靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細胞模型及其構建和應用的制作方法

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種藥物篩選細胞模型，具體涉及一種靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細胞模型及其構建和應用。
背景技術：
：乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴重的公共衛生問題，其涉及范圍廣泛，全球有近4億慢性感染患者，而慢性HBV感染可以導致肝硬化、肝細胞癌等嚴重后果，每年因此死亡者近百萬。HBV為直徑42nm的球形顆粒，呈雙層殼結構，外殼主要由三種表面蛋白(HBs)構成，內層核衣殼由核心蛋白(HBC)組成，為正20面體結構，該結構包含90或120個HBC二聚體，每個二聚體由兩個HBC單體組成。HBC在HBV復制過程中必不可少，它所構成的核衣殼是包裝pgRNA和病毒聚合酶的場所，另外，HBC還介導病毒基因組DNA進入細胞核，繼而生成cccDNA作為復制的初始模板。由于核衣殼對于HBV復制周期的完成不可或缺，因此，干擾核衣殼的正常形成也成為一種很有吸引力的治療策略。干擾核衣殼的形成，可以從兩個方面來考慮，一是干擾二聚體之間的相互作用，使得最終形成的核衣殼結構異常；二是干擾HBC單體之間形成二聚體，破壞核衣殼的結構基礎，從而阻礙核衣殼的形成。現有一些處于臨床前階段的藥物如HAPs，AT130，AT61等的作用機制是第一種，但目前尚缺乏靶向HBC二聚體形成的候選藥物。研發靶向HBC二聚體形成藥物的難點之一，是缺乏合適的藥物篩選細胞模型。一個好的篩選模型，需要滿足如下條件：(1)靶點明確；(2)所模擬的生物過程最大程度地接近自然狀態；(3)檢測過程簡單方便。然而，目前為止，還沒有一種模型能夠滿足這些要求。目前使用的篩選模型，要么是一些支持HBV復制的穩定細胞系，比如HepAD38，Hep2.2.15細胞等，它們的缺點是靶點不明確，檢測較繁瑣；要么使用原核表達的核心蛋白進行體外組裝，這種模型的缺點是與真正病毒的復制環境差別較大。申請人在前期專利申請中(專利申請公開號CN106188310A)建立了一種能指示HBC二聚體形成的新方法。該方法的核心策略是：利用兩個蛋白單體形成二聚體后，物理距離將非常靠近這一原理，將蛋白單體帶上一種距離敏感的信號，使得當兩個單體距離較遠時不發出信號，僅當其足夠靠近時才能發出信號，那么這種信號就可以用來指示二聚體的形成情況。具體來講，是將海腎熒光素酶(Rluc)基因分為N(1-229aa)，C(229-311aa)兩段，分別與核心蛋白基因通過長片段接頭融合，構建了兩種分別表達RlucN-HBC，RlucC-HBC的重組質粒，并通過實驗證明，RlucN-HBC及RlucC-HBC可形成二聚體，其發光信號可以反映二聚體的形成情況。技術實現要素：本發明的目的在于針對上述技術問題，提供一種質粒，所述質粒的核酸序列如SEQIDNo:1所示。本發明一方面提供了一種靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細胞模型，是將前述SEQIDNo:1所示的質粒酶切線性化，然后將該線性化片段轉染體外培養細胞，通過篩選得到的能夠表達具有Rluc熒光素酶活性的產物的細胞系。在上述技術方案中，所述體外培養細胞為HEK293細胞。在上述技術方案中，所述細胞系在四環素調控下表達具有Rluc熒光素酶活性的產物。本發明的另一方面提供了一種前述的靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細胞模型的構建方法，是將如SEQIDNo:1所示的質粒酶切線性化，然后將該線性化片段轉染體外培養細胞，篩選出能夠表達具有Rluc熒光素酶活性的產物的細胞系，即得。在上述細胞模型的構建方法中，所述體外培養細胞為HEK293細胞。在上述細胞模型的構建方法中，篩選出的細胞系是在四環素調控下表達具有Rluc熒光素酶活性的產物。本發明的另一方面提供了一種前述的靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細胞模型在篩選抑制HBC二聚體形成的化合物中的應用。本發明利用了分裂的海腎熒光素酶。海腎熒光素酶(Rluc)是一種從海洋動物海腎中分離到的蛋白質分子，能催化腔腸熒光素發生化學反應，從而發出綠色熒光。Rluc全長311個氨基酸，重組表達的Rluc常用作報告基因，廣泛用于生物醫學研究。前人研究證明，將Rluc從第229位氨基酸分成N、C兩段以后，各自將失去催化活性，但若通過某種手段將兩段復合后，則能部分恢復其酶活性。利用這一特性，這種分裂的Rluc可被用來指示蛋白分子間的相互作用。申請人在之前的專利申請中將海腎熒光素酶(Rluc)基因分為N(1-229aa)，C(229-311aa)兩段，分別與核心蛋白基因通過長片段接頭融合，構建了兩種分別表達RlucN-HBC，RlucC-HBC的重組質粒。實驗證明，RlucN-HBC及RlucC-HBC可形成二聚體，其發光信號可以反映二聚體的形成情況。在本發明中，我們以前期構建的質粒RlucN-HBC和RlucC-HBC為基礎，對其做進一步構建和改造，使RlucN-HBC及RlucC-HBC在同一個載體上實現四環素調控下的表達，然后，利用該載體轉染HEK293細胞，篩選并鑒定出穩定表達細胞NCTP6，該細胞株即可作為靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細胞模型。本發明的有益效果是：本發明得到的質粒NCTPuro可以成功應用于藥物篩選模型細胞系NCTP6的構建當中，構建的藥物篩選模型細胞系NCTP6經實驗證明能夠在四環素調控下表達具有Rluc熒光素酶活性的產物，成功篩選出了能夠抑制HBC二聚體形成的化合物。利用該細胞模型可以方便快捷地對影響HBC二聚體形成的化合物進行初篩，篩選到的化合物若能夠阻止HBC二聚體的形成，則亦可能有效地阻止乙肝病毒的復制，那么可以據此開發阻止HBC二聚體形成的藥物來治療乙肝，在乙肝病毒相關科學研究以及抗病毒藥物篩選方面有非常好的應用價值。附圖說明圖1是質粒pTRE-RN-RC構建流程示意圖。圖2是質粒NCTPuro構建流程示意圖。圖3是穩定細胞系NCTP6的構建流程示意圖。圖4是篩選細胞系NCTP6過程中細胞克隆的Rluc熒光素酶活性表達檢測結果。圖5是四環素撤除后細胞克隆中Rluc活性隨時間變化結果圖。圖6是用本發明細胞模型進行化合物篩選的流程示意圖。圖7是用本發明細胞模型進行化合物初步篩選的部分結果圖。具體實施方式本發明實施例中所用試劑來源如下：2×PrimeSTARHSMix：Takara公司，日本膠回收試劑盒、基因組DNA提取試劑盒：QIAGEN公司，德國質粒模板PTRE-HBV1.1由美國印第安納大學醫學院郭海濤教授贈送質粒模板pXPR由美國麻省理工大學張峰博士實驗室構建，從Addgene購買大腸桿菌JM109、Rellina熒光素酶檢測試劑盒、Glomax熒光素酶檢測儀：Promega公司，美國BsmBI、Tangobuffer、DTT、Puromycin：Thermoscientific公司，美國DMEM：GIBICO公司，美國T7ligase：Enzymatics公司，美國ATP、NotI內切酶：NewEnglandBiolabs公司，美國X-tremeGENETMHPDNA轉染試劑：Roche公司，德國HEK293細胞：美國模式菌種收集中心HepAD38細胞：由四川大學華西醫院唐紅教授贈送本發明實施例中所用擴增引物序列如下：實施例一、構建質粒NCTPuro本申請中使用到的質粒RlucN-HBC和RlucC-HBC和申請人在前期的專利申請(公開號CN106188310A，申請號CN201610564291.6)中構建的質粒RlucN-HBC和RlucC-HBC相同。質粒NCTPuro需實現以下功能：(1)能表達RlucN-HBC和RlucC-HBC；(2)RlucN-HBC和RlucC-HBC的表達都受四環素控制，為了實現這一點，RlucN-HBC和RlucC-HBC表達框需置于四環素響應元件+MiniCMV啟動子下游，且需表達四環素控制的轉錄激活蛋白(tTA)；(3)需帶有方便穩定轉染細胞篩選的抗puromycin抗性基因。該質粒的構建步驟如下：一、構建質粒PTRE-RlucN構建質粒PTRE-RlucN，將驅動RlucN-HBC表達的啟動子CMV替換為TRE-miniCMV啟動子，按照如下步驟操作：1、以質粒PTRE-HBV1.1為模板，進行PCR擴增，反應體系為：質粒PTRE-HBV1.110ng，引物Fptregg3(10μM)及RBsmb1vect(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補齊體積至50μl。反應條件：95℃預變性3min；94℃15s，58℃15s，72℃20s，35個循環。用膠回收試劑盒回收擴增片段，將該回收片段命名為frag1。2、第二個片段的擴增，以RlucN-HBC為模板進行PCR。反應體系為：質粒RlucN-HBC10ng，引物FrlucNGG(10μM)及Ramp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補齊體積至50μl。反應條件：95℃預變性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min30s，35個循環。用膠回收試劑盒回收擴增片段，將該回收片段命名為frag2。3、第三個片段的擴增，以RlucN-HBC為模板進行PCR。反應體系為：模板RlucN-HBC10ng，Famp(10μM)及RCMVGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補齊體積至50μl。反應條件：95℃預變性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，35個循環。用膠回收試劑盒回收擴增片段，將該回收片段命名為frag3。4、將以上得到的三個片段frag1、frag2和frag3做Goldengate連接反應，反應體系為：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag12μl(40ng)frag22μl(100ng)frag32μl(80ng)總體積10μl反應條件：37℃5min，20℃5min，循環25次；80℃20min滅活反應。將Goldengate產物轉化JM109感受態細菌，涂板，克隆初篩，測序鑒定，正確的克隆命名為質粒PTRE-RlucN，其結構如圖1中所示。二、構建質粒PTRE-RlucC構建質粒PTRE-RlucC，將驅動RlucN-HBC表達的啟動子CMV替換為TRE-miniCMV啟動子。構建步驟與上述PTRE-RlucN的構建步驟類似，使用的frag1和frag3即是PTRE-RlucN構建過程中的frag1和frag3。另一個片段frag4的擴增是以RlucC-HBC為模板進行PCR，反應體系為：模板RlucC-HBC10ng，FrlucCGG(10μM)及RCMVGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補齊體積至50μl。反應條件：95℃預變性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min30s，35個循環。用膠回收試劑盒回收擴增片段，將該回收片段命名為frag4。將以上得到的三個片段frag1、frag4和frag3做Goldengate連接反應，反應體系為：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag140ngfrag490ngfrag380ngddH2O補齊至10μl總體積10μl反應條件：37℃5min，20℃5min，循環25次；80℃20min滅活反應。將Goldengate產物轉化JM109感受態細菌，涂板，克隆初篩，測序鑒定，正確的克隆命名為質粒PTRE-RlucC，其結構如圖1中所示。三、質粒PTRE-RN-RC構建質粒PTRE-RN-RC是以前述兩個質粒PTRE-RlucN和PTRE-RlucC為基礎構建的，目的是將RlucN和RlucC的表達片段克隆到同一個質粒上。首先以PTRE-RlucC為模板，用引物FCMV55和RSV40GG3擴增片段frag5，然后以PTRE-RlucN為模板，用引物Fpch9gg和Ramp擴增片段frag6，以PTRE-RlucN為模板，用引物Rpch9gg和Famp擴增片段frag7，再將片段frag5，frag6和frag7做Goldengate連接反應，最終測序鑒定正確的質粒命名為PTRE-RN-RC(其構建過程和其結構如圖1中所示)。片段frag5的擴增體系為：模板PTRE-RlucC10ng，FCMV55(10μM)及RSV40GG3(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補齊體積至50μl。反應條件：95℃預變性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，35個循環。片段frag6的擴增體系為：模板PTRE-RlucN10ng，Fpch9gg(10μM)及Ramp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補齊體積至50μl。反應條件：95℃預變性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，35個循環。片段frag7的擴增體系為：模板PTRE-RlucN10ng，Rpch9gg(10μM)及Famp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補齊體積至50μl。反應條件：95℃預變性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min30s，35個循環。Goldengate連接反應的反應體系為：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag560ngfrag660ngfrag7100ngddH2O補齊至10μl總體積10μl反應條件：37℃5min，20℃5min，循環25次；80℃20min滅活反應。四、質粒PCH9-tTA構建PCH9-tTA是能表達四環素調控轉錄激活因子的質粒，我們從HepAD38細胞基因組中擴增tTA基因，并將其克隆PCH9上。按照如下步驟操作：1、用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒提取HepAD38細胞的基因組DNA，然后以其為模板擴增tTA基因。反應體系為：HepAD38細胞基因組DNA500ng，FTta(10μM)及RTta(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補齊體積至50μl。反應條件：95℃預變性5min；94℃30s，55℃15s，72℃1min，35個循環。用膠回收試劑盒回收擴增片段，將該回收片段命名為frag8。2、以RlucN-HBC為模板，擴增PCH9的質粒骨架片段：反應體系為：模板RlucN-HBC10ng，FSV40GG2(10μM)及RBsmb1vect(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補齊體積至50μl。反應條件：95℃預變性3min；94℃15s，57℃15s，72℃2min，35個循環。用膠回收試劑盒回收擴增片段，將該回收片段命名為frag9。3、將以上得到的兩個片段frag8和frag9做Goldengate連接反應，反應體系為：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag850ngfrag9120ngddH2O補齊至10μl總體積10μl反應條件：37℃5min，20℃5min，循環25次。80℃20min滅活反應。Goldengate產物轉化JM109感受態細菌，涂板，克隆初篩，測序鑒定，正確的克隆命名為質粒PCH9-tTA，其結構如圖2中所示。五、質粒PCH9-puro構建以質粒pXPR為模板，擴增puromycin抗性基因片段。反應體系為：模板pXPR10ng，FpuroGG(10μM)及RpuroGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補齊體積至50μl。反應條件：95℃預變性3min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35個循環。用膠回收試劑盒回收擴增片段，將該回收片段命名為frag10。將frag10與前述片段frag9做Goldengate連接反應(反應體系與反應條件參照frag8和frag9的Goldengate連接反應)，轉化所得克隆經測序驗證后命名為PCH9-puro。六、質粒tTA-puro構建為了將tTA和puro抗性基因表達片段克隆到同一個質粒上，首先以PCH9-puro為模板，用引物FCMV55和RSV40GG3擴增片段frag11，然后以PCH9-tTA為模板，用引物Fpch9gg和Ramp擴增片段frag12，以PCH9-tTA為模板，用引物Rpch9gg和Famp擴增片段frag13，再將片段frag11，frag12和frag13做Goldengate連接反應，最終測序鑒定正確的質粒命名為tTA-puro(其結構如圖2中所示)。PCR反應的擴增體系和反應條件、以及Goldengate反應體系和條件參照“三、質粒PTRE-RN-RC構建”中的反應。七、質粒NCTPuro構建首先，以tTA-puro為模板，用引物FCMVup(帶有NotI酶切位點)及Ramp擴增得到片段frag14，然后以前述構建的質粒PTRE-RN-RC為模板，用引物Famp及Rpch9GG2擴增片段frag15，再將片段frag14和frag15做Goldengate連接反應，最終測序鑒定正確的質粒命名為NCTPuro(其構建過程和其結構如圖2中所示)，其核酸序列如SEQIDNo:1所示。frag14擴增體系：模板PTRE-RN-RC10ng，FCMVup(10μM)及Ramp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補齊體積至50μl。反應條件：95℃預變性3min；94℃15s，58℃15s，72℃2min30s，35個循環。frag15的擴增體系：模板PTRE-RN-RC10ng，Famp(10μM)及Rpch9GG2(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補齊體積至50μl。反應條件同frag14的PCR反應條件。Goldengate反應體系和條件參照“四、質粒PCH9-tTA構建”中的反應。實施例二、四環素調控的RlucN-HBC與RlucC-HBC共表達穩定細胞系構建為了方便后續藥物篩選，需構建RlucN-HBC與RlucC-HBC共表達的穩定細胞系(該方法步驟流程如圖3所示)，按照如下步驟操作：1、首先用NotI內切酶將20μg實施例一中構建的NCTPuro質粒酶切線性化，然后將該線性化片段轉染HEK293細胞(6cm培養皿)，48小時后，開始用2μg/mlPuromycin篩選，篩選3天后，將存活細胞用胰酶消化，以有限稀釋法稀釋接種至96孔板，繼續篩選約2周，待細胞克隆長大后鑒定。2、將最終獲得的20個單克隆細胞進行鑒定，分別將這些細胞接種到96孔板，并分別用含有和不含有2μg/ml四環素的培養基培養48小時后，將細胞裂解，檢測裂解液中的Rluc熒光素酶活性。如圖4所示，在20個細胞克隆中，6號克隆和8號克隆在用無四環素培養基培養時，與用含四環素的培養基相比，Rluc熒光素酶活性顯著上升(>100倍)，其中6號克隆這種差異更顯著。這證明6號和8號克隆可以表達具有Rluc熒光素酶活性的產物，并且其表達受到四環素調控，是滿足我們需求的細胞克隆。我們進一步檢測了四環素撤除后，6號隆中的Rluc活性隨時間變化情況，如圖5所示，隨著四環素撤除時間延長，Rluc活性逐漸升高，4天后信號值可達到約400,000，而未撤除四環素的細胞，熒光素酶信號則一直處于背景水平。最終選擇6號克隆作為后續藥物篩選的細胞，將其命名為細胞系NCTP6。實施例三、利用NCTP6進行初步藥物篩選在獲得穩定細胞系NCTP6以后，即可用于藥物篩選。我們利用該細胞，篩選了一個含有218種天然化合物的庫，篩選流程如下：復蘇NCTP6細胞，用含2μg/ml四環素的DMEM培養基培養于10cm培養皿中。在接種前一天，將培養基更換為無四環素DMEM培養基。第二天上午，將細胞以約90％匯合度接種于96孔板。細胞接種后約6小時待細胞貼壁，將待測化合物分別加入96孔板中，終濃度為20μM，每種化合物做3個復孔。加藥后約48小時，吸去培養基，每孔加入細胞裂解液，室溫搖動孵育20min，然后取裂解液用熒光素酶檢測儀進行檢測(操作流程如圖6所示)。在篩選的218種天然化合物中，能使Rluc活性降低3倍或以上的化合物共有32種(圖7a、7b顯示了部分篩選結果)，除去那些能引起明顯細胞死亡的，有7種化合物可以作為下一步深入研究的對象。能使Rluc活性升高2倍以上的化合物有2種，它們也可以作為候選化合物進行更深入研究。這些篩選結果表明，不同化合物對NCTP6細胞中的Rluc活性有不同影響，該細胞模型可以方便快捷地對影響HBC二聚體形成的化合物進行初篩。序列表<110>重慶醫科大學<120>靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細胞模型及其構建和應用<130>1<160>19<210>1<211>11147<212>DNA<213>人工序列<223>質粒NCTPuro的核酸序列<400>1cgtttaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggcc1ctttcgtcttcactcgaatatctgcaggcgtatcacgaggccctttcgtcttcactcgag120tttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcag180tgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaa240gtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgg300gtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcgtcgagcaccagcacctgcaac360tttttcacctctgcctaatcatctcttgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgt420gccttgggtggctttggggcatgacttcgaaagtttatgatccagaacaaaggaaacgga480tgataactggtccgcagtggtgggccagatgtaaacaaatgaatgttcttgattcattta540ttaattattatgattcagaaaaacatgcagaaaatgctgttatttttttacatggtaacg600cggcctcttcttatttatggcgacatgttgtgccacatattgagccagtagcgcggtgta660ttataccagaccttattggtatgggcaaatcaggcaaatctggtaatggttcttataggt720tacttgatcattacaaatatcttactgcatggtttgaacttcttaatttaccaaagaaga780tcatttttgtcggccatgattggggtgcttgtttggcatttcattatagctatgagcatc840aagataagatcaaagcaatagttcacgctgaaagtgtagtagatgtgattgaatcatggg900atgaatggcctgatattgaagaagatattgcgttgatcaaatctgaagaaggagaaaaaa960tggttttggagaataacttcttcgtggaaaccatgttgccatcaaaaatcatgagaaagt1020tagaaccagaagaatttgcagcatatcttgaaccattcaaagagaaaggtgaagttcgtc1080gtccaacattatcatggcctcgtgaaatcccgttagtaaaaggtggttcgtctggatcag1140gcggtggcggttcaggaggtggtggctcaggcggaggaggttccggtggcggcggcagtg1200gtggtggaggctctggtggtggaggctctggaggcgg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