一種構建Hi?C高通量測序文庫的方法與流程

本發明屬于生物化學領域，具體涉及一種構建Hi-C高通量測序文庫的方法。

背景技術：

經典染色質構象捕獲(Chromosome conformation capture，3C)技術是一種通過定量手段(PCR產物的有和無、產量的高和低)對DNA之間是否存在相互作用以及作用強度這一定性、定量問題進行研究的技術，其主要經過甲醛交聯、酶切、連接、解交聯、DNA純化與PCR鑒定與定量等步驟。通過一對與選定的兩段DNA分別配對的引物進行PCR擴增，根據PCR產物的有無、產量的高低等，就可以對是否存在相互作用以及相互作用的強弱進行判斷。高通量染色質構象捕獲技術(Hi-C技術)是染色質構象捕獲的一種衍生技術，是指基于高通量測序進行全基因組染色質構象的捕獲。在Hi-C技術中，以整個細胞核為研究對象，利用高通量測序技術，結合生物信息學方法，研究全基因組范圍內整個染色質DNA在空間位置上的關系即空間三維高級結構；通過對染色質內全部DNA相互作用模式進行捕獲，獲得高分辨率的染色質三維結構信息，把基因表達調控引入到空間的、全局性的研究層面，為全面解析與DNA有關的生物學過程的機理開啟新的契機。

Hi-C技術自從2009年問世以來，雖然經過了諸如從溶液中連接到原位連接等改進，但是目前仍然存在諸多不足，如不易于標準化、結果不穩定、建庫步驟繁瑣、建庫時間長、數據質量較差等等。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是如何構建優質的Hi-C高通量測序文庫。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了構建Hi-C高通量測序文庫的方法。

本發明所提供的構建Hi-C高通量測序文庫的方法，具體可為方法一，依次包括如下步驟：

(1)取解交聯后的DNA，進行純化和富集；

(2)進行轉座反應；

(3)進行PCR擴增，獲得文庫。

本發明所提供的構建Hi-C高通量測序文庫的方法，具體可為方法二，依次包括如下步驟：

(1)取解交聯后的DNA，進行純化；

(2)超聲處理，進行富集；

(3)進行轉座反應；

(4)進行PCR擴增，獲得文庫。

上述方法中，所述轉座反應的反應體系可包括：完成上一步驟的DNA和轉座酶。

所述完成上一步驟的DNA具體可為將解交聯后的DNA進行純化和富集，得到的DNA。

所述完成上一步驟的DNA具體可為將解交聯后的DNA，進行純化；然后超聲處理，進行富集，得到的DNA。

上述方法一或方法二中，所述轉座反應的反應體系可由完成所述富集的DNA、轉座酶和轉座酶緩沖液組成。

上述方法一或方法二中，所述轉座反應的反應體系可由完成所述富集的DNA、轉座酶和轉座酶緩沖液和水組成。

所述轉座酶可為Tagment DNA Enzyme。所述轉座酶緩沖液可為2×Tagment DNA buffer。所述2×Tagment DNA buffer和所述Tagment DNA Enzyme均為Nextra DNA prep kits中的組件；Nextra DNA prep kits為Illumina公司的產品，產品目錄號為FC-121-1030。

25μL所述轉座反應的反應體系由完成所述富集的DNA、12.5μL 2×Tagment DNA buffer、1μL Tagment DNA Enzyme和11.5μL ddH₂O組成。

上述方法一或方法二中，所述轉座反應的條件可為：37℃3min。

上述方法一或方法二中，所述“進行轉座反應”之后、所述“進行PCR擴增，獲得文庫”之前，還包括步驟(A)：從完成所述轉座反應的體系中分離DNA。

上述方法一或方法二中，所述“進行PCR擴增，獲得文庫”的具體步驟可依次如下：

(a)制備反應體系甲；所述反應體系甲由緩沖液和ddH₂O組成；

(b)取所述反應體系甲，95-100℃處理40-50s；

(c)制備反應體系乙；所述反應體系乙由完成步驟(b)的體系、上游引物、下游引物和從完成所述轉座反應的體系中分離的DNA組成；

(d)取所述反應體系乙，進行PCR擴增。

所述步驟(a)中，所述緩沖液可為2×KAPA HiFi hotstart mix。38μL所述反應體系甲具體可由25μL 2×KAPA HiFi hotstart mix和13μL ddH₂O組成。

所述步驟(b)具體可為：取所述反應體系甲，98℃處理45s。

所述步驟(c)中，所述上游引物可為Nextra Primer 1.0：5’

-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-3’，下游引物可為Nextra Primer 2.1：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT-3’或Nextra Primer 2.2：5’

-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT-3’。50μL所述反應體系乙具體可由38μL完成步驟(b)的體系、1μL濃度為25μM的Nextra Primer 1.0、1μL濃度為25μM的Nextra Primer 2.1或Nextra Primer 2.2、和10μL從完成所述轉座反應的體系中分離的DNA的水溶液組成。

所述步驟(d)中，所述PCR擴增的反應程序為：72℃延伸5min；98℃變性30s；98℃變性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15個循環；72℃延伸1min。

上述方法二中，所述超聲處理的參數可為：超聲頻率35％；超聲1s，停1s，超聲總時間可為200s。

上述方法一或方法二中，所述“解交聯后的DNA”的制備方法依次包括如下步驟：

(1)用甲醛固定生物細胞核染色質；

(2)裂解所述生物細胞，收集細胞核；

(3)限制性內切酶酶切；

(4)加入生物素化的脫氧核糖核苷酸，連接；

(5)加入蛋白酶K，解交聯。

所述生物可為細菌、植物或動物。所述細菌具體可為冰島硫化葉菌REY15A。

所述限制性內切酶可為限制性內切酶HindIII。

所述生物素化的脫氧核糖核苷酸可為Bio-16-dCTP。Bio-16-dCTP具體可為Trilink公司的產品，產品目錄號為N5002。

本發明還保護一種含有轉座酶的試劑盒；該試劑盒可用于構建Hi-C高通量測序文庫。所述轉座酶可為所述Tagment DNA Enzyme。

實驗表明，采用本發明提供的方法構建的Hi-C高通量測序文庫的結果穩定可靠，而且數據質量更高(可用連接片段數均較多，酶切片段中可用連接片段數較多等等)，更易標準化，步驟更少(本發明所提供的方法構建Hi-C高通量測序文庫只需經過轉座反應即可進行PCR鑒定，而常規方法構建Hi-C高通量測序文庫需經過末端補平、加“A”和連接接頭等步驟才可進行PCR鑒定)，時間更短(采用常規方法構建Hi-C高通量測序文庫的時間為1-2d，采用本發明所提供的方法構建Hi-C高通量測序文庫的時間約3h)，更節約資源(采用常規方法構建Hi-C高通量測序文庫的步驟較多，因此DNA樣品損失也較多)。因此，本發明所提供構建Hi-C高通量測序文庫的方法具有重要的應用價值。

附圖說明

圖1為DNA測序溶液甲中可用連接和冗余的片段數和比例。

圖2為DNA測序溶液甲中基于酶切片段的比對統計情況。

圖3為DNA測序溶液甲中片段比對后的統計情況。

圖4為DNA測序溶液甲的分辨率。

圖5為DNA測序溶液乙中可用連接和冗余的片段數和比例。

圖6為DNA測序溶液乙中基于酶切片段的比對統計情況。

圖7為DNA測序溶液乙中片段比對后的統計情況。

圖8為DNA測序溶液乙的分辨率。

圖9為DNA測序溶液丙中可用連接和冗余的片段數和比例。

圖10為DNA測序溶液丙中基于酶切片段的比對統計情況。

圖11為DNA測序溶液丙中片段比對后的統計情況。

圖12為DNA測序溶液丙的分辨率。

圖13為DNA測序溶液甲與DNA測序溶液丙的染色質覆蓋度一致性分析。

圖14為DNA測序溶液乙與DNA測序溶液丙的染色質覆蓋度一致性分析。

圖15為DNA測序溶液甲與DNA測序溶液乙的染色質覆蓋度一致性分析。

圖16為DNA測序溶液甲與DNA測序溶液丙的相互作用一致性分析。

圖17為DNA測序溶液乙與DNA測序溶液丙的相互作用一致性分析。

圖18為DNA測序溶液甲與DNA測序溶液乙的相互作用一致性分析。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

DSM88培養基：將(NH4)₂SO₄ 1.300g、KH₂PO₄ 0.280g、MgSO₄·7H₂O 0.250g、FeCl₃·6H₂O 0.020g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.025mg、CaCl₂·2H₂O 0.070g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.025mg、FeCl₃0.280mg、CuSO₄ 0.016mg、MnSO₄·H₂O 2.200mg、H₃BO₃ 0.500mg、ZnSO₄·7H₂O0.500mg、CoCl₂·6H₂O 0.046mg、CaSO₄·H₂O 60.000mg、Tryptone 1.000g和Yeast extract 1.000g溶于1L蒸餾水，pH值調至3.5；121℃滅菌15min。

冰島硫化葉菌REY15A記載于如下文獻中：Li Guo.，et al.Genome Analyses of Icelandic Strains of Sulfolobus islandicus，Model Organisms for Genetic and Virus-Host Interaction Studies.JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Apr.2011，p.1672-1680.(文獻中冰島硫化葉菌REY15A的名稱為S.islandicus strains REY15A)。公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所(即申請人處)獲得，以重復本實驗。

pH7.4、1×PBS緩沖液的制備方法為：向800mL去離子水中加入0.27g磷酸二氫鉀、1.42g磷酸氫二鈉、8.00g氯化鈉和0.20g氯化鉀，充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調節pH值至7.4，最后加入去離子水定容至1L。

限制性內切酶HindIII為NEB公司的產品。10×NEB2.1buffer、2×快速連接酶buffer和DNA快速連接酶均為NEB公司的產品，產品目錄號分別為B7202S、B6058S和M2200S。10×T4DNA連接酶buffer、T4DNA連接酶和RNase A均為Thermo Fisher Scientific的產品。MyOne^TM Streptavidin C1為Thermo Fisher公司的產品，產品目錄號為65001。QIAGEN PCR純化試劑盒、QIAGEN MinElute PCR純化試劑盒和QIAGEN MinElute膠回收試劑盒均為QIAGEN公司的產品，產品目錄號分別為28104、28004和28604。Ready-Lyse^TMLysozyme為Epicentre公司的產品，產品目錄號為R1804M。6×loading buffer為TransGen公司的產品，產品目錄號為GH101-01。測序儀為Illumina公司的產品，產品型號為HiSeq X Ten。2×Tagment DNA buffer和Tagment DNA Enzyme均為Nextra DNA prep kits中的組件；Nextra DNA prep kits為Illumina公司的產品，產品目錄號為FC-121-1030。2×KAPA HiFi hotstart mix為KAPABIOSYSTEMS公司的產品，產品目錄號為KK2601。DNA聚合酶I(Klenow大片段)的商品名稱為“DNA Polymerase I,Large(Klenow)Fragment”，具體為NEB公司的產品，產品目錄號為M0210L。T4DNA聚合酶的商品名稱為T4DNA Polymerase，具體為NEB公司的產品，產品目錄號為M0203L。Klenow片段(3’→5’exo-)的商品名稱為Klenow Fragment(3’→5’exo-)，具體為NEB公司的產品，產品目錄號為M0212L。Bio-16-dCTP為Trilink公司的產品，產品目錄號為N5002。

1×B&W buffer為含2M NaCl和0.5mM EDTA的pH7.5、5mM Tris-HCl緩沖液。2×B&W buffer為含4M NaCl和1mM EDTA的pH7.5、10mM Tris-HCl緩沖液。終止反應緩沖液：含0.2％(0.2mg/mL)SDS和1mM EDTA的pH8.0、10mM Tris-HCl緩沖液。

實施例1、冰島硫化葉菌REY15A的Hi-C高通量測序文庫的兩種構建方法的比較

一、采用本發明提供的方法構建冰島硫化葉菌REY15A的Hi-C高通量測序文庫

1、甲醛交聯

(1)取冰島硫化葉菌REY15A的菌液，接種(接種量為1％(v/v))至DSM88培養基，得到初始菌液(體積為50mL)；初始菌液中，冰島硫化葉菌REY15A的濃度為1.0×10⁵cfu/mL。

(2)取步驟(1)得到的初始菌液，78℃、220rpm振蕩培養6h，得到OD_600nm值為0.4-0.6的培養菌液。

(3)向步驟(2)得到的培養菌液中加入1.39mL 37％(v/v)甲醛水溶液，得到混合溶液甲(混合溶液甲中甲醛的濃度為1％(v/v))；然后置于78℃，靜置10min，得到交聯體系。

(4)向步驟(3)得到的交聯體系中加入3.2mL濃度為2M的甘氨酸水溶液，得到混合溶液乙(混合溶液乙中甘氨酸的濃度為0.125M)；然后室溫靜置5min，得到終止體系。

(5)取步驟(4)得到的終止體系，室溫、2500g離心10min，收集菌體并轉移至康寧管(規格為15mL)。

(6)向完成步驟(5)后的康寧管中加入10mL pH7.4、1×PBS緩沖液，輕輕吹吸混勻，室溫、2500g離心10min，棄上清。

(7)向完成步驟(6)后的康寧管中加入10mL pH7.4、1×PBS緩沖液，輕輕吹吸混勻，室溫、2500g離心10min，棄上清。

(8)向完成步驟(7)后的康寧管中加入1mL pH7.4、1×PBS緩沖液進行重懸，得到重懸液。采用Bio-RAD細胞計數儀對重懸液中的細胞進行計數。

2、裂解

(1)取100μL步驟1中(8)得到的重懸液(含1×10⁹個細胞)，室溫，2500rpm離心去上清后，再用100μL的1×TE緩沖液(含1mM EDTA的pH8.0、10mM Tris-HCl緩沖液)溶解，得到待裂解菌體。

(2)向步驟(1)得到的待裂解菌體中加入1μL濃度為2000U/μL的Ready-Lyse^TMLysozyme，然后室溫裂解15min，得到裂解體系甲。

(3)向裂解體系甲中加入2.5μL 20％(20g/100mL)SDS水溶液，得到裂解體系乙(裂解體系乙中，SDS的濃度為0.5％(0.5g/100mL))；然后室溫裂解10min，得到裂解體系丙。

(4)取裂解體系丙，室溫、2500g離心10min，收集沉淀。

3、酶切

(1)制備酶切體系。1mL酶切體系由步驟2中(4)收集的沉淀、100μL濃度為10％(10g/100mL)TX-100水溶液、100μL 10×NEB2.1buffer、40μL濃度為20000U/mL的限制性內切酶HindIII溶液和760μL ddH₂O組成。

(2)完成步驟(1)后，取所述酶切體系，37℃、50rpm/min反應5h。

(3)取完成步驟(2)后的酶切體系，室溫、2500g離心10min，收集沉淀。

4、Bio-DNA的獲得

(1)制備反應體系。240μL反應體系由步驟3中(3)收集的沉淀、1.44μL濃度為10mM的dATP水溶液、1.44μL濃度為10mM的dGTP水溶液、1.44μL濃度為10mM的dTTP水溶液、2.88μL濃度為5mM的Bio-16-dCTP、24μL 10×NEB2.1buffer、8μL濃度為5000U/mL的DNA聚合酶I(Klenow大片段)溶液和200.8μL ddH₂O組成。

(2)完成步驟(1)后，取所述反應體系，37℃、50rpm/min反應1.5h。

(3)向完成步驟(2)后的體系中加入6μL 20％(20g/100mL)SDS水溶液，得到終止體系(終止體系中，SDS的濃度為0.5％(0.5g/100mL))；然后室溫靜置10min，獲得Bio-DNA。

5、連接

(1)制備連接體系。2.4mL連接體系由240μL濃度為10％(10g/100mL)TX-100水溶液、240μL 10×T4DNA連接酶buffer、240μL步驟4中(3)獲得的Bio-DNA、12μL濃度為10mg/mL的BSA水溶液、80μL濃度為5weiss U/μL的T4DNA連接酶溶液和1588μL ddH₂O組成。

(2)完成步驟(1)后，取所述連接體系，16℃靜置反應8h。

(3)向完成步驟(2)后的體系中加入48μL濃度為10mg/mL的RNase A溶液，得到RNA處理體系(RNA處理體系中，RNase A的濃度為200μg/mL)；然后37℃處理45min。

6、解交聯

向完成步驟5的體系中加入24μL濃度為20mg/mL的蛋白酶K水溶液，得到解交聯體系(解交聯體系中，蛋白酶K的濃度為200μg/mL)；然后65℃反應10h。

7、DNA純化

(1)向完成步驟6的體系中加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為：25:24:1)，上下顛倒混勻，室溫、5000g離心10min，得到上層水相甲和下層有機相甲。

(2)完成步驟(1)后，取一新的EP管，加入上層水相甲和等體積的氯仿，上下顛倒混勻，室溫、5000g離心10min，得到上層水相乙和下層有機相乙。

(3)完成步驟(2)后，另取一新的EP管，加入10體積份的上層水相乙、1體積份的NaAc水溶液(pH值為5.2)和12體積份的異戊醇，上下顛倒混勻，然后-80℃沉降1h。

(4)完成步驟(3)后，取所述EP管，4℃、12000g離心20min，棄上清，向沉淀中加入500μL的75％(v/v)乙醇水溶液，上下顛倒混勻；然后4℃、12000g離心5min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干，然后加入95μL的ddH₂O，得到DNA溶液。

(5)制備去除單片段體系。120μL去除單片段體系由95μL DNA溶液、12μL10×NEB2.1buffer、1μL濃度為10mg/mL的BSA水溶液、1μL濃度為10mM的dGTP水溶液、1μL濃度為10mM的dATP水溶液、3μL濃度為3000U/mL的T4DNA聚合酶和7μL ddH₂O組成。

(6)完成步驟(5)后，取所述去除單片段體系，12℃反應2h。

(7)取完成步驟(6)后的體系，采用QIAGEN PCR純化試劑盒進行DNA純化，并用60μL ddH₂O洗脫，得到Bio-Hi-C DNA溶液。

8、超聲處理液

(1)取40μL步驟7中(7)得到的Bio-Hi-C DNA溶液，加入560μL ddH₂O，得到稀釋液；將所述稀釋液置于冰上，然后超聲。超聲的具體參數為：超聲頻率35％；超聲1s，停1s，超聲總時間為200s。

(2)取完成步驟(1)后的體系，采用QIAGEN PCR純化試劑盒進行DNA純化，并用40μL ddH₂O進行洗脫，得到超聲處理液。

9、Bio-Hi-C DNA的富集

(1)取20μLMyOne^TM Streptavidin C1，置于磁力架上1-2min，棄beads儲液。

(2)完成步驟(1)后，取beads，用100μL含0.05％(0.05mg/100mL)Tween的1×B&W buffer清洗三次，然后棄上清。

(3)完成步驟(2)后，取所述beads，用100μL 1×B&W buffer清洗一次。

(4)完成步驟(3)后，向所述beads中加入20μL步驟7中(7)得到的Bio-Hi-C DNA溶液和20μL 2×B&W buffer，混勻，然后置于混勻儀上，室溫反應15min；棄上清。

(5)完成步驟(4)后，取所述beads，先用100μL含0.05％(0.05mg/100mL)Tween的1×B&W buffer清洗一次；再用100μL 1×B&W buffer清洗一次；最后用預冷pH8.0、10mM Tris-HCl緩沖液清洗一次。

10、轉座反應

(1)制備轉座反應體系。25μL轉座反應體系由完成步驟9中(5)的所述beads、12.5μL 2×Tagment DNA buffer、1μL Tagment DNA Enzyme和11.5μL ddH₂O組成。

(2)完成步驟(1)后，取所述轉座反應體系，置于混勻儀上，37℃反應3min。

(3)完成步驟(2)后，棄上清，然后加入100μL終止反應緩沖液，反應2min。

(4)完成步驟(3)后，棄上清，然后加入預冷pH8.0、10mM Tris-HCl緩沖液清洗兩次，將所述beads轉移至新的EP管中，加入10μL ddH₂O進行溶解，液相即為模板溶液。

11、PCR鑒定

(1)制備PCR擴增反應體系甲。38μL PCR擴增反應體系甲由25μL 2×KAPA HiFi hotstart mix和13μL ddH₂O組成。

(2)完成步驟(1)后，取所述PCR擴增反應體系甲，98℃處理45s。

(3)制備PCR擴增反應體系乙。50μL PCR擴增反應體系乙由38μL完成步驟(2)的體系、1μL濃度為25μM的Nextra Primer 1.0(核苷酸序列為：5’

-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-3’)、1μL濃度為25μM的Nextra Primer 2.1(核苷酸序列為：5’

-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT-3’)和10μL步驟10中(4)得到的模板溶液組成。

(4)完成步驟(3)后，取所述PCR擴增反應體系乙，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。

PCR反應程序為：72℃延伸5min；98℃變性30s；98℃變性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15個循環；72℃延伸1min。

(5)完成步驟(4)后，取所述PCR擴增產物，采用QIAGEN MinElute PCR純化試劑盒進行DNA純化，并用20μL ddH₂O進行洗脫，得到洗脫液。

(6)完成步驟(5)后，向20μL洗脫液中加入4μL 6×loading buffer，混勻，進行2％瓊脂糖凝膠電泳(電壓設置為100V，電泳時間為60min)。

(7)完成步驟(6)后，在紫外燈下切割條帶大小為200-500bp的膠塊，然后采用QIAGEN MinElute膠回收試劑盒進行回收，并用10μL ddH₂O進行洗脫，得到DNA測序溶液甲。

步驟(4)獲得PCR擴增產物即為采用本發明提供的方法構建的冰島硫化葉菌REY15A的Hi-C高通量測序文庫。

12、高通量測序

采用測序儀對步驟11中(7)得到的DNA測序溶液甲進行高通量測序，然后利用軟件對Hi-C數據進行分析。

按照上述步驟9至11的方法，將步驟9中(4)的“步驟7中(7)得到的Bio-Hi-C DNA溶液”替換為“步驟8中(2)得到的超聲處理液”，將步驟11中(3)的“Nextra Primer 2.1”替換為“Nextra Primer 2.2(核苷酸序列為：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT-3’)”，其它步驟均不變，得到DNA測序溶液乙；采用測序儀DNA測序溶液乙進行高通量測序，然后利用軟件對Hi-C數據進行分析。

二、采用常規方法構建冰島硫化葉菌REY15A的Hi-C高通量測序文庫

1、同步驟一中1。

2、同步驟一中2。

3、同步驟一中3。

4、同步驟一中4。

5、同步驟一中5。

6、同步驟一中6。

7、同步驟一中7。

8、同步驟一中8。

9、末端補平

(1)制備末端補平體系。50μL末端補平體系由10μL(約100ng)步驟8得到的超聲處理液、5μL 10×T4DNA連接酶buffer、0.5μL濃度為10mM的dATP、0.5μL濃度為10mM的dTTP、0.5μL濃度為10mM的dCTP、0.5μL濃度為10mM的dGTP、1μL濃度為5weiss U/μL的T4DNA聚合酶、1μL濃度為1U/μL的DNA聚合酶I(Klenow大片段)稀釋液、1μL濃度為10U/μL的T4多聚核苷酸激酶和30μL ddH₂O組成。

DNA聚合酶I(Klenow大片段)稀釋液為用無菌水將DNA聚合酶I(Klenow大片段)稀釋至5倍體積得到的。

(2)完成步驟(1)后，取末端補平體系，20℃反應30min。

(3)取完成步驟(2)后的末端補平體系，采用QIAGEN PCR純化試劑盒進行DNA純化，并用34μL ddH₂O進行洗脫，得到末端補平溶液。

10、加“A”反應

(1)制備加“A”體系。50μL加“A”體系由34μL末端補平溶液、5μL10×NEB2.1buffer、10μL濃度為1mM的dATP和1μL濃度為5U/μL的Klenow片段(3’→5’exo-)組成。

(2)完成步驟(1)后，取加“A”體系，37℃反應30min。

(3)取完成步驟(2)后的加“A”體系，采用QIAGEN PCR純化試劑盒進行DNA純化，并用9μL ddH₂O進行洗脫，得到末端加“A”溶液。

11、連接接頭

(1)制備接頭反應體系。25μL接頭反應體系由9μL末端加“A”溶液、12.5μL2×快速連接酶buffer、1μL adaptor混合物稀釋液和2.5μL DNA快速連接酶組成。

adaptor混合物稀釋液為用水將adaptor混合物稀釋至20倍體積得到的。adaptor混合物為引物Top adapter：5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-3’和引物Bottom adapter：5′-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG-3’組成的混合物。adaptor混合物中，引物Top adapter和引物Bottom adapter的濃度均為25μM。引物Top adapter和引物Bottom adapter均由Invitrogen公司合成。

(2)完成步驟(1)后，取接頭反應體系，22℃反應15min。

(3)取完成步驟(2)后的接頭反應體系，采用QIAGEN PCR純化試劑盒進行DNA純化，并用10μL ddH₂O進行洗脫，得到洗脫液。

(4)完成步驟(3)后，向10μL洗脫液中加入4μL 6×loading buffer，混勻，進行2％瓊脂糖凝膠電泳(電壓設置為100V，電泳時間為60min)。

(5)完成步驟(4)后，在紫外燈下切割條帶大小為200-500bp的膠塊，然后采用QIAGEN MinElute膠回收試劑盒進行回收，并用20μL ddH₂O進行洗脫，得到末端連接接頭溶液。

12、Bio-Hi-C DNA的富集

(1)取20μLMyOne^TM Streptavidin C1，置于磁力架上1-2min，棄beads儲液。

(2)完成步驟(1)后，取beads，用100μL含0.05％(0.05mg/100mL)Tween的1×B&W buffer清洗三次，然后棄上清。

(3)完成步驟(2)后，取所述beads，用100μL 1×B&W buffer清洗一次。

(4)完成步驟(3)后，向所述beads中加入20μL末端連接接頭溶液和20μL2×B&W buffer，混勻，然后置于混勻儀上，室溫反應15min；棄上清。

(5)完成步驟(4)后，取所述beads，先用100μL含0.05％(0.05mg/100mL)Tween的1×B&W buffer清洗一次，再用100μL 1×B&W buffer清洗一次，最后用預冷pH8.0、10mM Tris-HCl緩沖液清洗一次。

(6)完成步驟(5)后，將所述beads轉移至新的EP管中，加入10μL ddH₂O進行溶解，液相即為模板溶液。

13、PCR鑒定

(1)制備PCR擴增反應體系。50μL PCR擴增反應體系由25μL 2×KAPA HiFi hotstart mix、1μL濃度為25μM的Illumina Primer 1.0(核苷酸序列為：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’)、1μL濃度為25μM的Illumina Primer Index 12(核苷酸序列為：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’)、10μL步驟12中(6)得到的模板溶液和13μL ddH₂O組成。

(2)完成步驟(1)后，取所述PCR擴增反應體系，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。

PCR反應程序為：98℃變性2min45s；98℃變性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15個循環；72℃延伸5min。

(3)完成步驟(2)后，取所述PCR擴增產物，采用QIAGEN MinElute PCR純化試劑盒進行DNA純化，并用20μL ddH₂O進行洗脫，得到洗脫液。

(4)完成步驟(3)后，向20μL洗脫液中加入4μL 6×loading buffer，混勻，進行2％瓊脂糖凝膠電泳(電壓設置為100V，電泳時間為60min)。

(5)完成步驟(4)后，在紫外燈下切割條帶大小為200-500bp的膠塊，然后采用QIAGEN MinElute膠回收試劑盒進行回收，并用10μL ddH₂O進行洗脫，得到DNA測序溶液丙。

步驟(2)獲得PCR擴增產物即為采用常規方法構建的冰島硫化葉菌REY15A的Hi-C高通量測序文庫。

14、高通量測序

采用測序儀對步驟13中(5)得到的DNA測序溶液丙進行高通量測序，然后利用軟件對Hi-C數據進行分析。

DNA測序溶液甲、DNA測序溶液乙和DNA測序溶液丙的Hi-C數據分析結果見圖1至圖18。結果表明，與DNA測序溶液丙的Hi-C數據相比，DNA測序溶液甲和DNA測序溶液乙的可用連接片段數均較多(即冗余片段數較少)，酶切片段中可用連接片段數均較多(即不可用連接片段數較少)；“DNA測序溶液甲與DNA測序溶液乙”的染色質覆蓋度一致性和相互作用一致性均高于“DNA測序溶液甲與DNA測序溶液丙”和“DNA測序溶液乙與DNA測序溶液丙”。

上述結果表明，采用本發明提供的方法構建Hi-C高通量測序文庫的結果穩定可靠，而且數據質量更高，更易標準化，步驟更少(本發明所提供的方法構建Hi-C高通量測序文庫只需經過轉座反應即可進行PCR鑒定，而常規方法構建Hi-C高通量測序文庫需經過末端補平、加“A”和連接接頭等步驟才可進行PCR鑒定)，時間更短(采用常規方法構建Hi-C高通量測序文庫的時間為1-2d，采用本發明所提供的方法構建Hi-C高通量測序文庫的時間約3h)，更節約資源(采用常規方法構建Hi-C高通量測序文庫的步驟較多，因此DNA樣品損失也較多)。