一株白囊耙齒菌及其應用的制作方法

本發明涉及一株白囊耙齒菌及其應用，屬于生物
技術領域：
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背景技術：
：隨著人口的增加和耕地的減少，我國糧食安全與資源消耗和環境保護的矛盾日益尖銳。肥料在農業生產中占據重要地位，但是在使用過程中存在一些不合理的因素，導致肥料的生產性能沒有得到有效地發揮，使得土壤肥力下降，肥料利用率降低，農業生產成本增加，效益降低，導致農產品品質下降，污染生態環境，加速土壤質量衰退，直接影響糧食持續增產、農業提質增效、農民節本增收和農產品質量安全。近年來，隨著微生物代謝工程的興起，植物基因表達調控方面的一些高活性化合物被不斷地從微生物中發現，這些化合物揭示了植物與微生物之間長期共同進化關系。通過調整逆境中植物基因的表達，使植物得以在逆境中健康生長，解決農業生態系統中土壤退化、氣候劇變等問題。白囊耙齒菌(Irpexlacteus)是一種腐生真菌，子實體一般生長在闊葉樹的枯木或腐朽木上，該菌種含有許多營養物質，如蛋白質、多糖、多肽等，具有免疫調節功能。該菌主要分布在吉林省的長白山、黑龍江、河北、山西、江西、甘肅、云南、福建、西藏等省區。目前，對于白囊耙齒菌的研究主要集中在其耐缺氧作用(CN104138395A)、抗疲勞作用(CN104138396A)和降解木質素的作用(CN105754881A)等；而對于白囊耙齒菌在促進作物生長、提高抗病性和肥料利用率方面還未見報道。技術實現要素：針對上述現有技術，本發明的目的是提供一株白囊耙齒菌及其應用。為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：根據本發明的第一方面，提供一株白囊耙齒菌，命名為白囊耙齒菌(Irpexlacteus)PR2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，菌種保藏號為CGMCCNO.13190。該菌株是從大興安嶺野生藍莓根部中分離得到，菌株在PDA培養基上，25℃培養一周，直徑80-85mm，菌落平坦，菌絲白色，平鋪，繩狀，邊緣羊毛狀。兩周后菌絲變成淡黃色，有宜人的水果香味。菌絲直徑2-4mm，菌絲有隔膜，著色深，均勻，且多分支，呈網狀。根據本發明的第二方面，提供一種植物誘抗劑，其活性成分為上述白囊耙齒菌(Irpexlacteus)PR2的發酵后菌絲體的乙醇提取物。本發明還提供上述植物誘抗劑的制備方法，包括：發酵上述的白囊耙齒菌(Irpexlacteus)PR2，將發酵液離心過濾，得到菌絲體的步驟；以及將菌絲體采用乙醇進行提取的步驟。上述制備方法中，發酵采用的發酵培養基的原料組成為：馬鈴薯提取液1000ml、酵母膏1.0g、蛋白胨3.0g、葡萄糖15.0g、瓊脂17.0g。所述馬鈴薯提取液的制備方法為：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000毫升。上述制備方法中，發酵的條件為：接種量為5-15％(體積百分數)、發酵培養溫度為20-30℃，培養4-6天；優選的，發酵的條件為：接種量為10％、發酵培養溫度為25℃，培養5天。上述制備方法中，乙醇提取的操作為：將菌絲體干燥、粉碎，加入乙醇冷浸20-30h，然后超聲提取0.5-1.5h；重復提取2-4次，合并濾液，即得。優選的，所述乙醇提取的操作為：將菌絲體在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小時，然后超聲提取2h；重復提取2次，合并濾液。所述乙醇的加入量為菌絲體(干燥后)重量的15-30％；每次提取加入乙醇的量相同。根據本發明的第三方面，提供上述白囊耙齒菌(Irpexlacteus)PR2和/或植物誘抗劑在促進農作物生長或者促進農作物增產中的應用。上述應用中，所述農作物為馬鈴薯、水稻或大姜。上述應用中，促進馬鈴薯增產的應用方法為：播種時，以本發明的植物誘抗劑10ml/畝噴溝；膨大期，以本發明的植物誘抗劑50ml/畝加氨基酸水溶肥，隨水滴灌。本發明的有益效果：本發明系首次從大興安嶺野生藍莓根部中分離、純化出一種白囊耙齒菌，利用液體有氧發酵獲得白囊耙齒菌的大量菌絲，以乙醇作為提取溶劑，通過超聲提取得到能夠促進作物根系生長、提高抗逆性、促進開花、提高產量和作物品質的天然物質，有利于進一步開發具有超高促生活性的天然化合物；而且整個生產過程中無三廢產生，低成本高效益，符合環保、糧食安全生產的社會需求。附圖說明圖1：PR2菌株菌落形態。圖2：PR2菌種的菌絲形態(40×0.65和100×1.4)。圖3：菌株PR2通過ITS序列分析建立的系統發育樹。具體實施方式下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規儀器、試劑、材料等，可通過正規商業途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規實驗方法，檢測方法等。實施例1：菌株的分離和鑒定1.菌株的分離與篩選：(1)菌株的分離取新鮮的大興安嶺野生藍莓根樣分別用流水沖洗干凈，用濾紙吸干水分，剪成適當大小，用無菌水沖洗3次，在10％的H2O2中消毒10min，用無菌水沖洗3遍，轉入6％的次氯酸鈉溶液中浸泡2min，然后用無菌水沖洗3～5遍，放在無菌的濾紙片上，吸干表面水分。用無菌剪刀剪成1cm左右的根段，接種到121℃高溫高壓滅菌30min后的PDA培養基上。置于23℃度培養箱培養3～10天后，即可見樣品切割過的邊緣長出菌絲，經平板反復分離、純化；直至每個平板上只含有統一特征的單一菌落。最后得到一株菌，編號為PR2；PDA培養基配方：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml。2.菌株PR2的形態及生物學特性測定將菌株PR2在PDA培養基上，25℃培養一周，直徑80-85mm，菌落平坦，菌絲白色，平鋪，繩狀，邊緣羊毛狀。兩周后菌絲變成淡黃色，有宜人的水果香味。菌絲直徑2-4mm，菌絲有隔膜，著色深，均勻，且多分支，呈網狀。該菌具有耙齒菌屬的特征，初步判定為白囊耙齒菌(Irpexlacteus)；(該菌的菌落形態如圖1所示，不同放大倍率下的菌株的菌絲形態如圖2所示(左圖放大倍率為40×0.65，右圖放大倍率為100×1.4)。3.菌株PR2的分子生物學鑒定以ITS1和ITS4為引物，對從野生藍莓根部中分離的真菌PR2菌株進行了擴增，并對擴增產物進行了測序；ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。擴增產物的序列如SEQIDNO.1所示，具體如下：基于blast搜索，選取與研究菌株序列最接近的種或最靠近的進化分支代表菌株的序列進行比對，利用Mega6.0軟件通過ML算法，利用bootstrap1000次建樹結果建立進化樹(如圖3所示)。結果表明PR2真菌與白囊耙齒菌(Irpexlacteus)的同源相似性達到99％，氨基酸序列的相似性也達到了94％。通過形態學鑒定和分子生物學鑒定，最終鑒定結果菌株PR2為白囊耙齒菌(Irpexlacteus)。將篩選分離得到的菌株命名為白囊耙齒菌(Irpexlacteus)PR2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，菌種保藏號為CGMCCNO.13190。實施例2：植物誘抗劑的制備具體制備方法如下：1.發酵培養：將4℃下保存在試管斜面上的實施例1分離保藏的白囊耙齒菌(Irpexlacteus)PR2的菌種，接到PDA培養基上，25℃培養一周，瓊脂挖塊接種于裝有50mLPDA培養液的250mL三角燒瓶，于25℃，180r/min下旋轉搖床上培養3天作為種子，以10％量接種入裝有150mL發酵培養基的500mL三角瓶中，同樣條件下培養5天，終止發酵，得種子液。PDA培養基配方：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml。發酵培養基配方：馬鈴薯提取液1.0L，酵母膏1.0g，蛋白胨3.0g，葡萄糖15.0g，瓊脂17.0g。馬鈴薯提取液的制備：取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000毫升。2.乙醇提取：將發酵液離心過濾，得菌絲體，將菌絲體在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小時，然后超聲提取2h；重復提取2次，合并濾液，即得植物誘抗劑。所述乙醇的加入量為菌絲體干燥后重量的20％；每次提取加入乙醇的量相同。實施例3：植物誘抗劑在馬鈴薯促生和增產中的應用1.試驗方法：馬鈴薯播種日期為2015年4月18-19日，播種密度為3300-3500株/畝，壟距55cm，株距35cm，切塊播種，種植時施用氨基酸水溶肥。實施過程中，馬鈴薯生長季農事操作與大田種植相同。處理1：常規處理，即：播種時，未添加內生菌提取液(即實施例2制備的植物誘抗劑)噴溝；膨大期，氨基酸水溶肥，隨水滴灌。處理2：播種時，內生菌提取液(即實施例2制備的植物誘抗劑)10ml/畝噴溝；膨大期，氨基酸水溶肥，隨水滴灌。處理3：播種時，內生菌提取液(即實施例2制備的植物誘抗劑)10ml/畝噴溝；膨大期，內生菌提取液(即實施例2制備的植物誘抗劑)50ml/畝加氨基酸水溶肥，隨水滴灌。每個處理重復3次。2.試驗結果：對苗期馬鈴薯出苗、株高、根系發育情況進行田間調查。在不同地段連續5m測產，重復5次。計算畝產量和增產率，結果如表1。表1不同處理對馬鈴薯生物性狀及產量的影響處理株高(cm)根長(cm)莖粗(cm)平均畝產(kg)增產處理129.5130.793587/處理23115.40.8037675.02％處理333170.91398010.96％由表1可知，處理3中馬鈴薯的生物性狀，比如株高、根長、莖粗，均比處理2和處理1有明顯增加，長勢旺盛。測產過程中，處理2比處理1增產5.02％，處理3的馬鈴薯增產幅度最大，達到10.96％。結果說明，內生菌提取液對馬鈴薯植株的生長和產量影響較大，效果明顯。實施例4：植物誘抗劑在水稻促生和增產中的應用1.試驗方法：本實驗于黑龍江省農墾總局進行，4月10日播種，10月5日成熟收獲。采用小區試驗法，不設重復，各處理單排單灌。試驗設計2個處理，每個處理100盤，具體安排如下：處理1、常規對照，苗床按常規管理正常施肥，不另施其他葉面調節肥；處理2、水稻秧苗2葉1心施用一次添加內生菌提取液(即實施例2制備的植物誘抗劑)的水溶性肥料，用量：每袋(5g/袋)兌水15L噴灑100個秧盤；移栽后15天噴施，4袋/畝。其他施肥時期和施肥量按常規管理。2.試驗結果：整理水稻生長指標、考種結果、產量和增產率，結果如表2、表3所示。表2水稻生長指標和考種結果的比較由表2可以看出，添加內生菌提取液水溶性肥料能明顯增加水稻分蘗，通過增加水稻穗數，達到提高產量的目的。表3不同處理對水稻產量構成因素的影響處理理論產量(公斤/畝)實際產量(公斤/畝)增產(公斤/畝)增產率％處理1620.93603.64--處理2661.17636.2332.595.40％由表3可以看出，處理2與處理1比較，增產32.59公斤/畝，增產率高達5.40％。說明該內生菌提取物對水稻生長有促進作用，提高水稻的接穗數和結實率，從而提高水稻畝產量和增產率。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術的技術人員在本發明披露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>泰安市煜達生物科技有限公司<120>一株白囊耙齒菌及其應用<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>643<212>DNA<213>PR2菌株<400>1tatgcttaagttcagcgggtagtcctacctgatttgagctcagattgtcaaatgattgtc60tcggcaaggagacggttcgaagcatgaacaccataaatacttcaacaccacagcgcagat120aattatcacactgaaggcgatccgtaagattcacgctaatgcatttcagaggagtcgacc1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