一種免疫磁珠法分離胎盤滋養層細胞的方法與流程

本發明涉及免疫磁珠法的細胞分選技術，具體涉及一種免疫磁珠法分離胎盤滋養層細胞的方法。
背景技術：
：滋養層細胞是在胚胎發育成桑椹胚后，桑椹胚進一步發育，細胞開始出現分化并沿透明帶內壁擴展和排列的較小個體細胞，將來發育成胎膜和胎盤。早期就有研究表明，孕婦宮頸脫落細胞中存在胎盤滋養層細胞，貫穿整個孕期。因此，對滋養層細胞實現有效分離并獲取胎兒dna，對于最早期的產前篩查和診斷具有重大意義。許多研究表明，在早孕期包蛻膜和真蛻膜尚未融合時，一定比例的滋養細胞會穿過包蛻膜到達子宮腔，部分脫落到子宮下段，或者通過絨毛退化并脫落至子宮下段或宮頸處，并逐漸積聚，所以若使用一種微創或無創的方法采集宮頸處細胞，就可以精確地進行胎兒的產前診斷，這無疑是一種極具吸引力的方法。免疫磁珠法細胞分選技術是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。細胞分選的方法包括直接法和間接法，直接法即抗體直接與細胞表面抗原結合，間接法即抗體(二抗)通過其本身的抗原(一抗)與細胞表面的抗原結合。人白細胞抗原-g(hla-g)基因是位于6號染色體短臂的一類免疫耐受分子，具有選擇性組織分布的特點，hla-g分子主要在人胎盤組織中轉錄，表達于孕卵著床期母體子宮內膜的胎盤組織中，通常情況下，hla-g可作為孕期胎兒滋養層細胞的特異性標志物。當前胎兒滋養層細胞的分離純化方案主要有以下幾類：1)組織塊培養法，根據不同類型細胞的培養懸浮/貼壁狀態不同實現對滋養層細胞的分離。取樣后制備成單細胞懸液進行培養，血細胞和hofbauer細胞為非貼壁，換液過程容易去除；成纖維細胞和滋養層細胞為貼壁，但成纖維細胞貼壁速度較快且對胰蛋白酶敏感，可在消化過程中分離。此方法得到的滋養層細胞純度約為80％，成功率在90％左右。2)密度梯度離心法，采用不連續或連續的溶液梯度對細胞進行分離，確定滋養層細胞所處的密度層從而完成分離。可分為percoll法、淋巴細胞分層液法、ficoll法。此方法分離的細胞形態完整、活性較好，純度可從80％～90％以上，與分層液的類型關系較大。然而，這些方案雖然能夠取得較好的分離效果，但這些方法均存在操作過于繁瑣，分離時間過長等缺點，嚴重限制滋養層細胞在胎兒產前篩查領域的應用。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種免疫磁珠法分離胎盤滋養層細胞的方法，該方法基于免疫磁珠法細胞分選技術，利用抗體偶聯磁珠實現對胎盤滋養層細胞的特異性捕獲，簡單的幾步孵育便能輕松、快速的實現滋養層細胞的分離，且易于實現自動化，有效解決了傳統方法存在的繁瑣、低效和時間過長等問題。為達上述目的，本發明的主要技術解決手段是提供一種免疫磁珠法分離胎盤滋養層細胞的方法，包括以下步驟：(1)免疫磁珠偶聯特異性抗體的制備，向免疫磁珠中加偶聯劑和能夠特異性捕獲胎盤滋養層細胞的抗體進行孵育；(2)洗滌(1)中孵育完成的偶聯抗體的免疫磁珠2次，將偶聯抗體的免疫磁珠保存在保存液中備用；(3)收集胎盤滋養層樣本，采用酶解法將該樣本制備為樣本細胞懸液；(4)把(3)中的樣本細胞懸液洗滌2次；(5)向(4)洗滌后的樣本細胞懸液中加入(2)中的偶聯有特異性抗體的免疫磁珠進行孵育；(6)洗滌孵育完成的(5)中的免疫磁珠2次，棄上清，即可得到純化的胎盤滋養層細胞；優選的，所述免疫磁珠為羧基磁珠、環氧基磁珠、甲苯磺酰基磁珠，更優選的，所述免疫磁珠為甲苯磺酰基磁珠，優選供應商為thermofisherm-270epoxy(貨號14301)，所述偶聯劑為與免疫磁珠類型相對應的偶聯劑，偶聯方法與所購免疫磁珠類型相一致。優選的，能夠特異性捕獲胎盤滋養層細胞的抗體為hla-g抗體，所述步驟(1)孵育的條件和時間與所購免疫磁珠類型相一致，優選的，孵育條件為37℃偶聯16-24h，更優選的，孵育條件為37℃偶聯24h。所述步驟(2)、(4)和(6)的洗滌液均為細胞培養用pbs，優選的，pbs構成組分為1.35mnacl，47mmkcl，100mmna2hpo4，20mmnah2po4，且pbs的ph值為7.4。所述步驟(3)的胎盤滋養層樣本為5-8周孕婦宮頸脫落細胞，其中包含胎兒滋養層細胞和母體細胞，所述細胞懸液為懸浮細胞的pbs，所述酶解法是利用酶混合物消化胎盤滋養層，具體地，酶混合物為0.25％胰蛋白酶，20u/mldnasei，0.5mg/ml膠原酶i。所述步驟(2)的保存液為去離子水或5％(m/v)bsa。優選的，樣本為25-500μl，更優選的，樣本為50-150μl。優選的，步驟(5)中的細胞懸液與添加的免疫磁珠的體積比為2:1-1:4，所述步驟(5)的孵育條件為4℃-42℃，30min-24h，優選的，孵育條件為37℃，2h。本發明所述的免疫磁珠法分離胎盤滋養層細胞的方法的具體步驟如下：(1)甲苯磺酰基磁珠偶聯hla-g抗體的制備：甲苯磺酰基磁珠為thermofisherm-270epoxy(貨號14301)，偶聯方法參照其產品說明書提供的方法，取磁珠5mg，用pbs溶液洗滌2次(每次1ml)，懸于100μlpbs溶液中，加入100μlhla-g抗體，100μl3m(nh4)2so4溶液，渦旋混勻，37℃傾斜搖動孵育24h，避免磁珠沉降，用0.1％bsa/pbs溶液洗滌磁珠4次(每次1ml)，磁珠懸浮于1ml0.1％bsa/pbs溶液中備用。(2)含胎盤滋養層細胞的單細胞懸液制備：取5-8周孕婦宮頸脫落細胞樣本，用預冷的pbs洗滌2次，2500g離心5min收集細胞，加入由0.25％胰蛋白酶，20u/mldnasei，0.5mg/ml膠原酶i組成的酶混合物于37℃孵育30min消化組織和粘液，用預冷的pbs洗滌2次，2500g離心5min吸除上清，加入100ul預冷pbs重懸細胞。(3)胎盤滋養層細胞分離與純化：向(2)中制備好的含胎盤滋養層細胞的細胞懸液中加入0.2ml(1)中制備的hla-g抗體偶聯磁珠，置于37℃傾斜搖動孵育2h，用pbs溶液洗滌磁珠2次，每次1ml，在磁力架上聚集磁珠并吸除上清，即分離得到純化的滋養層細胞樣本。本發明有益效果是：1、hla-g抗體對胎盤滋養層細胞的特異性選擇完成捕獲，特異性較高；2、利用免疫磁珠偶聯的抗體進行捕獲，捕獲效率極高且操作方便；3、僅需一次抗體的偶聯，與通常的二抗兩次偶聯相比，使整個操作簡便易行；4、能短期快速完成低濃度細胞樣本的富集，并且避免細胞擴大培養的不便利，對于早期胎兒的無創產前篩查和診斷具有重大意義。附圖說明圖1是磁珠捕獲jeg-3細胞的結合體狀態效果圖，圖2是hek293ft細胞轉染效果示意圖，圖3是免疫磁珠分離hek293ft和jeg-3混合細胞后，利用熒光顯微鏡觀察對兩種細胞的回收數量圖示，圖4是免疫磁珠分離hek293ft和jeg-3混合細胞后，利用普通顯微鏡觀察對兩種細胞的回收數量圖示，圖5是免疫磁珠分離得到滋養層細胞的圖示；圖中：具有hla-g抗原的細胞(jeg-3細胞、宮頸滋養層細胞)1、被hla-g抗體偶聯的磁珠2。具體實施方式為便于理解，更好地對本發明進行解釋，此處結合實驗對
發明內容作進一步描述，此處需要說明的是，hla-g為人類白細胞抗原-g，屬于非經典人類白細胞抗原i類分子，主要選擇性分布在母體胎兒界面絨毛外細胞滋養層。jeg-3為人絨毛膜癌細胞株，能夠高度表達hla-g表面抗原，本發明利用jeg-3細胞通過以下實施例對本分離的特異性和效率進行具體描述。以下實施例僅為說明性驗證，并非限制性條件。實施例1hla-g偶聯免疫磁珠的合成與偶聯效率檢測(1)取5mg甲苯磺酰基磁珠(thermofisherm-270epoxy(貨號14301))，用pbs溶液洗滌2次(每次1ml)，懸于100μlpbs溶液中。(2)在(1)含有磁珠的pbs溶液中加入100μlhla-g抗體和100μl3m(nh4)2so4溶液，渦旋混勻，置于37℃傾斜搖動孵育24h，避免磁珠沉降。(3)用0.1％bsa/pbs溶液洗滌(2)中孵育完成的磁珠4次(每次1ml)，磁珠懸浮于1ml0.1％bsa/pbs溶液中備用。(4)取偶聯前后含hla-g抗體的溶液各10ul，利用quibt3.0fluorometer(lifetechnologies)測定反應前后的蛋白含量，根據差量法計算偶聯成功的hla-g抗體含量，結果如下表所示。偶聯前后的蛋白含量測定結果蛋白濃度偶聯前289.5μg/ml偶聯后204.9μg/ml偶聯成功的hla-g量25.4μg/(1ml磁珠)實施例2jeg-3細胞樣本的培養與計數(1)jeg-3細胞在dmem(含10％fbs、1％青霉素-鏈霉素雙抗溶液)中培養與傳代，jeg-3細胞快速生長期取樣用于實驗；(2)取一皿(1)中的jeg-3細胞，用0.25％胰蛋白酶消化液消化jeg-3細胞，并用pbs洗滌jeg-3細胞兩次，2500g離心5min收集jeg-3細胞，將jeg-3細胞懸浮于1mlpbs溶液中；(3)取10μl(2)中收集到的jeg-3細胞懸液，稀釋1000倍，用血細胞計數板準確對jeg-3細胞進行計數，3次計數結果統計如下表所示。jeg-3細胞計數結果計數結果第1次8.62x105個/ml第2次8.68x105個/ml第3次8.63x105個/ml平均值8.64x105個/ml實施例3免疫磁珠法分離效率測試(1)取jeg-3細胞懸液1.16μl(1000個細胞)，加入pbs溶液補足至總體積100μl；(2)加入實施例1所制備hla-g偶聯磁珠懸液200μl，置于37℃傾斜搖動孵育2h；(3)用pbs溶液洗滌(2)中孵育完成的磁珠-細胞結合體2次，每次0.5mlpbs溶液，在磁力架上聚集磁珠吸除上清，加入100ulpbs溶液重懸磁珠-細胞結合體；(4)在顯微鏡下觀察并分辨磁珠中的細胞，用血細胞計數板統計細胞數量，結果如下表所示，并拍照，磁珠-細胞結合體狀態如附圖1所示：免疫磁珠法回收jeg-3細胞統計結果實施例4hek293ft細胞樣品的培養與轉染(1)hek293ft細胞在dmem(含10％fbs、1％青霉素-鏈霉素雙抗溶液)中培養與傳代，細胞快速生長期取樣用于轉染實驗；(2)轉染質粒購自碧云天生物pcmv-c-egfp(參考網站：http://www.beyotime.com/d2626.htm)，轉染試劑購自碧云天生物lipo6000tm轉染試劑(參考網站http://www.beyotime.com/product/c0526.htm)；(3)轉染后培養48h更換溶液，然后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，轉染效果如附圖2所示；(4)細胞數量的統計方法參照實施例2的方法，統計結果如下表所示：hek293ft細胞計數結果計數結果第1次5.29x105個/ml第2次5.24x105個/ml第3次5.17x105個/ml平均值5.23x105個/ml實施例5免疫磁珠法分離特異性測試(1)取實施例2所制備細胞懸液1.16μl(1000個細胞)，混入實施例4所制備細胞懸液17.21μl(9000個細胞)，加入pbs溶液補足至總體積100μl；(2)在(1)中制備的100μl細胞懸液中加入實施例1所制備hla-g偶聯磁珠懸液200μl，置于37℃傾斜搖動孵育2h；(3)用pbs溶液洗滌(2)中孵育完成的磁珠-細胞結合體2次，每次0.5mlpbs溶液，在磁力架上聚集磁珠吸除上清，加入100ulpbs溶液重懸磁珠-細胞結合體；(4)在熒光顯微鏡下觀察轉染磁珠-細胞結合體熒光信號狀況(即通過反向法檢驗免疫磁珠對hek293ft細胞的非特異性捕獲)如圖3所示，在明場顯微鏡下觀察磁珠-細胞結合體狀態如附圖4所示。實施例6宮頸脫落樣本單細胞懸液制備(1)取孕齡為5周的孕婦宮頸脫落細胞樣本，用預冷的pbs洗滌2次，2500g離心5min收集細胞；(2)在步驟(1)收集的細胞中加入由0.25％胰蛋白酶，20u/mldnasei，0.5mg/ml膠原酶i組成的酶混合物，并置于37℃孵育30min消化組織和粘液；(3)用預冷的pbs洗滌2次，2500g離心5min吸除上清，加入100ul預冷pbs重懸細胞。實施例7免疫磁珠法分離胎盤滋養層細胞效果測試(1)向實施例5的步驟(1)中所述的100ul細胞懸液中加入200ul實施例1所制備hla-g偶聯磁珠，置于37℃傾斜搖動孵育2h；(2)用pbs溶液洗滌(1)中的磁珠-細胞結合體2次，每次0.5mlpbs溶液，在磁力架上聚集磁珠吸除上清，加入100ulpbs溶液重懸磁珠-細胞結合體。(3)在顯微鏡下觀察并分辨磁珠中的細胞并拍照，捕獲的滋養層細胞-磁珠結合體狀態如附圖5所示。實驗結果的說明：圖1、圖4、圖5所示具有表面hla-g抗原的細胞1(jeg-3細胞、宮頸滋養層細胞)，被hla-g抗體偶聯的磁珠2特異性性偶聯，顯微鏡下觀察顯示，磁珠結合在細胞周邊形成細胞-磁珠結合體。利用綠色熒光蛋白(egfp)轉染的hek293ft細胞(圖2所示)混入jeg-3細胞，經hla-g磁珠分離后，未檢出熒光信號(圖3所示)，即磁珠未結合到hek293ft細胞，但明場顯微鏡下觀察到磁珠結合的細胞，圖4所示即為特異性結合的jeg-3細胞。圖5所示磁珠富集得到的細胞即為從宮頸脫落細胞樣品中特異性結合到的滋養層細胞。本發明不局限于上述最佳實施方式，任何人在本發明的啟示下都可得出其他各種形式的產品，但不論在其形狀或結構上作任何變化，凡是具有與本申請相同或相近似的技術方案，均落在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12