植株至(30cm×20cm)的塑料盆中。ES-89的無菌發酵上清液獲得方法同實施例3；在PDA培養基上采用機械損傷菌絲法進行誘導產孢，待產孢后每皿加10ml無菌水，配成濃度為1×10⁶個/ml的分生孢子懸浮液(含1％吐溫)。每株均勻噴施20ml的黃連葉斑病菌分生孢子懸浮液，自然風干后噴灑等量的ES-89發酵液、10％(V/V)苯醚甲環唑1500倍液、無菌水。重復試驗3次，25℃培養。試驗處理5d后分別觀察黃連的發病情況，調查發病率及病情指數，計算防治效果。

黃連葉斑病分級標準：

0級：葉片無病斑

1級：病斑面積占整片葉片的25％

2級：病斑面積占整片葉片的25％以上，50％以下

3級：病斑面積占整片葉片50％以上，75％以下

4級：病斑面積占整片葉片75％以上

病情指數＝(各級病葉數×相應的發病級數/總葉數×最高發病級數)×100

防治效果(％)＝(對照組平均病情指數－處理組平均病情指數/對照組平均病情指數)×100％

表3ES-89菌株對黃連葉斑病盆栽防治效果(5d，25℃)

盆栽試驗結果如圖9、表3，接種黃連葉斑病菌24h后，對照組黃連葉片上出現一些小斑點，然后小斑點慢慢擴展為黑色病斑，接種5d后黑色病斑慢慢變成規則或不規則黑褐色大病斑，葉片背面呈現黃褐色。對照化學藥劑10％苯醚甲環唑處理后黃連葉片發病率很低，相對于對照組，ES-89發酵液處理的黃連葉片病情較輕，48h后僅有少量病斑出現，且病斑較小、擴展速度慢發病率僅為12.5％，平均病情指數為3.1，防治效果達到88.5％。說明ES-89發酵液對黃連葉斑病具有較好防治效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 華中農業大學

<120> 一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89及培養方法和應用

<130> 一種防治植物真菌病害的伯克霍爾德氏菌菌株ES-89及培養方法和應用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1336

<212> DNA

<213> 伯克霍爾德氏菌ES-89

<400> 1

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ctgattagct agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga cgatcagtag ctggtctgag 180

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