利用雙重PCR技術篩選產發菜多糖重組酵母菌株的方法與流程

本發明屬于生物分子技術領域，涉及一種高效準確篩選產發菜多糖重組酵母菌株的方法，具體涉及一種利用雙重PCR技術篩選產發菜多糖重組酵母菌株的方法。

背景技術：

目前，重組菌株的篩選方法主要有BTB顯色法、代謝產物定性法等，這些方法有的雖被廣泛采用，但篩選對象不同所選用的方法也不同。重組菌株代謝產物大多具有酸堿性質，且產量較大，可使用代謝產物定性法進行篩選。但是發菜多糖在培養液中呈中性，且代謝產物產量少，常規篩選方法不僅費時、困難，而且會影響試驗結果。此外，關于發狀念珠藻功能成分發菜多糖的生物合成相關基因的研究報道較少。因此，選擇合適的篩選方法至關重要。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種利用雙重PCR技術篩選產發菜多糖重組酵母菌株的方法，篩選較為容易、省時，且不影響試驗結果。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：一種利用雙重PCR技術篩選產發菜多糖重組酵母菌株的方法，具體按以下步驟進行：

步驟1：利用酵母DNA提取試劑盒提取發菜酵母重組菌株，提取重組菌株基因組DNA；

步驟2：設計引物序列為5’-3’ 的引物1和引物序列為5’-3’ 的引物2；

步驟3： PCR總體積為25μL，其中包括2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，上游引物 1.0μL，下游引物1.0μL，模板 DNA 1.5μL，其余用水補足；反應程序：94 ℃變性2 min；94 ℃20 s ，52 ℃ 25 s ，72 ℃ 30 s，18個循環；72 ℃延伸2 min；進行單重PCR擴增：

步驟4：模板 DNA 3μl，雙重引物上下游各加1.5μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，加 ddH₂O 至25μl；擴增PCR 反應程序為 94℃變性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，進行 20 個循環；最后 72℃延伸 2min，4℃保溫，進行雙重PCR擴增，擴增產物在 -20℃保存；

步驟5：對Pho1 F/R和Pho2 F/R兩對引物進行引物配比，雙重PCR擴增體系為：模板 DNA 3μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，引物濃度分別為1.5μl，加 ddH₂O 至25μl，擴增PCR 反應程序為：94℃變性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，進行 20 個循環；最后 72℃延伸 2min，4℃保溫；

步驟6：用步驟5得到的雙重PCR擴增體系，對產發菜多糖重組酵母菌株進行篩選。

本發明篩選方法根據發狀念珠藻N. flagelliforme（簡稱發菜）光合作用基因相關酶基因序列，設計合成了2對特異性引物（Pro1基因和Pro2基因），分別建立Pro1和Pro2基因的單重PCR擴增方法。在單重PCR基礎上通過對PCR擴增條件的優化，建立了篩選產發菜多糖酵母重組菌株的雙重PCR檢測方法，即利用一次PCR反應，從重組酵母菌株中可同時擴增出2條大小分別為800 bp（Pro1基因）、550 bp（Pro2基因）的特異性片段，而以酵母基因組DNA作為對照組擴增結果為陰性。利用該篩選方法可在同一管中同時擴增出Pro1和Pro2兩對基因，大大節省了篩選時間和篩選成本，通過擴增兩個相關基因，檢測相關基因的分布狀況，在基因型上快速、高效、準確的對發菜酵母重組菌株進行高通量篩選。為遠緣、超遠緣基因重組細胞的篩選提供了切實可行的生物分子篩選檢測方法。該篩選方法是一種從基因型上高效、準確篩選發菜酵母重組菌株的方法。

附圖說明

圖1是本發明篩選方法中引物1的單重PCR凝膠電泳圖。

圖2是本發明篩選方法中引物2的單重PCR凝膠電泳圖。

圖3是發明篩選方法中雙重PCR凝膠電泳圖。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式對本發明進行詳細說明。

由于發菜多糖在培養液中呈中性，且代謝產物產量少，采用常規篩選方法篩選酵母重組菌株時，不僅費時、篩選困難，而且影響試驗結果。為了客服現有技術中存在的問題，本發明提供了一種篩選省時容易，對試驗結果影響不大的篩選產發菜多糖重組酵母菌株的方法，該篩選方法具體按以下不在進行：

步驟1：重組菌株基因組DNA的 提取：利用酵母DNA提取試劑盒提取發菜酵母重組菌株，提取重組菌株基因組DNA；

步驟2：引物的設計與合成：雙重PCR所用引物：引物1引物序列(5’-3’) ，（F：ACCACCTTCGTCACCTCT， R：GGATACCCTCGTTCAGCA），如圖1所示，通道1#、2#、3#以發菜基因組DNA作為模板添加引物1進行單重PCR在800bp出現條帶，通道4#、5#、6#以酵母基因組DNA作為模板添加引物1進行單重PCR在800bp沒有出現條帶；引物2引物序列(5’-3’) ，（F：TAGGAAGAAGCGAAAGCG，R：CAGTTGATGGAATGGGTG），如圖2所示，通道1#、2#、3#以發菜基因組DNA作為模板添加引物2進行單重PCR在550bp出現條帶，通道4#、5#、6#以酵母基因組DNA作為模板添加引物2進行單重PCR在550bp處沒有出現條帶；

引物1和引物2的序列信息表，如表1所示。

表1 引物序列信息表

步驟3：單重PCR擴增條件：PCR總體積為25μL，其中包括2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，上游引物（10μmol/L） 1.0μL，下游引物（10μmol/L）1.0μL，模板 DNA 1.5μL，其余用水補足；反應程序：94 ℃變性2 min；94 ℃20 s ，52 ℃ 25 s ，72 ℃ 30 s，18個循環；72 ℃延伸2 min；

步驟4：雙重PCR擴增條件：PCR 反應其它參數采用以下體系進行擴增：模板 DNA 3μl，雙重引物上下游各加1.5μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，加 ddH₂O 至25μl；擴增PCR 反應程序為 94℃變性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，進行 20 個循環；最后 72℃延伸 2min，4℃保溫，擴增產物在 -20℃保存；

如圖3所示，通道1#、2#、3#以發菜基因組DNA作為模板添加引物1和引物2進行雙重PCR在800bp和550bp均出現條帶，條帶單一清晰；而通道4#、5#、6#以酵母基因組DNA作為模板添加引物1和引物2進行雙重PCR在800bp和550bp處沒有出現條帶。

步驟5：用步驟4得到的雙重PCR擴增體系，對產發菜多糖重組酵母菌株進行篩選。

本發明篩選方法采用雙重PCR高通量篩選體系，可以在基因型上快速、高效、準確的對發菜酵母重組菌株進行高通量篩選。為遠緣、超遠緣基因重組細胞的篩選提供了切實可行的生物分子篩選檢測方法。

實施例

利用酵母DNA提取試劑盒提取發菜酵母重組菌株，提取重組菌株基因組DNA；引物1引物序列(5’-3’) ，（F：ACCACCTTCGTCACCTCT， R：GGATACCCTCGTTCAGCA）；引物2引物序列(5’-3’) ，（F：TAGGAAGAAGCGAAAGCG，R：CAGTTGATGGAATGGGTG）；單重PCR擴增條件：PCR總體積為25μL，其中包括2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，上游引物（10μmol/L） 1.0μL，下游引物（10μmol/L）1.0μL，模板 DNA 1.5μL，其余用水補足；反應程序：94 ℃變性2 min；94 ℃20 s ，52 ℃ 25 s ，72 ℃ 30 s，18個循環；72 ℃延伸2 min；PCR 反應其它參數采用以下體系進行擴增：模板 DNA 3μl，雙重引物上下游各加1.5μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，加 ddH₂O 至25μl；擴增PCR 反應程序為 94℃變性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，進行 20 個循環；最后 72℃延伸 2min，4℃保溫，擴增產物在 -20℃保存；對Pho1 F/R和Pho2 F/R兩對引物進行引物配比，最終確定體系為：模板 DNA 3μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，引物濃度分別為（10μM）為1.5μl，加 ddH₂O 至25μl，擴增PCR 反應程序為：94℃變性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，進行 20 個循環；最后 72℃延伸 2min，4℃保溫；用雙重PCR擴增體系，對產發菜多糖重組酵母菌株進行篩選。

本發明篩選方法的優越性：

1）與傳統重組菌株的篩選方法，如代謝產物分析法相比，雙重PCR高通量篩選體系可以一次性擴增和篩選96個重組菌株，大大縮短篩選時間，節省篩選成本，提高篩選效率，實現高通量篩選。

2）與傳統重組菌株篩選方法，如代謝產物顯色法相比，雙重PCR高通量篩選體系從基因角度對重組菌株進行篩選，篩選方法更加準確，可行度好。

3）與傳統重組菌株的篩選方法，雙重PCR高通量篩選體系可以短時間完成整個實驗篩選過程，防止長時間篩選過程對菌種的污染，減少污染率和菌種的儲藏成本。