用于鑒定三種藥用蛇的引物組合及其應用的制作方法

本發明涉及一種用于鑒定三種藥用蛇的引物組合及其應用。

背景技術：

包括蛇肉、蛇膽、蛇蛻等在內的蛇類藥材是我國傳統醫學的重要組成部分，往往具有祛風除濕、通絡止痙、清涼明目、止咳化痰等作用，在中醫臨床上具有廣泛應用，現行2015年版《中國藥典》標準已收載了三種藥用蛇類，即蘄蛇、烏梢蛇與金錢白花蛇。我國蛇類物種約有兩百余種，其中有20余種為常見蛇類，包括蘄蛇Agkistrodon acutus、烏梢蛇Zaocys dhumnades、金錢白花蛇Bungarus multicinctus、金環蛇Bungarus fasciatus、滑鼠蛇Ptyas mucosus、圓斑蝰Daboia russelii、眼鏡蛇Naja naja、中國水蛇Enhydris chinensis、鉛色水蛇Enhydris plumbea、赤鏈蛇Lycodon rufozonatus、王錦蛇Elaphe carinata、紅紋滯卵蛇Oocatochus rufodsata、灰鼠蛇Ptyas korros、短尾蝮蛇Gloydius brevicaudus、黑眉錦蛇Elaphe taeniura、平頦海蛇Pelamis platurus、三索錦蛇Elaphe radiata、百花錦蛇Elaphe moellendorffi、赤鏈華游蛇Sinonatrix annularis、虎斑游蛇Rhabdophis tigrina等，其多數不具有臨床藥效。由于多種蛇類形態相似性，尤其是經過剝皮加工后，往往難以鑒別，常偽充藥用蛇類出售，嚴重影響用藥安全與臨床療效，需要建立準確度高，專屬性好的鑒別方法。

目前蘄蛇與烏梢蛇施行聚合酶鏈式反應法鑒別，金錢白花蛇依靠傳統性狀鑒別。由于三種蛇類沒有統一的鑒別方法，對藥用蛇類進行鑒別時，需要同時進行性狀檢測，并且需要分別對蘄蛇、烏梢蛇使用各自特異性引物進行PCR擴增，并且這些方法測試時間較長，且均需要電泳檢測才可完成，不利于現場快速鑒別的應用與推廣。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種用于鑒定三種藥用蛇的引物組合及其應用。

本發明提供了一種引物組合，由引物對I、引物對II和引物對III組成；

所述引物對I由引物F1和引物F2組成；

所述引物F1為如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物F2為如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物對II由引物F3和引物F4組成；

所述引物F3為如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；

(a6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物F4為如下(a7)或(a8)：

(a7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；

(a8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物對III由引物F5和引物F6組成；

所述引物F5為如下(a9)或(a10)：

(a9)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子；

(a10)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物F6為如下(a11)或(a12)：

(a11)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子；

(a12)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物組合的用途為如下(b1)至(b6)中的任意一種：

(b1)鑒別蘄蛇、烏梢蛇和金錢白花蛇；

(b2)制備用于鑒別蘄蛇、烏梢蛇和金錢白花蛇的試劑盒；

(b3)鑒定待測蛇是否為蘄蛇、烏梢蛇或金錢白花蛇；

(b4)制備用于鑒定待測蛇是否為蘄蛇、烏梢蛇或金錢白花蛇的試劑盒；

(b5)鑒定待測樣品中是否含有蘄蛇和/或烏梢蛇和/或金錢白花蛇；

(b6)制備用于鑒定待測樣品中是否含有蘄蛇和/或烏梢蛇和/或金錢白花蛇的試劑盒。

本發明還保護所述引物組合的應用，如下(b1)至(b6)中的任意一種：

(b1)鑒別蘄蛇、烏梢蛇和金錢白花蛇；

(b2)制備用于鑒別蘄蛇、烏梢蛇和金錢白花蛇的試劑盒；

(b3)鑒定待測蛇是否為蘄蛇、烏梢蛇或金錢白花蛇；

(b4)制備用于鑒定待測蛇是否為蘄蛇、烏梢蛇或金錢白花蛇的試劑盒；

(b5)鑒定待測樣品中是否含有蘄蛇和/或烏梢蛇和/或金錢白花蛇；

(b6)制備用于鑒定待測樣品中是否含有蘄蛇和/或烏梢蛇和/或金錢白花蛇的試劑盒。

本發明還保護含有所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)鑒別蘄蛇、烏梢蛇和金錢白花蛇；

(c2)鑒定待測蛇是否為蘄蛇、烏梢蛇或金錢白花蛇；

(c3)鑒定待測樣品中是否含有蘄蛇和/或烏梢蛇和/或金錢白花蛇。

本發明還保護所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨包裝的步驟。

本發明還保護鑒別蘄蛇、烏梢蛇和金錢白花蛇的方法，為方法I或方法II。

所述方法I包括如下步驟：提取待測蛇的基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，采用所述引物組合進行PCR擴增，如果擴增產物中含有339-359bp的DNA片段、待測蛇為蘄蛇，如果擴增產物中含有114-134bp的DNA片段、待測蛇為烏梢蛇，如果擴增產物中含有555-575bp的DNA片段、待測蛇為金錢白花蛇。

所述方法II包括如下步驟：檢測待測蛇的基因組DNA中是否含有引物對I的靶序列、引物對II的靶序列或引物對III的靶序列；如果所述基因組DNA中含有引物對I的靶序列、待測蛇為蘄蛇，如果所述基因組DNA中含有引物對II的靶序列、待測蛇為烏梢蛇，如果所述基因組DNA中含有引物對III的靶序列、待測蛇為金錢白花蛇。本發明還保護鑒定待測蛇是否為蘄蛇、烏梢蛇或金錢白花蛇的方法，為方法III或方法IV或方法V。

本發明還保護鑒定待測蛇是否為蘄蛇、烏梢蛇或金錢白花蛇的方法，為方法III或方法IV或方法V。

所述方法III包括如下步驟：提取待測蛇的基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，采用所述引物組合進行PCR擴增，如果采用擴增產物中含有339-359bp的DNA片段、待測蛇為蘄蛇，如果擴增產物中含有114-134bp的DNA片段、待測蛇為烏梢蛇，如果擴增產中含有555-575bp的DNA片段、待測蛇為金錢白花蛇，如果擴增產物中不含有339-359bp的DNA片段、114-134bp的DNA片段或555-575bp的DNA片段、待測蛇為非蘄蛇且非烏梢蛇且非金錢白花蛇。

所述方法IV包括如下步驟：提取待測蛇的基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，采用所述引物組合進行PCR擴增；如果擴增產物加入SYBR Green I熒光染料后可以檢測到綠色熒光、待測蛇為蘄蛇或烏梢蛇或金錢白花蛇，如果擴增產物加入SYBR Green I熒光染料后不可以檢測到綠色熒光、待測蛇為非蘄蛇且非烏梢蛇且非金錢白花蛇。

所述方法V包括如下步驟：檢測待測蛇的基因組DNA中是否含有引物對I的靶序列、引物對II的靶序列或引物對III的靶序列；如果所述基因組DNA中含有引物對I的靶序列、待測蛇為蘄蛇，如果所述基因組DNA中含有引物對II的靶序列、待測蛇為烏梢蛇，如果所述基因組DNA中含有引物對III的靶序列、待測蛇為金錢白花蛇，如果所述基因組DNA中不含有引物對I、引物對II或引物對III的靶序列、待測蛇為非蘄蛇且非烏梢蛇且非金錢白花蛇。

本發明還保護鑒定待測樣品中是否含有蘄蛇和/或烏梢蛇和/或金錢白花蛇的方法，為方法VI或方法VII或方法VIII。

所述方法VI包括如下步驟：提取待測樣品的基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，采用所述引物組合進行PCR擴增，如果擴增產物中含有339-359bp的DNA片段、待測樣品中含有蘄蛇，如果擴增產物中含有114-134bp的DNA片段、待測樣品中含有烏梢蛇，如果擴增產物中含有555-575bp的DNA片段、待測樣品中含有金錢白花蛇，如果擴增產物中不含有339-359bp的DNA片段、114-134bp的DNA片段或555-575bp的DNA片段、待測樣品中不含有蘄蛇且不含有烏梢蛇且不含有金錢白花蛇。

所述方法VII包括如下步驟：提取待測樣品的基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，采用所述引物組合進行PCR擴增；如果擴增產物加入SYBR Green I熒光染料后可以檢測到綠色熒光、待測樣品中含有蘄蛇或烏梢蛇或金錢白花蛇，如果擴增產物加入SYBR Green I熒光染料后不可以檢測到綠色熒光、待測樣品中不含有蘄蛇且不含有烏梢蛇且不含有金錢白花蛇。

所述方法VIII包括如下步驟：檢測待測樣品的基因組DNA中是否含有引物對I的靶序列、引物對II的靶序列或引物對III的靶序列；如果所述基因組DNA中含有引物對I的靶序列、待測樣品中含有蘄蛇，如果所述基因組DNA中含有引物對II的靶序列、待測樣品中含有烏梢蛇，如果所述基因組DNA中含有引物對III的靶序列、待測樣品中含有金錢白花蛇，如果所述基因組DNA中不含有引物對I、引物對II或引物對III的靶序列、待測樣品中不含有蘄蛇且不含有烏梢蛇且不含有金錢白花蛇。

以上蛇的含義為生物個體蛇或蛇的任一組織。

本發明還保護所述引物對I或引物對II。

本發明還保護所述引物對I在制備試劑盒甲中的應用。

所述試劑盒甲的用途為如下(d1)或(d2)：

(d1)鑒定待測蛇是否為蘄蛇；

(d2)鑒定待測樣品中是否含有蘄蛇。

本發明還保護所述引物對II在制備試劑盒乙中的應用。

所述試劑盒乙的用途為如下(d3)或(d4)：

(d3)鑒定待測蛇是否為烏梢蛇；

(d4)鑒定待測樣品中是否含有烏梢蛇。

本發明還保護含有所述引物對I的試劑盒甲。

所述試劑盒甲的用途為如下(d1)或(d2)：

(d1)鑒定待測蛇是否為蘄蛇；

(d2)鑒定待測樣品中是否含有蘄蛇。

本發明還保護含有所述引物對II的試劑盒乙。

所述試劑盒乙的用途為如下(d3)或(d4)：

(d3)鑒定待測蛇是否為烏梢蛇；

(d4)鑒定待測樣品中是否含有烏梢蛇。

以上任一所述的PCR擴增退火溫度為60℃。

以上任一所述PCR擴增的反應體系具體可為：2.5μL 10×buffer緩沖液，1.6μL dNTP(2.5mM)，0.4μL引物F1，0.4μL引物F2，0.4μL引物F3，0.4μL引物F4，0.4μL引物F5，0.4μL引物F6，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板，16.3μL無菌雙蒸水。

以上各條引物均以引物溶液形式加入至PCR反應體系中，各條引物在引物溶液中的初始濃度均為5μM。

以上任一所述PCR擴增的反應程序具體可為：預變性：95℃，1min；變性：95℃，10s，退火：60℃，10s，30個循環；4℃保存。

以上任一所述339-359bp的DNA片段具體可為349bp的DNA片段，更具體可為序列表的序列7所示的DNA分子。

以上任一所述114-134bp的DNA片段具體可為124bp的DNA片段，更具體可為序列表的序列8所示的DNA分子。

以上任一所述555-575bp的DNA片段具體可為565bp的DNA片段，更具體可為序列表的序列9所示的DNA分子。

以上任一所述待測樣品具體可為蛇類藥材樣品。所述蛇類藥材樣品具體可為由蛇類任一組織制備的蛇類藥材樣品，例如蛇肉、蛇膽、蛇蛻制備的藥材樣品。

以上任一所述待測蛇具體可為如下任一種：烏梢蛇、金錢白花蛇、蘄蛇、眼鏡蛇、孟加拉眼鏡蛇、金環蛇、中國水蛇、鉛色水蛇、赤鏈蛇、竹葉青、王錦蛇、紅紋滯卵蛇、灰鼠蛇、短尾蝮蛇、蝮蛇、黑眉錦蛇、海蛇、三索錦蛇、百花錦蛇、赤鏈華游蛇、虎斑游蛇、山烙鐵頭蛇、滑鼠蛇。

本發明通過設計蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇的特異性引物，采用特異性PCR技術實現了藥用蛇類及其混偽品的準確鑒別。通過單次PCR反應即可同時鑒別是否存在藥用蛇類(蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇)，根據凝膠電泳條帶大小可檢測是否存在特定的藥用蛇類物種。同時，本發明也可鑒別是藥用蛇類蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇的混合樣品。

附圖說明

圖1為實施例3部分待測樣本PCR鑒別電泳檢測結果。其中，泳道1-2為烏梢蛇(表1中的編號為編號為1和2)；泳道3-4為蘄蛇(表1中的編號為編號為7和8)；泳道5-6為金錢白花蛇(表1中的編號為編號為5和6)；泳道9-23分別為眼鏡蛇(表1中的編號為編號為12)；孟加拉眼鏡蛇(表1中的編號為13)；中國水蛇(表1中的編號為15)；鉛色水蛇(表1中的編號為16)；赤鏈蛇(表1中的編號為18)；竹葉青(表1中的編號為19)；王錦蛇(表1中的編號為20)；紅紋滯卵蛇(表1中的編號為23)；灰鼠蛇(表1中的編號為25)；短尾蝮蛇(表1中的編號為26)；蝮蛇(表1中的編號為27)；黑眉錦蛇(表1中的編號為28)；海蛇(表1中的編號為30)；三索錦蛇(表1中的編號為31)；百花錦蛇(表1中的編號為32)；；泳道24為以水做模板的空白對照；泳道M為DNA分子量標準：從上至下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

圖2為實施例3部分待測樣本PCR鑒別熒光檢測結果。其中，A1、A2為烏梢蛇(表1中的編號為1和2)；A3、A4為蘄蛇(表1中的編號為7和8)；A5、A6為金錢白花蛇(表1中的編號為5和6)；A7：眼鏡蛇(表1中的編號為12)；A8：孟加拉眼鏡蛇(表1中的編號為13)；B1：中國水蛇(表1中的編號為15)；B2：鉛色水蛇(表1中的編號為16)；B3：鉛色水蛇(表1中的編號為17)；B4：赤鏈蛇(表1中的編號為18)；B5：竹葉青(表1中的編號為19)；B6：王錦蛇(表1中的編號為20)；B7：王錦蛇(表1中的編號為21)；B8：王錦蛇(表1中的編號為22)；C1：紅紋滯卵蛇(表1中的編號為23)；C2：紅紋滯卵蛇(表1中的編號為24)；C3：灰鼠蛇(表1中的編號為25)；C4：短尾蝮蛇(表1中的編號為26)；C5：蝮蛇(表1中的編號為27)；C6：黑眉錦蛇(表1中的編號為28)；C7：黑眉錦蛇(表1中的編號為29)；C8：海蛇(表1中的編號為30)；D1：三索錦蛇(表1中的編號為31)；D2：百花錦蛇(表1中的編號為32)；D3：赤鏈華游蛇(表1中的編號為33)；D4：虎斑游蛇(表1中的編號為34)；D5：虎斑游蛇(表1中的編號為35)；D6：山烙鐵頭蛇(表1中的編號為36)；D7：滑鼠蛇(表1中的編號為37)；D8：以水做模板的空白對照。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。以下實施例中，各條引物均以引物溶液形式加入至PCR反應體系中，各條引物在引物溶液中的初始濃度均為5μM。

10×buffer緩沖液：Takara公司，產品目錄號：A1101E。

SpeedStar HS Taq DNA聚合酶：Takara公司，5U/μL，產品目錄號：RR070A。

100×SYBR Green I：Invitrogen公司，產品目錄號：1135054。

表1中蛇類樣品均已在文獻“陳康，蔣超，袁媛，等.快速PCR方法在蛇類藥材真偽鑒別中的應用[J].中國中藥雜志，2014，39(19)：3673-3677.”和“黃勇，張月云，趙成堅，等.DNA條形碼技術在常見中藥材蛇類鑒別中的應用[J].中國中藥雜志，2015，40(5)：868-874.”中公開，公眾可以從中國中醫科學院中藥研究所獲得。

實施例1、引物設計

對各種蛇類物種的基因組進行大量序列分析，獲得了用于鑒定蘄蛇、烏梢蛇和金錢白花蛇的若干引物。將各個引物進行預實驗，比較靈敏度、特異性等性能，最終得到用于鑒定蘄蛇、烏梢蛇和金錢白花蛇的三套引物對。

用于鑒定蘄蛇的引物對(引物對I)由引物F1和引物F2組成(5’→3’)：

F1(序列表的序列1)：CTATACCTAATATTCGGCGCT；

F2(序列表的序列2)：CGGAGAGAGGTGGATAGACG；

用于鑒定烏梢蛇的引物對(引物對II)由引物F3和引物F4組成(5’→3’)：

F3(序列表的序列3)：CAGACATAGCCTTCCCACGC；

F4(序列表的序列4)：GGGGGGTATACTGTTCACCCA；

用于鑒定金錢白花蛇的引物對(引物對III)由引物F5和引物F6組成(5’→3’)：

F5(序列表的序列5)：GAAATTTCGGCTCAATGCTTATAACCTGTCTTT；

F6(序列表的序列6)：GGAATTTTATCGATATCTGAATTAGTA。

引物對I、引物對II和引物對III組成引物組合。

實施例2、鑒定方法建立

一、瓊脂糖凝膠電泳法

1、提取待測樣本的基因組DNA。

2、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用實施例1制備的引物組合中的引物對I、引物對II和引物對III分別進行PCR擴增，得到擴增產物。

PCR擴增體系(25μL)：2.5μL 10×buffer緩沖液，1.6μL dNTP(2.5mM)，0.4μL引物F1，0.4μL引物F2，0.4μL引物F3，0.4μL引物F4，0.4μL引物F5，0.4μL引物F6，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板，16.3μL無菌雙蒸水。

PCR反應程序：預變性：95℃，1min；變性：95℃，10s，退火：60℃，10s，30個循環；4℃保存。

3、將步驟2得到的擴增產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據結果進行如下判斷：

如果擴增產物中含有349bp的DNA片段，則待測樣本中含有蘄蛇，如果擴增產物中不含有349bp的DNA片段，則待測樣本中不含有蘄蛇；

如果擴增產物中含有124bp的DNA片段，則待測樣本中含有烏梢蛇，如果擴增產物中不含有124bp的DNA片段，則待測樣本中不含有烏梢蛇；

如果擴增產物中含有565bp的DNA片段，則待測樣本中含有金錢白花蛇，如果擴增產物中不含有565bp的DNA片段，則待測樣本中不含有金錢白花蛇。

二、熒光染色法

1、提取待測樣本的基因組DNA。

2、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用實施例1制備的引物組合中的引物對I、引物對II和引物對III分別進行PCR擴增，得到擴增產物。

PCR擴增體系(25μL)：2.5μL 10×buffer緩沖液，1.6μL dNTP(2.5mM)，0.4μL引物F1，0.4μL引物F2，0.4μL引物F3，0.4μL引物F4，0.4μL引物F5，0.4μL引物F6，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板，16.3μL無菌雙蒸水。

PCR反應程序：預變性：95℃，1min；變性：95℃，10s，退火：60℃，10s，30個循環；4℃保存。

3、向步驟2得到的PCR擴增產物中加入1μL 100×SYBR Green I，于362nm紫外波長下檢測熒光，根據結果進行如下判斷：

如果擴增產物加入1μL 100×SYBR Green I后進行檢測可以產生綠色熒光，則待測樣本中含有蘄蛇或烏梢蛇或金錢白花蛇，如果擴增產物加入1μL 100×SYBR Green I后進行檢測不能產生綠色熒光，則待測樣本中不含有蘄蛇且不含有烏梢蛇且不含有金錢白花蛇。

實施例3、鑒定方法驗證

待測樣品：表1所示的37個來自不同采集地的已知物種的蛇類藥材樣品。表中的中藥材樣品均符合中國藥典(2015年版)一部正文各藥材項下的有關規定。通過鑒定，各味藥材實物與名稱相符，質量符合標準。

分別采用實施例2建立的瓊脂糖凝膠電泳法和熒光染色法對待測樣品進行鑒定，PCR反應體系中，模板的DNA含量均為20ng。

表1樣品來源表

部分采用瓊脂糖凝膠電泳法進行鑒定的結果見圖1。將圖1中泳道1和泳道2的124bp的目的條帶測序，測序結果均如序列7所示。將圖1中泳道3和泳道4的349bp的目的條帶測序，測序結果均如序列8所示。將圖1中泳道5和泳道6的565bp的目的條帶測序，測序結果均如序列9所示。其他樣品均未得到條帶。結果表明，采用瓊脂糖凝膠電泳法進行鑒定的結果均與實際情況相符，檢測準確率高達100％。

部分采用熒光染色法進行鑒定的結果見圖2。結果表明，采用熒光染色法進行鑒定的結果均與實際情況相符，檢測準確率高達100％。

綜上所述，采用實施例2建立的瓊脂糖凝膠電泳法和熒光染色法均能夠成功鑒定烏梢蛇、金錢白花蛇、蘄蛇三種藥用蛇樣品。

實施例4、靈敏度

待測樣品為：表1中編號為1的烏梢蛇樣品(樣品1)、編號為5的金錢白花蛇樣品(樣品2)、編號為7的蘄蛇樣品(樣品3)。

1、提取待測樣品的基因組DNA，得到DNA溶液；

2、用ddH₂O稀釋步驟1得到的DNA溶液，得到各稀釋液；

3、取步驟2到的各稀釋液作為模板，采用實施例1制備的引物組合分別按照實施例2中的瓊脂糖凝膠電泳法和熒光染色法進行鑒定；

由于采用的稀釋液的稀釋度不同，形成如下不同的反應體系：

反應體系1中，待測樣品DNA初始含量為：100ng；

反應體系2中，待測樣品DNA初始含量為：20ng；

反應體系3中，待測樣品DNA初始含量為：4ng；

反應體系4中，待測樣品DNA初始含量為：0.8ng；

反應體系5中，待測樣品DNA初始含量為：0.16ng。

結果顯示，模板DNA含量最低為0.16ng時，采用實施例2建立的瓊脂糖凝膠電泳法和熒光染色法均能夠成功鑒定烏梢蛇、金錢白花蛇、蘄蛇三種藥用蛇樣品。

4、采用引物組合II替代實施例1制備的引物組合按照步驟1-3進行操作；

引物組合II由引物對IV、引物對V和引物對III組成；

引物對IV由引物F7和引物F8組成(5’→3’)：

F7：GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAAC；

F8：CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC；

引物對V由引物F9和引物F10組成(5’→3’)：

F9：GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA；

F10：CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG。

結果顯示，單獨檢測樣品1、樣品2和樣品3時，使用引物組合II進行檢測的最低檢測限為20ng。

5、制備DNA混合溶液，所述混合溶液中樣品1基因組DNA的含量為0.16ng、樣品2基因組DNA的含量為0.16ng、樣品3基因組DNA的含量為0.16ng。

6、以步驟5制備的DNA混合溶液為模板，分別采用實施例1制備的引物組合和步驟4制備的引物組合II按照實施例2中的瓊脂糖凝膠電泳法進行鑒定。

結果顯示，采用實施例1制備的引物組合對DNA混合溶液進行鑒定時，能夠得到125bp、350bp、560bp三條目的條件，很好的鑒別出三種藥用蛇類樣品，而采用引物組合II對DNA混合溶液進行鑒定時，由于模板DNA含量未達到檢測限，沒有得到目的條帶。

7、制備DNA混合溶液II，所述混合溶液中樣品1基因組DNA的含量為20ng、樣品2基因組DNA的含量為20ng、樣品3基因組DNA的含量為20ng。

8、以步驟7制備的DNA混合溶液II為模板，分別采用實施例1制備的引物組合和步驟4制備的引物組合II按照實施例2中的瓊脂糖凝膠電泳法進行鑒定。

結果顯示，采用實施例1制備的引物組合對DNA混合溶液進行鑒定時，能夠得到124bp、349bp、565bp三條目的條件，很好的鑒別出三種藥用蛇類樣品，而采用引物組合II對DNA混合溶液進行鑒定時，由于引物對IV和引物對V的擴增產物片段大小相近無法區分，不能得到準確的檢測結果。

<110> 中國中醫科學院中藥研究所

<120> 用于鑒定三種藥用蛇的引物組合及其應用

<130> GNCYXMN162250

<160> 9

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ctatacctaa tattcggcgc t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

cggagagagg tggatagacg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

cagacatagc cttcccacgc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ggggggtata ctgttcaccc a 21

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gaaatttcgg ctcaatgctt ataacctgtc ttt 33

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

ggaattttat cgatatctga attagta 27

<210> 7

<211> 349

<212> DNA

<213> 蘄蛇

<400> 7

ctatacctaa tattcggcgc ttggtccggc cttgtaggag cctgcttaag tattctaatg 60

cgcatagaac tgacgcagcc cggaacattg ttcggtagtg accaaatctt taatgtccta 120

gtaaccgccc acgcattcat cataatcttc tttatagtaa tacctattat aatcggagga 180

ttcggaaact gactaattcc tctaataatc ggaacccccg atatagcttt cccccgtata 240

aacaacataa gcttctgact actgccccca gcattactcc tattactatc ctcctcctac 300

atcgaagcag gcgcaggaac aggttgaacc gtctatccac ctctctccg 349

<210> 8

<211> 124

<212> DNA

<213> 烏梢蛇

<400> 8

cagacatagc cttcccacgc ataaacaaca tgagcttctg gttgctacca ccagcactac 60

tcctacttct atcctcctct tatgttgaag ccggagccgg cactgggtga acagtatacc 120

cccc 124

<210> 9

<211> 565

<212> DNA

<213> 金錢白花蛇

<400> 9

gaaattttgg ctctatgtta ataacctgtc ttttactaca aattataaca ggctttttcc 60

tagcgatcca ctatacagct aatattaact tagctttctc atcagtagtg catattatac 120

gcgatgtgcc ctacgggtga accatacaaa atattcatgc aattggcgca tctttattct 180

ttatttgtat ttacgcccat attgcacgag gactctacta tggcttgtac ctcaataaag 240

aggtctgatt atcaggaacc gccctattaa ttactctaat agcaacagcc ttctttggct 300

atgtccttcc atgagggcaa atatcattct gggcagcaac agtaattaca aacttactta 360

ccgcaatccc atacctagga aacacactaa caacctgact ttgaggaggt ttctctatta 420

atgacccaac cctcacccga tttttcgctt tacacttcat cctcccattc gctattatct 480

ccttatcctc aatccacatt ctcctccttc atgtcgaagg atcaaacaac ccacttggta 540

ctaattcaga tatcgataaa attcc 565