一種光合細菌發酵液的制備方法及對早疫病的應用與流程

本發明是一種光合細菌發酵液的制備方法及對早疫病的應用，涉及生物農藥技術領域，具體是一種沼澤紅假單胞菌菌株、生防菌劑、生防發酵液及其制備方法和應用。

背景技術：

番茄是一種重要的蔬菜作物，其適應范圍廣，廣泛分布于世界各地，被列為全世界產量最高的30種農作物之一。在番茄生產中，由于病蟲危害，經常造成大面積減產。其中，番茄早疫病是番茄生產上的主要病害之一，是一種世界性病害，由茄鏈格孢屬真菌Alternaria solani(Ellis et Martin)引起，該菌寄主范圍廣泛，除番茄外，還可感染辣椒、茄子、曼陀羅和馬鈴薯等。在美國、澳大利亞、以色列、印度、希臘等地發病率都很高。20世紀80年代以來在我國大部分地區也普遍發生，特別是保擴地番茄種植面積越來越大，早疫病的為害范圍和程度也在逐年增加，造成常年損失20％～30％，嚴重時可達50％以上甚至毀棚，而且因果實內含有毒素，會使人體患有血液病，影響人體健康。

目前番茄生產上并無高抗或免疫的品種，運用抗病種質防治該病并不現實，因此早疫病多采用化學藥劑防治，隨著農藥使用量的增加，農藥殘留、農藥抗性、環境污染、非靶標生物受害和慢性毒性等諸多問題日益顯露出來，同時殘留的農藥通過食物鏈進入人體內逐漸積累，易誘發癌癥等多種疑難病癥。我國加入WTO和對環境保護日益重視的形勢下，我們必須重視綠色食品的生產，以適應國內外形勢發展的需要。

因此，為了實現番茄的高產、無毒、無公害可持續發展等目標，有針對性的發展高效、低毒、無殘留綠色生物農藥來防治番茄病害，尤其是番茄早疫病的發生，最大限度的降低由于病害爆發引起的減產、化學農藥過量施用嚴重影響番茄品質的現狀，開發生物農藥成為一個行之有效的解決途徑。

目前，用于番茄早疫病生物防治的拮抗微生物主要包括芽孢桿菌、假單孢菌、放線菌、鏈霉菌、木霉菌、海洋放線菌等。它們對番茄早疫病菌產生抑制作用的機理主要是通過競爭性生長繁殖而占居生存空間的方式來阻止植物病原真菌的生長與增殖，能在植物表面迅速形成一層高密保護膜，使早疫病菌得不到生存空間，保護了番茄免受病原菌為害。近年來，國內外學者在光合細菌的基礎性研究、應用研究方面也取得很大的進展。諸多研究結果證明，光合細菌的一些活性物質能鈍化病原體的致病力、促進放線菌等有益微生物增殖，以及抑制病原體的生長，從而有效地抑制某些植物病害的發生與蔓延。因而，利用光合細菌防治番茄早疫病具有豐富的生防資源和廣闊的應用前景。

技術實現要素：

針對現有技術存在的不足，本發明目的是提供一種光合細菌發酵液的制備方法及對早疫病的應用，以解決上述背景技術中提出的問題。

為了實現上述目的，本發明是通過如下的技術方案來實現：一種光合細菌發酵液的制備方法，包括：

選取光合細菌菌株；

對光合細菌菌株進行活化；

種子培養；

生產培養。

進一步地，所述選取光合細菌菌株的具體步驟為：選取沼澤紅假單胞菌作為光合細菌菌株。

進一步地，所述對光合細菌菌株進行活化的具體步驟為：將沼澤紅假單胞菌菌株的保存種按雙層平板培養法進行培養，培養至紅色單菌落出現。

進一步地，所述種子培養的具體步驟為：將培養出的紅色單菌落接入至血清瓶中，以光合細菌液體培養基進行種子培養至對數生長期得到菌液。

進一步地，種子培養的溫度為30℃～32℃，光照條件為2500Lx～4000Lx，pH為7.0。

進一步地，所述生產培養的具體步驟為：將種子培養后得到的菌液按光合細菌菌株總體積5％的接種量接種到生產瓶中，以光合細菌生產培養基進行生產培養至對數生長期即制得沼澤紅假單胞菌生防菌劑，對沼澤紅假單胞菌生防菌劑離心收集上清液，制得光合細菌生防發酵液。

進一步地，生產培養的溫度為30℃～32℃，光照條件為2500Lx～4000Lx，pH為7.0。

進一步地，離心時轉速為8000rpm，離心溫度為4℃，離心時間為15min。

一種光合細菌發酵液對早疫病的應用，光合細菌生防發酵液應用于拮抗鏈格孢菌或防控番茄早疫病。

本發明的有益效果：(1)本發明的沼澤紅假單胞菌的生產工藝簡單、培養時間短、成本低，且該菌株可通過簡單、快捷、低成本的操作方法制備得到番茄早疫病防控的生防菌劑及生防發酵液。

(2)本發明的沼澤紅假單胞菌制得的生防菌劑及生防發酵液具有環境友好、對人畜無毒、對作物無藥害、施用簡單方便等特點，且不易使病蟲害產生耐藥性。

附圖說明

圖1為本發明的光合細菌培養基對照圖；

圖2為本發明的光合細菌發酵液圖；

圖3為本發明的1000倍嘧菌酯處理圖；

圖4為本發明的生防發酵液處理的菌絲對離體果實致病影響效果圖；

圖5為本發明的對照處理的菌絲對離體果實致病影響效果圖。

具體實施方式

為使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體實施方式，進一步闡述本發明。

本發明提供一種技術方案：一種光合細菌發酵液的制備方法，包括：

選取光合細菌菌株；

對光合細菌菌株進行活化；

種子培養；

生產培養。

選取光合細菌菌株的具體步驟為：選取沼澤紅假單胞菌作為光合細菌菌株。

對光合細菌菌株進行活化的具體步驟為：將沼澤紅假單胞菌菌株的保存種按雙層平板培養法進行培養，培養至紅色單菌落出現。

種子培養的具體步驟為：將培養出的紅色單菌落接入至血清瓶中，以光合細菌液體培養基進行種子培養至對數生長期得到菌液。

種子培養的溫度為30℃～32℃，光照條件為2500Lx～4000Lx，pH為7.0。

生產培養的具體步驟為：將種子培養后得到的菌液按光合細菌菌株總體積5％的接種量接種到生產瓶中，以光合細菌生產培養基進行生產培養至對數生長期即制得沼澤紅假單胞菌生防菌劑，對沼澤紅假單胞菌生防菌劑離心收集上清液，制得光合細菌生防發酵液。

生產培養的溫度為30℃～32℃，光照條件為2500Lx～4000Lx，pH為7.0。

離心時轉速為8000rpm，離心溫度為4℃，離心時間為15min。

一種光合細菌發酵液對早疫病的應用，光合細菌生防發酵液應用于拮抗鏈格孢菌或防控番茄早疫病。

作為本發明的一個實施例：本發明的沼澤紅假單胞菌的生產工藝簡單、培養時間短、成本低，且該菌株可通過簡單、快捷、低成本的操作方法制備得到番茄早疫病防控的生防菌劑及生防發酵液。

本發明的沼澤紅假單胞菌制得的生防菌劑及生防發酵液具有環境友好、對人畜無毒、對作物無藥害、施用簡單方便等特點，且不易使病蟲害產生耐藥性。

作為本發明的一個實施例：光合細菌菌株經生理生化鑒定和分子生物學鑒定為沼澤紅假單胞菌。主要生物學特征有：雙層固體平板培養基上培養4d～8d，形成紅色的圓形菌落，菌落邊緣整齊光滑、菌落直徑0.2mm～0.60mm；液體培養基中培養7d呈深紅色；在厭氧和微氧條件下生長良好；生理化特性為V-P反應與甲基紅反應陰性、H₂S反應、明膠液化、脲酶試驗、吲哚試驗均陽性，最適生長溫度30℃～32℃，pH＝7。

作為本發明的一個實施例：一種光合細菌生防菌劑，采用實施例1的沼澤紅假單胞菌菌株為原料，通過經活化、種子培養、生產培養制備得到，其具體制備方法包括以下步驟：

(1)活化：將沼澤紅假單胞菌I-1-1菌株的保存種按雙層平板培養法進行培養，培養至紅色單菌落出現；采用的培養基為光合細菌固體培養基，配方為：(NH4)₂SO4 1.8g/L、NaCO₃1.0g/L、YE 1.5g/L、K₂HPO4 0.4g/L、MgSO₄0.5g/L、瓊脂粉20g/L，pH＝7.0。

(2)種子培養：將步驟(1)培養出的紅色單菌落接入至120mL血清瓶中，在溫度為30℃～32℃、光照條件為2500Lx～4000Lx、pH＝7.0條件下，用光合細菌液體培養基培養至對數生長期得到菌液。光合細菌液體培養基的配方為((NH4)₂SO4 1.8g/L、NaCO₃1.0g/L、YE 1.5g/L、K₂HPO4 0.4g/L、MgSO₄ 0.5g/L，pH＝7.0。

(3)生產培養：將步驟(2)種子培養后得到的菌液接種到生產瓶中，用光合細菌生產培養基(培養基成分與上述光合細菌液體培養基一致)進行生產培養，菌液的接種量為所述光合細菌菌株生產培養基總體積的5％，在溫度為30℃～32℃、光照條件為2500Lx～4000Lx、pH＝7.0條件下，培養至對數生長期即制得生防菌劑。

作為本發明的一個實施例：一種光合細菌生防發酵液，采用實施例1的沼澤紅假單胞菌菌株為原料，通過經活化、種子培養、生產培養、離心制備得到，其具體制備方法包括以下步驟：取實施例2中獲得的生防菌劑，經發酵培養6d，發酵培養在溫度為30-35℃、光照條件為3000Lx-4000Lx條件下進行，發酵培養基成分與上述的光合細菌液體培養基成分相同，然后在6000rpm條件下離心5min-8min，離心收集上清液，將上清液用細菌過濾器過濾，得到無沼澤紅假單胞菌菌體的上清液即為生防發酵液，4℃保存備用。

作為本發明的一個實施例：一種實施例3的生防發酵液在拮抗茄鏈格孢菌中的應用，具體的應用方法為：

番茄早疫菌絲平板測定試驗：以茄鏈格孢菌為靶標，采用平板法做抑菌試驗。將光合細菌生防發酵液與45℃-50℃熔融態的5×PDA培養基(土豆200g榨汁，葡萄糖4g，瓊脂4g，加水至200mL)按1:1混合，并以光合細菌培養基及嘧菌酯為對照，接入培養5d的番茄早疫病病菌，28℃培養，重復5次，28℃培養3d后計算蛋白液對炭疽病菌的抑制率。

抑制率＝(菌落直徑_對照菌落-菌落直徑_蛋白處理)/菌落直徑_對照菌落×100％。

參見圖1、圖2、圖3，圖1、圖2、圖3分別為光合細菌培養基對照、光合細菌發酵液和1000倍嘧菌酯處理，從圖1中可以知道：光合細菌發酵液處理對茄鏈格孢菌后，菌絲黑色素消失，菌絲生長速度比對照快，且菌絲稀疏。

作為本發明的一個實施例：一種實施例4中生防發酵液在番茄早疫病病防治中的應用，具體的應用方法為：

采集成熟番茄，經表面消毒后，用HAMILTON微量注射器的針頭在果面上刺2個接種點，將生防發酵液處理和對照處理的菌絲分別接種于番茄接種點上，每點接1餅(直徑6mm)，置于12h光照/d、RH≥95％的條件的培養箱中培養，第7d調查發病情況。病斑直徑≥6mm的視為發病，統計發病率，即病斑數占總接種點的百分率。設4次重復，每重復至少5個果。

參見圖4和圖5，圖4和圖5分別為生防發酵液處理的菌絲和對照處理的菌絲對離體果實致病影響效果，從圖4和圖5中可以發現：對照處理的茄鏈格孢菌致使番茄的發病率為100％，而發酵液處理后番茄并未發病。

以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點,對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。