一種綠茶降血糖肽的制備方法及其應用與流程

本發明屬于茶葉多肽
技術領域：
。更具體地，涉及一種綠茶降血糖肽的制備方法及其應用。
背景技術：
：我國是世界上最大的茶葉生產國，隨著茶葉深加工技術及企業迅速發展，茶飲料等深加工產品大量生產同時產生了大量茶渣。茶葉蛋白來自經過提取后的茶葉廢渣中，其氨基酸比例平衡，氨基酸評分高于大豆，接近母乳和牛奶，是一種優質的蛋白質資源，占茶葉干重的20～30％，其中80％以上是非水溶性蛋白，具有抗氧化、降低血脂等功效，其酶解為小分子多肽后活性更高。目前，以茶葉為原料實施規模化開發的功能成分主要有茶多酚、兒茶素、茶色素、生物堿、茶皂素、花青素等，而對于茶渣中茶葉蛋白的開發利用甚少。降血糖肽具有降血糖效果好且對正常血糖無影響、無副作用等優點，以蠶蛹、杏仁、苦瓜、啤酒糟等動植物為原料制備的降血糖肽相繼問世，截止到目前，以茶葉為原料制備降血糖肽的研究尚未見報道。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是克服上述現有技術的缺陷和不足，提供一種綠茶降血糖肽的制備方法和應用。本發明的目的是提供所述一種綠茶降血糖肽的制備方法。本發明另一目的是提供所述一種綠茶降血糖肽的應用。本發明上述目的通過以下技術方案實現：一種綠茶降血糖肽的制備方法，采用蛋白酶催化水解綠茶蛋白生成具有降血糖活性的多肽片段，具體步驟如下：S1.破壁：采用酶解技術，利用復合植物水解酶對綠茶茶渣進行酶解破壁處理；S2.堿提：步驟S1酶解后的綠茶茶渣繼續采用堿法提取茶蛋白，得到綠茶茶蛋白提取液；S3.酸沉：對S2所得綠茶茶蛋白提取液進行酸沉，得沉淀物；S4.脫鹽：對S3所得沉淀物進行脫鹽；S5.脫色：取S4脫鹽后的綠茶蛋白，利用85％丙酮進行脫色，冷凍干燥得到綠茶蛋白；S6.酶解：取S5所得的綠茶蛋白加入酸性蛋白酶進行酶解，得到具有降血糖活性的綠茶多肽。優選地，所述綠茶茶渣為綠茶茶葉、綠茶茶渣、浸提后的廢棄綠茶茶渣中的一種。優選地，所述酸性蛋白酶為和氏璧酸性蛋白酶(Acidprotease)。優選地，所述復合植物水解酶為諾維信復合植物水解酶ViscozymeL。優選地，步驟S1所述酶解的參數為：酶濃度為2.0～3.0％，固液比為1:30～1:40，酶解pH為2.0～3.0，酶解溫度為40～50℃，酶解時間為2.5～3h。優選地，步驟S2所述堿提的參數為：堿液濃度為0.10～0.20mol/L，固液比為1:20～1:40，提取溫度為85～95℃，提取時間為1～3h；離心得到綠茶蛋白提取液。優選地，步驟S3所述酸沉是取綠茶蛋白堿提液，用稀鹽酸調節pH為2.5～3.5，靜置30～60min后離心，得到沉淀物。優選地，步驟S4所述脫鹽是在沉淀物中加入水混勻，注入透析袋中，置于純水中透析24～48h，期間更換純水4～6次，直至透析袋外水無色且電導率接近純水，然后3500～4000r/min離心10～15min得到脫鹽后的綠茶蛋白。優選地，步驟S5所述脫鹽后的綠茶蛋白和85％丙酮的用量比為：固液比1:4～1:6。優選地，步驟S5所述脫色的方法是：取S4脫鹽后的綠茶蛋白，加入85％丙酮，震蕩15～20min，離心棄上清，重復數次，用純水洗滌并離心，重復數次以洗凈丙酮，得到綠茶蛋白。優選地，步驟S6所述酶解的參數為：酶濃度為2.5～3.5％，酶解pH為2.0～5.0，酶解溫度為40～58℃，酶解時間為2.5～3h。更優選地，步驟S6所述酶解的參數為：酶濃度為2.5～3.5％，酶解pH為3.0～4.0，酶解溫度為45～50℃，酶解時間為2.5～3h。更優選地，步驟S6所述酶解的參數為：酶濃度為2.5％，酶解pH為4.0，酶解溫度為45℃，酶解時間為3h。另外，由上述制備方法制備得到的具有降血糖活性的綠茶多肽，以及所述綠茶多肽在制備降血糖藥物或具有降血糖功能的茶葉功能性食品方面的應用，也都應在本發明的保護范圍之內。本發明具有以下有益效果：本發明提供了一種酶法提取具有降血糖活性綠茶多肽的方法，在溫和的條件下采用蛋白酶催化水解綠茶蛋白生成具有降血糖活性的多肽片段，具有原料來源廣泛、反應條件溫和、易控制、專一性強、不使用有毒有害試劑等優點，既不會導致營養成分的損失，也不會產生毒性方面的問題。本發明提供的具有降血糖活性綠茶多肽在研究開發具有降血糖功能的茶葉功能性食品以輔助或代替藥物治療方面具有很好的應用前景，對糖尿病的防治以及茶葉資源的創新利用都具有重要意義。附圖說明圖1為高降血糖活性綠茶多肽提取工藝流程圖。圖2為酸性蛋白酶酶解溫度對綠茶多肽α-淀粉酶抑制率的影響圖。圖3為酸性蛋白酶酶解時間對綠茶多肽α-淀粉酶抑制率的影響圖。圖4為酸性蛋白酶酶濃度對綠茶多肽α-淀粉酶抑制率的影響圖。圖5為酸性蛋白酶酶解pH值對綠茶多肽α-淀粉酶抑制率的影響圖。圖6為高降血糖活性綠茶多肽體內降血糖活性作用圖。具體實施方式以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本
技術領域：
常規試劑、方法和設備。除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。實施例1具有降血糖活性的綠茶多肽的制備1、制備方法流程圖如附圖1所示，包括如下步驟：S1.破壁：采用酶解技術對綠茶茶渣進行酶解破壁處理；S2.堿提：步驟S1酶解后的綠茶茶渣繼續采用堿法提取綠茶蛋白，離心得到綠茶蛋白提取液；S3.酸沉：對S2所得綠茶蛋白提取液進行酸沉，得沉淀物；S4.脫鹽：對S3所得沉淀物進行脫鹽；S5.脫色：取S4脫鹽后的綠茶蛋白，利用85％丙酮進行脫色，冷凍干燥得到綠茶蛋白；S6.酶解：取S5所得的綠茶蛋白加入食物蛋白酶進行酶解，得到具有降血糖活性的綠茶多肽。其中，所述綠茶茶渣為浸提后的廢棄綠茶茶渣。步驟S6所述酶解的參數為：酶濃度為2.5～3.5％，酶解pH為2.0～5.0，酶解溫度為40～60℃，酶解時間為2～3h。步驟S1所述酶解破壁所使用的酶為諾維信復合植物水解酶ViscozymeL。步驟S1所述酶解的參數為：酶濃度為2.0～3.0％％，固液比為1:30～1:40，酶解pH為2.0～3.0，酶解溫度為40～50℃，酶解時間為2～3h。步驟S2所述堿提的參數為：堿液濃度為0.10～0.20mol/L，固液比為1:20～1:40，提取溫度為85～95℃，提取時間為1～3h；離心得到綠茶蛋白提取液。步驟S3所述酸沉是取綠茶蛋白提取液，用稀鹽酸調節pH為2.5～3.5，靜置30～60min后離心，得到沉淀物。步驟S4所述脫鹽是在沉淀物中加入水混勻，注入透析袋中，置于純水中透析24～48h，期間更換純水4～6次，直至透析袋外水無色且電導率接近純水，然后3500～4000r/min離心10～15min得到脫鹽后的綠茶蛋白。步驟S5所述脫鹽后的綠茶蛋白和85％丙酮的用量比為：固液比1:4～1:6。步驟S5所述脫色的方法是：取S4脫鹽后的綠茶蛋白，加入85％丙酮，震蕩15～20min，離心棄上清，重復數次，用純水洗滌并離心，重復數次以洗凈丙酮，得到綠茶蛋白。實施例2綠茶降血糖肽制備過程中酸性蛋白酶酶解溫度的優化1、在固定酸性蛋白酶用量為3.0％，pH值為4.0，在反應時間為3h的條件下，分別選擇40、45、50、55、60℃作為步驟S6的酶解條件進行試驗，測定所得酶解產物的對α-淀粉酶的抑制率。2、結果如圖2所示，不同溫度條件下酶解得到的綠茶多肽的α-淀粉酶抑制率呈現先升高后降低的趨勢，在50℃時抑制率達到最大；但當溫度升高到55℃時，α-淀粉酶抑制率下降速度較快，可能是高溫條件下部分酶失活所致，60℃時，α-淀粉酶抑制率繼續下降。綜合考慮，選取50℃作為最佳酶解溫度進行后續正交實驗設計。實施例3綠茶降血糖肽制備過程中酸性蛋白酶酶解時間的優化在固定酸性蛋白酶用量為3.0％，pH值為4.0，在反應溫度為50℃的條件下，分別選擇酶解時間為1、2、3、4、5h作為酶解條件進行試驗，測定內反應體系所得酶解產物的α-淀粉酶抑制率。結果如圖3所示，不同酶解時間條件下酶解得到的綠茶多肽的α-淀粉酶抑制率隨著酶解時間的增加呈現出升高的趨勢，在酶解3h時達到抑制率達到最大值71.30％，隨著酶解時間繼續增加，抑制率變化不大。由于α-淀粉酶抑制率為主要考察指標，考慮酶解時間延長對多肽的生產周期、成本都不利，因此選擇3h作為最佳酶解時間進行后續正交實驗設計。實施例4綠茶降血糖肽制備過程中酸性蛋白酶的酶濃度的優化在固定酸性蛋白酶酶解反應pH值為4.0，溫度為50℃，時間為3h的條件下，分別選擇酶濃度為1％、2％、3％、4％、5％作為酶解條件進行試驗，測定所得酶解產物的α-淀粉酶抑制率。結果如圖4所示，當酸性蛋白酶濃度為1％～3％時，綠茶多肽對α-淀粉酶抑制率隨著酶濃度的增加呈現升高的趨勢，隨著酶濃度的進一步增加，綠茶多肽對α-淀粉酶抑制率變化不大。這可能是因為底物濃度一定情況下，隨著酶添加量的增加，大量蛋白質分子被水解為小分子多肽，反應體系的初速度隨酶用量的增大逐漸增大，酶加量越大對蛋白質的酶解作用越強，生成的活性短肽越多，其抑制α-淀粉酶的活性越高。當加酶量增加到一定值時，由于可供酶切的底物位點有限，體系中的酶全部將底物酶解后，即使再增加蛋白酶的用量，生成的活性短肽也不會增多，因此其對α-淀粉酶的抑制活性也不會明顯增加。因為在3％酶濃度下酶解所得到的活性多肽α-淀粉酶抑制率最高，并考慮到酶解用酶的成本問題，因此選擇3％為酶解最佳酶濃度進行下一步實驗。實施例5綠茶降血糖肽制備過程中酸性蛋白酶的酶解pH值的優化在固定酸性蛋白酶用量為3％，酶解反應溫度為50℃，反應時間為3h的條件下，分別選擇酶解pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0作為酶解條件進行試驗，測定內反應體系的水解度和所得酶解產物的α-淀粉酶抑制率。結果如圖5所示，在酶解反應pH值為4.0時，α-淀粉酶抑制率達到最大，α-淀粉酶抑制率為73.74％，因此選擇pH4.0作為其最佳的酶解pH值。實施例6酸性蛋白酶酶解制備高降血糖活性綠茶多肽的工藝優化根據上述實施例的酶解條件優化的結果，設計四因素三水平正交實驗(見表1)，用自變量A、B、C、D分別表示酶解溫度(℃)、酶解時間(h)、酶濃度(％)、pH值4個因素，以α-淀粉酶抑制率為考察指標。表1L9(34)正交試驗的因素水平設計結果如表2～表4所示。表2正交試驗結果表3模型直觀分析表4模型方差分析數據來源自由度SeqSSAdjSSAdjMSFPSeqSS溫度2605.67605.67302.849.850.092605.67酶濃度2116.93116.9358.471.900.345116.93pH值2145.40145.4072.702.360.297145.40誤差261.5261.5230.7661.52合計8929.52929.52本試驗以綠茶多肽對α-淀粉酶的抑制率為主要考察指標，α-淀粉酶抑制率越高，綠茶多肽的體外降血糖活性越好。由表3的直觀分析結果可知，通過比較表3中3個因素的極差R值，酶解制備高降血糖活性綠茶多肽的過程中酶解溫度是影響其抑制α-淀粉酶活性最主要因素，影響綠茶多肽抑制α-淀粉酶活性的主次因素從大到小順序依次為：浸提溫度(A)＞pH值(D)＞酶濃度(C)＞酶解時間(B)。從方差分析結果來看，三個因素對α-淀粉酶活性的影響雖然不顯著，只有溫度顯著性達到了0.092。綜合以上結果，可以得到高降血糖活性綠茶多肽提取的最佳工藝為A1B1C2D3。因此，酶解最佳工藝條件為：20g/L的綠茶蛋白在酸性蛋白酶用量2％，反應體系pH5.0，酶解溫度為45℃的條件下水解2h。對優化的實驗結果進行α-淀粉酶的抑制率測定，優水平組合實測值為77.90％，表明該方法下酶解綠茶蛋白得到的綠茶多肽活性較高，從而證明了優化設計與分析方法較為準確。實施例8體內降血糖實驗1、實驗方法(1)實驗分組：采用50只6周齡的雄性ICR小鼠，隨機分成兩組，第一組(N＝10，正常對照組，10只/籠)，第二組(N＝40，造模組，10只/籠)，正常對照組喂養普通飼料，造模組喂養高脂飼料，喂養4周后，空腹12h進行腹腔注射130mg/kg·BWSTZ(溶解在0.1M檸檬酸緩沖液中，pH4.5)，繼續喂養高脂飼料，注射3d和7d后測定血糖值，空腹血糖值≥11.10mmol/L的小鼠選為造模成功的2型糖尿病動物模型，再重新分組，具體分組如下表5所示：表5實驗分組與劑量：(2)實驗步驟實驗開始前1天測定各組小鼠空腹血糖水平，連續灌胃6周，每周采用快速血糖測定儀測定各組小鼠的空腹血糖水平，觀察各個實驗組隨時間變化的空腹血糖水平，每只小鼠每次測定血糖3次，取平均值。(3)實驗結果從圖6結果可以，實驗開始前(0周)，正常組小鼠的空腹血糖水平最低，為6.2mmol/L，處于正常水平。模型組和綠茶多肽組的小鼠血糖水平明顯高于正常組，分別是23.5mmol/L和22.6mmol/L，且兩組之間沒有顯著差異。灌胃5周后，綠茶多肽組的空腹血糖水平明顯下降(13.2mmol/L)，顯著低于模型組的空腹血糖水平(23.7mmol/L)。可見，綠茶多肽在動物體內具有良好的降血糖活性。當前第1頁1 2 3