1.一種檢測牛PCAF基因單核苷酸多態性的RFLP方法,其特征在于:包括以下步驟:
以待測牛全基因組DNA為模板,以引物對P1、P2或P3為引物,PCR擴增牛PCAF基因片段,然后利用限制性內切酶HindIII對根據引物對P1擴增得到的產物S1進行酶切或利用限制性內切酶ApaI對根據引物對P2或P3擴增得到的產物S2或S3進行酶切,再對酶切后的產物片段進行瓊脂糖凝膠電泳,根據凝膠成像系統分析電泳后片段大小,鑒定牛PCAF基因上單核苷酸多態性位點的基因型;
所述引物對P1為:
上游引物F1:5`-GGGTTCCCACTGCACAGGCCAAGCT-3`
下游引物R1:5`-GTCCATCAGACGCCCCCACACAGAG-3`;
所述引物對P2為:
上游引物F2:5`-ACCTTCAAGGCCTTTTACATGCGGG-3`
下游引物R2:5`-TCAAAGAGGAATGGACACAGGCAGA-3`;
所述引物對P3為:
上游引物F3:5`-CTCTTCCCAGTCTCACTTTTGTGGG-3`
下游引物R3:5`-AGGCACACTGTTTGATGAGTTTCTA-3`。
2.如權利要求1所述的檢測牛PCAF基因單核苷酸多態性的RFLP方法,其特征在于:所述PCR擴增的反應體系包括12.5μL的2×Taq PCR MasterMix、50ng牛基因組DNA以及10μmol/L的引物對P1、P2或P3的上、下游引物各0.5μL。
3.如權利要求1所述的檢測牛PCAF基因單核苷酸多態性的RFLP方法,其特征在于:所述PCR擴增的反應程序為:95℃預變性5min;95℃變性30s,退火30s,72℃延伸30s,共43個循環,其中,前18個循環退火溫度自68℃開始每個循環降低1℃,后25個循環,退火溫度為50℃;72℃延伸10min。
4.如權利要求1所述的檢測牛PCAF基因單核苷酸多態性的RFLP方法,其特征在于:所述酶切在10μL的酶切體系中進行,酶切體系包括PCR產物5μL、10×T Buffer 1.0μL,0.1%BSA 1.0μL以及15U/μL限制性內切酶0.2μL,酶切條件為37℃消化8~10h。
5.如權利要求1所述的檢測牛PCAF基因單核苷酸多態性的RFLP方法,其特征在于:所述瓊脂糖凝膠電泳采用質量濃度3.0%的瓊脂糖凝膠。
6.如權利要求1所述的檢測牛PCAF基因單核苷酸多態性的RFLP方法,其特征在于:根據凝膠成像系統分析S1酶切電泳片段大小,鑒定牛PCAF基因上單核苷酸多態性位點存在的三種基因型:TT基因型表現為21bp和57bp的條帶,CC基因型表現為78bp的條帶;TC基因型表現為78bp、57bp和21bp的條帶;根據凝膠成像系統分析S2酶切電泳片段大小,鑒定牛PCAF基因上單核苷酸多態性位點存在的三種基因型:CC基因型表現為191bp和27bp的條帶,TT基因型表現為218bp的條帶;TC基因型表現為218bp、191bp和27bp的條帶;根據凝膠成像系統分析S3酶切電泳片段大小,鑒定牛PCAF基因上單核苷酸多態性位點存在的三種基因型:CC基因型表現為287bp和27bp的條帶,TT基因型表現為314bp的條帶,CT基因型表現為314bp、287bp和27bp的條帶。
7.一種檢測牛PCAF基因單核苷酸多態性的RFLP試劑盒,其特征在于:包括引物對P1、P2和P3;
所述引物對P1為:
上游引物F1:5`-GGGTTCCCACTGCACAGGCCAAGCT-3`
下游引物R1:5`-GTCCATCAGACGCCCCCACACAGAG-3`;
所述引物對P2為:
上游引物F2:5`-ACCTTCAAGGCCTTTTACATGCGGG-3`
下游引物R2:5`-TCAAAGAGGAATGGACACAGGCAGA-3`;
所述引物對P3為:
上游引物F3:5`-CTCTTCCCAGTCTCACTTTTGTGGG-3`
下游引物R3:5`-AGGCACACTGTTTGATGAGTTTCTA-3`。
8.如權利要求7所述的檢測牛PCAF基因單核苷酸多態性的RFLP試劑盒,其特征在于:所述試劑盒還包括2×Taq PCR MasterMix和滅菌超純水。
9.一種如權利要求1所述的檢測牛PCAF基因單核苷酸多態性的RFLP方法在牛生長性狀的標記輔助選擇中的應用。