本發明屬于藥物技術領域，具體涉及氮雜環類化合物及其應用，尤其是具有NS3絲氨酸蛋白酶抑制活性的氮雜環類化合物及其制備預防和/或治療病毒感染疾病的藥物中的應用。
背景技術：
據統計，全球大約有1.3-1.7億人感染丙型肝炎病毒，大約是感染艾滋病毒人數的2倍。丙型肝炎病毒(HCV)感染可致嚴重的如肝硬化、肝癌等晚期肝病，嚴重威脅人類健康。目前，丙型肝炎病毒感染率較高的地區為在非洲及中東地區。
HCV隸屬于黃病毒(Flaviviridea)科，為單股正鏈RNA病毒，在核衣殼外包繞含脂質的囊膜，囊膜上有刺突。HCV的基因組長9500-10000bp，在5'非編碼區的下游緊接一開放的閱讀框(open reading frame，ORF)，其基因組排列順序為5'-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3'，能編碼約3010-3033個氨基酸的多聚蛋白前體，后者可經宿主細胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成10種病毒蛋白，包括結構蛋白和非結構蛋白。其中，結構蛋白參與病毒的組裝，而非結構蛋白包括NS2，NS3,NS4A，NS5A和NS5B，非結構蛋白對比病毒的生活周期非常重要，是病毒基因復制、表達的核心催化區域。NS3蛋白還具有螺旋酶活性，參與解旋HCV-RNA分子，以協助RNA復制；NS4的功能尚不清楚；NS5A是一種磷酸蛋白，可以與多種宿主細胞蛋白相互作用，對于病毒的復制起重要作用；而NS5B則具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，參與HCV基因組復制。NS2/NS3形成的連接由NS3的N末端180個氨基酸與NS2的含Zn2+的金屬蛋白酶催化裂解；NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A和NS5A/NS5B形成的連接由位于NS3的N末端的絲氨酸蛋白酶催化裂解。
NS3絲氨酸蛋白酶是HCV復制周期中的重要蛋白。研究表明，抑制NS3絲氨酸蛋白酶活性可以有效地抑制病毒的增殖與復制，因此，NS3絲氨酸蛋白酶成為了抗丙型肝炎病毒藥物研發的熱點。為了更好的滿足市場需求，本發明提供了一類新型的NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑。
技術實現要素：
鑒于上述現有技術存在的缺陷，本發明的目的是在于提供一種氮雜環類化合物，以開發成為一種新型的NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑，應用于因丙型肝炎病毒、登革熱病毒或西尼羅河病毒等病毒感染引起的相關疾病治療的領域中。
本發明的具體技術方案如下：
本發明提供了一種式(Ⅰ)所示的化合物：
或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、藥學上可接受的鹽、前藥、活性代謝物及代謝物的藥學上可接受的鹽及其混合物形式；
其中，為各自獨立的單鍵或雙鍵；
R1和R2獨立地選自芳基、取代芳基、雜芳基或取代雜芳基；
R3選自R5、-C(O)-R5、-S(O)-R5或-S(O)2-R5；
R4選自氫原子、鹵素、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、氧代、芳基、雜芳基、烷基、鹵代烷基、環烷基、雜烷基或雜環烷基；
n為0或1；
R5為芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基、環烷基、雜烷基或雜環烷基。
優選的，所述的化合物其具有如式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示結構：
其中，R1和R2獨立地選自芳基、取代芳基、雜芳基或取代雜芳基；
R3選自R5、-C(O)-R5、-S(O)-R5或-S(O)2-R5；
R4選自氫原子、鹵素、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、氧代、芳基、雜芳基、烷基、鹵代烷基、環烷基、雜烷基或雜環烷基；
R5為芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基、環烷基、雜烷基或雜環烷基。
優選的，所述芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基、環烷基、雜烷基、或雜環烷基中的一個或多個氫原子各自獨立被鹵素、硝基、氰基、氧代、氧代、烷基、雜烷基、環烷基、鏈烯基、鏈炔基、鹵代烯基、鹵代炔基、鹵代烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基、雜芳基、環烷基烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、環烷基雜烷基、雜環烷基雜烷基、芳基雜烷基、羥基、羥基烷基、烷氧基、烷氧烷基、烷氧芳基、烯氧基、炔氧基、環烷氧基、雜環烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、芳烷氧基、羧基、酰基、磺酰基、氨基、-C(O)OR6、-OC(O)R6、-COR6、-NHS(O)mR6、-NHC(O)R6、-NHC(O)OR6、-NR7R8、-OC(O)NR7R8、-OC(O)R7R8、-SH、-SR7所取代；
R6選自任選取代芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基、環烷基、雜烷基、雜環烷基；
R7和R8各自獨立地選自氫原子，任選取代芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基、環烷基、雜烷基、雜環烷基；
m為0、1或2。
優選的，R1為1-2個氫原子被包含羥基、鹵素中的一種或多種基團所取代的芳基；
R2為0-1個氫原子被包含鹵素、烷基中的一種基團所取代的芳基或雜芳基；
R3為R5、-C(O)-R5、-S(O)-R5和-S(O)2-R5中的一種；
R4為0-1個氫原子被包含鹵素、烷基中的一種基團所取代的氨基、烷基或芳基；
R5為0-1個氫原子被包含羥基、硝基、鹵素、烷基、烷氧基、鹵代烷基、芳基和-NR6R7中的一種基團所取代的芳基或雜芳基；
R6、R7為氫原子或烷基；R6和R7為獨立取代或連接成環。
進一步優選的，R1選自
優選的，R2選自
優選的，R3選自
優選的，R4為
或-NH2。
優選的所述的化合物具有以下其中之一的結構：
或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、藥學上可接受的鹽、前藥、活性代謝物及代謝物的藥學上可接受的鹽及其混合物。
本發明還提供了一種藥物組合物，包含上述的化合物。
進一步優選的，所述藥物組合物還包括抑制病毒增殖與復制的藥物和/或藥學上可接受的輔料。
本發明還提供了所述化合物或所述的藥物組合物在制備預防和/或治療病毒感染疾病中的應用。
優選的，所述病毒為黃病毒屬相關病毒。
進一步，優選的，所述病毒為丙型肝炎病毒、登革熱病毒和/或西尼羅河病毒。
上述氮雜環類化合物的各種異構體包括但不限于內消旋體、外消旋體、立體異構體、順反異構體和/或互變異構體。
本發明提供的氮雜環類化合物是一類新型的具有NS3絲氨酸蛋白酶抑制活性的化合物，制備過程操作簡單安全；經過抗病毒活性實驗測定，表明該類化合物具有良好的NS3絲氨酸蛋白酶抑制活性，具有開發成為一種新型的NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑的潛力，可應用于預防和治療因丙型肝炎病毒、登革熱病毒或西尼羅河病毒等黃病毒屬病毒感染引起的相關疾病。
具體實施方式
下面將結合本發明的實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例只是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本領域技術人員應當理解，對本發明的具體實施例進行修改或者對部分技術特征進行同等替換，而不脫離本發明技術方案的精神，均應涵蓋在本發明保護的范圍中。
本發明所使用的術語“任選取代的”與“取代或非取代的”這個術語可以交換使用。一般而言，術語“任選地”不論是否位于術語“取代的”之前，表示所給結構中的一個或多個氫原子被具體取代基所取代。除非其他方面表明，一個任選的取代基團可以有一個取代基在基團各個可取代的位置進行取代。當所給出的結構式中不只一個位置能被選自具體基團的一個或多個取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各個位置取代。其中所述的取代基可以是，但并不限于，羥基，氨基，鹵素，氰基，芳基，雜芳基，烷氧基，烷基，烯基，炔基，雜環基，巰基，硝基，芳氧基等等。
本發明使用的術語“烷基”或“烷基基團”，表示含1-20個碳原子的飽和直鏈或支鏈一價碳氫化合物原子團。其中所述烷基基團可以獨立任選地被一個或多個取代基所取代。除非另外詳細說明，烷基基團含有1-20個碳原子，其中一些實施例是，烷基基團含有1-10個碳原子，另外一些實施例是，烷基基團含有1-8個碳原子，另外一些實施例是，烷基基團含有1-6個碳原子，另外一些實施例是，烷基基團含有1-4個碳原子，另外一些實施例是，烷基基團含有1-3個碳原子。
烷基基團的實例包含，但并不限于，甲基(Me，-CH3)，乙基(Et，-CH2CH3)，正丙基(n-Pr，-CH2CH2CH3)，異丙基(i-Pr，-CH(CH3)2)，正丁基(n-Bu，-CH2CH2CH2CH3)，異丁基(i-Bu，-CH2CH(CH3)2)，仲丁基(s-Bu，-CH(CH3)CH2CH3)，叔丁基(t-Bu，-C(CH3)3)，正戊基(-CH2CH2CH2CH2CH3)，2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)，3-戊基(-CH(CH2CH3)2)，2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)，3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)，3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)，2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)，正己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)，3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))，2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)，3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)，4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)，3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)，2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)，2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)，3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)，正庚基，正辛基，等等。
本發明所使用的術語“烷基”和其前綴“烷”，都包含直鏈和支鏈的飽和碳鏈。
本發明涉及的氮雜環類化合物，其藥學上可接受的鹽，及其藥物制劑，對NS3絲氨酸蛋白酶，尤其是NS3絲氨酸蛋白酶調節的疾病或病癥的治療有潛在的用途。特別是，本發明涉及一種如式(I)所示的化合物：
或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、藥學上可接受的鹽、前藥、活性代謝物及代謝物的藥學上可接受的鹽及其混合物形式。
在一些實施方案，R1選自
在一些實施方案，R2選自
在一些實施方案，R3選自
在一些實施方案，R4為
或-NH2。
在另外一些實施方案，本發明涉及到以下其中之一的化合物或其立體異構體，幾何異構體，互變異構體，氮氧化物，水合物，溶劑化物，代謝產物，藥學上可接受的鹽或它的前藥，但絕不限于這些化合物：
本發明的藥物組合物的包括式((I)的化合物，優選為實施例1-4的化合物，尤其是本發明所列出的化合物。
像本發明所描述的，本發明的藥物組合物進一步包含藥學上可接受的輔料。這些像本發明所應用的，包括任何溶劑，稀釋劑，或其他液體賦形劑，分散劑或懸浮劑，表面活性劑，等滲劑，增稠劑，乳化劑，防腐劑，固體粘合劑或潤滑劑，等等。
本發明的藥物組合物進一步包含抑制病毒增殖與復制的藥物。所述抑制病毒增殖與復制的藥物可以與本發明的化合物分開給藥，作為多給藥方案的一部分。或者是單劑型的一部分，與本發明的化合物混合在一起形成單個組合物。
本發明的組合物可以是口服給藥，注射給藥，噴霧吸入法，局部給藥，經直腸給藥，經鼻給藥，含服給藥，陰道給藥或通過植入性藥盒給藥。
其中口服給藥可以是以任何可接受的口服劑型進行口服給藥，包括但并不限于，膠囊，片劑，水制懸浮液或溶液。
本發明的化合物將應用于病毒感染疾病預防和/或治療，進一步包括但并不限于，丙型肝炎病毒、登革熱病毒和/或西尼羅河病毒的病毒感染疾病。
在下列實施例中，除非另有指明外，所有溫度單位為攝氏度。使用的各種起始原料和試劑均來自市售，除非另有指明，市售原料和試劑均不經進一步純化直接使用；玻璃器皿用烘箱干燥和/或加熱干燥。薄層層析用硅膠板規格為0.15-0.2mm，柱層析用硅膠的規格為200-300目；質譜是用MS儀測定得到，離子化方式可為ESI或APCI。
一般地，本發明的化合物可以通過本發明所描述的方法制備得到，除非有進一步的說明，其中取代基的定義如式(I)所示。下面的反應方案和實施例用于進一步舉例說明本發明的內容。下面的部分實施例僅僅是用來說明具體化合物的合成方法。但在合成方法上并沒有任何限制。在實施例中未列出的化合物，也可以用與下面同樣的合成路線與合成方法，選擇適當的起始原料，在有必要的地方稍加適當的常識性的反應條件調整即可制備。
實施例1
合成路線：
第一步：中間體1c的合成
往250mL的圓底燒瓶中加入化合物1a(6g，0.0441mol)、化合物1b(4.85g，0.0441mol)、30％(mg/vol)氫氧化鈉乙醇溶液100mL，室溫攪拌反應8h；反應完畢后，將反應液倒入冰水中，用鹽酸調節反應液的pH至2-3，過濾，收集固體；將固體溶于二氯甲烷中，依次用飽和碳酸鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌，然后加入無水硫酸鈉進行干燥，過濾，濾液減壓濃縮，再用乙醇進行重結晶，得到7.6g化合物1c。
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ12.7(1H,s),8.02(1H,d),7.72(1H,d),7.34(1H,m),7.25(1H,m),7.13(1H,m),7.02(1H,dd),7.31(1H,t),6.92(1H,m),6.74(1H,t)。
第二步：中間體1d的合成
往250mL的圓底燒瓶中加入化合物1c(7.5g，0.035mol)、乙醇溶液50mL、水合肼(2.19g，0.035mol)，80℃攪拌反應3h；反應完畢后，將反應液置于4℃冰箱過夜；過濾，加入200mL乙醇/正己烷(3:1)重結晶，得到5.9g化合物1d。
第三步：產物NI-H-00023的合成
往50mL的圓底燒瓶中加入化合物1d(200mg，0.877mol)、四氫呋喃5mL、化合物1f(182mg，0.877mol)和DIEA(169mg，1.31mmol)，室溫下反應2h；反應完畢后，于反應液中加入30mL水和30mL乙酸乙酯，混勻，靜置分層，分離有機層，收集水層并加入乙酸乙酯萃取(2次，每次30mL)，合并有機層，濃縮蒸餾；再用制備薄層板進行刮板，得到化合物1。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ9.85(s,1H),7.90(d,2H),7.72(d,2H),7.41–7.21(m,2H),7.05–6.86(m,3H),6.61-6.60(dd,1H),6.02-5.98(dd,1H),3.89-3.81(m,1H),3.56-3.50(m,1H),2.43(s,3H).
實施例2
按照實施例1所述方法合成下述吡唑類化合物，如表1所示。
表1合成的具有NS3蛋白酶抑制活性的吡唑類化合物
實施例3
合成路線：
第一步：中間體2c的合成
往250mL的圓底燒瓶中加入化合物2a(3g，0.0195mol)、化合物2b(2.42g，0.0195mol)、30％(mg/vol)氫氧化鈉乙醇溶液50mL，室溫攪拌反應8h；反應完畢后，將反應液倒入冰水中，用鹽酸調節反應液的pH至2-3，過濾，收集固體；將固體復溶于二氯甲烷中，依次用飽和碳酸鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌，然后加入無水硫酸鈉進行干燥，過濾，濾液減壓濃縮，再用乙醇進行重結晶，得到4.3g化合物2c。
第二步：產物NI-H-00207的合成
往100mL的圓底燒瓶中加入鹽酸苯甲脒(60mg，0.385mmol)、碳酸鉀(112mg，0.809mmol)和乙醇溶液30mL；于上述反應液中緩慢滴加化合物2c(200mg，0.769mmol)的乙醇溶液15mL，90℃反應過夜；待反應液溫度降到室溫后，過濾，收集固體，再用水和乙醇洗滌，即得103mg化合物2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.56(s,1H),8.28-8.25(m,2H),8.05(s,1H),7.94(d,2H),7.75-7.71(m,2H),7.35(d,2H),7.51-7.48(m,1H),7.37(s,1H)7.08-7.06(m,1H),6.96(m,1H)。
實施例4
按照實施例3所述方法合成下述嘧啶類化合物，如表2所示。
表2合成的具有NS3蛋白酶抑制活性的嘧啶類化合物
實施例5 NS3絲氨酸蛋白酶抑制活性實驗
1、配制反應緩沖液，反應緩沖液成分為：HEPES 50mM,NaCl 150mM,甘油15％,Triton X-100 0.15％,DTT 10mM,PEG8000 0.1％,pH 7.5。
2、用DMSO將受試化合物稀釋成10μM或100μM。
3、然后在96孔板中加入NS3絲氨酸蛋白酶、緩沖液和上述配置好的受試化合物，使反應終體積為100uL。混勻，室溫預孵30min；設2組反應體系，每組設三次重復，并設空白對照。
4、在上述反應體系中分別加入HCV NS3/NS4特異性熒光多肽底物或WNV(西尼羅河病毒)NS3/NS4特異性熒光多肽底物使其終濃度為100nM，混勻后在室溫下孵育1h，再加入100μL 500mM的嗎啉乙磺酸終止反應。
5、采用酶標儀檢測反應體系中的熒光信號，激發波長設為340nm，發射波長設為615nm，記錄實驗結果。
表3部分受試化合物對NS3絲氨酸蛋白酶的抑制活性
注：受試化合物對NS3絲氨酸蛋白酶的抑制活性用抑制率表示
如表3結果顯示，當受試化合物的濃度設為10μM時，除了編號為NI-H-00035的化合物，表格中所示化合物對HCV的NS3絲氨酸蛋白酶的抑制率為7％～29％，對WNV的NS3絲氨酸蛋白酶的抑制率為8％～19％；當受試化合物的濃度設為100μM時，表格中所示化合物對HCV的NS3絲氨酸蛋白酶具有較強的抑制活性，抑制率為58％～73％，對HCV的NS3絲氨酸蛋白酶的抑制率為28％～59％。
表1以及表2中其他化合物在濃度為100μM時，對HCV以及WNV NS3蛋白酶的抑制率均低于20％。
實施例6抗病毒活性實驗
1、抗丙型肝炎病毒(HCV)活性實驗
(1)將含有HCV genotype 2(JFH1)的亞基因組RNA復制子的細胞株Huh7.5.1接種于96孔板中，每孔細胞數量為2×104個，置于CO2培養箱中培養24h后，加入采用DMSO梯度稀釋后的受試化合物，置于CO2培養箱中孵育48h后，測定化合物的EC50值。表4為部分化合物的EC50值。EC50為半最大效應濃度。
(2)將含有HCV genotype 1的亞基因組RNA復制子BM4-5細胞系細胞接種于96孔板中，每孔細胞數量為2×104個，置于CO2培養箱中培養24h后，加入采用DMSO梯度稀釋后的受試化合物，置于CO2培養箱中孵育48h后，測定化合物的EC50值。表4為部分化合物的EC50值。
2、抗登革熱病毒(DENV)活性實驗
將BHK-21細胞接種于96孔板中，每孔細胞數量為5×104個，置于CO2培養箱中培養24h后，加入含有海腎熒光素酶(Rluc)報告基因的DENV基因轉染BHK-21細胞，加入采用DMSO梯度稀釋后的受試化合物，置于CO2培養箱中孵育48h后，測定化合物的EC50。表4為部分化合物的EC50。
3、抗西尼羅河病毒(WNV)活性實驗
將Vero細胞系細胞接種于96孔板中，每孔細胞數量為8×104個，置于CO2培養箱中培養6h后，加入含有海腎熒光素酶(Rluc)報告基因的復制子全長WNV基因轉染Vero細胞，加入采用DMSO梯度稀釋后的受試化合物，置于CO2培養箱中孵育24h后，測定化合物的EC50。表4為部分化合物的EC50。
4、受試化合物對病毒孵育細胞的毒性實驗
將細胞株Huh 7.5.1、BM4-5細胞系細胞、BHK-21細胞和Vero細胞系細胞分別接種于96孔板中，每孔細胞數量依次設為2×104個、2×104個、5×104個和8×104個，置于CO2培養箱中培養6h后，將96孔板內的細胞培養基吸去，加入用培養基梯度稀釋后的受試化合物，將細胞放回培養箱，繼續培養48h后進行MTT細胞活性測試，測定化合物的CC50值。CC50為50％的細胞發生病變時的藥物濃度，部分化合物的CC50值見表4。
表4受試化合物在不同細胞系中的活性數據
注：n/d為尚未檢測；
如表4結果顯示，受試化合物NI-H-00023、NI-H-00035、NI-H-00246對丙肝病毒具有一定的抑制活性；而化合物NI-H-00003、NI-H-00005、NI-H-00247對登革熱病毒和西尼羅河具有一定的抑制活性；NI-H-00001、NI-H-00002、NI-H-000018、NI-H-00246對丙肝病毒、登革熱病毒及西尼羅河病毒均具有一定的抑制活性。而且所有受試化合物對病毒轉染細胞的細胞毒活性較小，具有進一步研究的價值。