利用PCR?SSCP快速檢測綿羊NELF基因單核苷酸多態性的方法及其應用與流程
本發明屬于分子遺傳學領域，涉及綿羊單核苷酸多態性(SNP)分子標記的篩選與檢測，特別涉及利用PCR-SSCP方法快速檢測NELF基因組第454位點單核苷酸多態性。具體來說，就是對PCR擴增獲得的產物變性之后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后根據電泳結果確定其單核苷酸多態性。
背景技術：
近20年來，尤其是近10年來，分子遺傳學和分子生物技術有了突飛猛進的發展，其中，分子遺傳標記是目前在家畜育種中研究得最多的內容，也是近期內最可能在家畜育種中得到廣泛應用的研究項目。遺傳標記是指那些可以準確鑒別的、能反映個體特異性的遺傳特征。分子遺傳標記則是指以個體遺傳物質即核苷酸序列變異為基礎的DNA分子標記，是DNA水平遺傳多態性的直接反映。利用分子標記輔助選擇育種，是現代動物分子育種的一項主要研究內容，其直接在DNA水平上對性狀的基因型進行選擇，因此其選種的準確性大大提高，克服了傳統動物育種方法的缺陷。
單核苷酸多態性(SNP)是一種重要的分子遺傳標記，它是由美國學者Lander于1996年提出的第三代DNA遺傳標記，是基因組中單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，包括堿基的轉換、插入及缺失等形式。PCR-SSCP技術的基本原理是PCR擴增后的DNA片段經變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時形成不同的立體構象，其構象直接影響泳動速率，相同長度的DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個堿基的差別，就可以產生立體構象的不同，造成泳動速率的不同，產生不同的泳動帶。因此，可以通過PCR-SSCP技術檢測基因組是否存在SNP位點，并且準確的鑒別SNP位點的基因型。現在已經公認單鏈構象多態性(SSCP)可作為遺傳標記應用于育種中。該方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且檢測序列位點無特殊要求。
鼻胚胎促黃體激素釋放激素因子(Nasal embryonic LHRH factor，NELF)編碼基因與動物的生殖有密切關系。Samuel D.Quaynor等通過創建純合NELF敲除(KO)小鼠模型，證明雌性小鼠NELF基因敲除將推遲陰道口開放，并沒有延遲第一次發情的時間，減少了子宮重量并且減少了GnRH的神經元數目。與此相反，雄性小鼠的青春期表現正常。NELF敲除導致雌雄小鼠都表現為生育能力受損，平均窩產仔數降低。此外，越來越多的報道表明，NELF在小鼠的生殖方面有重要作用。綿羊的NELF基因定位在第20號染色體上，全長5928bp，編碼區全長1112bp。
目前，國內外對NELF基因多態性的研究主要集中于小鼠等模式動物，而對于家畜NELF基因單核苷酸多態性的研究尚未見報道。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種利用PCR-SSCP快速檢測綿羊NELF基因單核苷酸多態性的方法及其應用，從而為綿羊的分子標記輔助選擇育種提供基礎資料，加快中國綿羊的種質資源改良工作。
本發明是通過以下技術方案來實現的：
以包含NELF基因的待測綿羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增綿羊NELF基因片段；對擴增片段進行變性，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據凝膠電泳結果判定綿羊NELF基因的單核苷酸多態性；
所述的引物對P為：
上游引物F：5’-TTGCCCCTTTCGTTGCTC-3’ 18nt；
下游引物R：5’-TTTCTCCACTGTCACCGCC-3’ 19nt。
所述的PCR擴增反應程序為：
95℃預變性5min；95℃變性30s，64℃退火50s，72℃延伸30s，34個循環；72℃延伸10min。
根據聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳結果鑒定綿羊NELF基因accession number NC_019477.2：g.454位的T>C突變的多態性。
根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定綿羊NELF基因組第454位存在TT、TC、CC三種基因型。
所述的凝膠電泳為10-12％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，先在4℃下，200-250V預電泳20-60min，再在室溫下，120-150V電泳3-4h。
本發明的有益效果體現在：
針對綿羊NELF基因第454位T>C的突變，本發明提供了其檢測方法，通過設計特定的引物，PCR擴增目的片段，然后變性成單鏈DNA，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。該方法能夠簡單、快速、低成本、精確度高的鑒定基因的單核苷酸多態性。
本發明對突變位點的基因型進行了檢測和基因頻率分析，并將該位點與綿羊的繁殖性狀進行關聯分析。結果表明該位點可作為分子遺傳標記進行分子標記輔助選擇育種，以提高綿羊繁殖性狀。
附圖說明
圖1為綿羊NELF基因組第454位(具有深色背景的位點)TT基因型個體的測序圖。
圖2為綿羊NELF基因組第454位CC基因型個體的測序圖。
圖3為綿羊NELF基因組第454位TC基因型個體的測序圖。
圖4為綿羊NELF基因組第454位不同基因型PCR產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明做詳細的說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
本發明根據綿羊NELF基因組序列設計引物，分別以2種綿羊品種的基因組DNA池為模板，進行PCR擴增，產物測序得到綿羊NELF基因的部分序列。與NCBI上公布的參考序列比對，發現在綿羊NELF基因組第454位存在T>C的突變，該突變位點位于綿羊NELF基因內含子內，產生一個無意突變，并將其與繁殖性狀進行關聯分析，確定為與綿羊繁殖性狀相關的分子遺傳標記，利用PCR-SSCP方法對該突變進行檢測。
一、綿羊NELF基因部分序列的克隆及其多態性檢測
1.樣本采集及基因組DNA提取
⑴血樣的采集
本發明采用了2個綿羊品種，共計607個個體作為檢測對象，血液的采集方法為頸靜脈采血。血樣的采集地區，以及各品種的數據資料情況如表1所示：
表1實驗動物情況
⑵血樣DNA的提取
①冷凍血樣(主要為血細胞)室溫解凍，吸取500μL血液于1.5mL離心管中，加入等體積的磷酸緩沖液(PBS)混勻，溫和搖動，4℃，12000r/min離心5min，棄去上清液，重復上述步驟至上清液透明、沉淀呈透明色。
②在離心管中加入DNA抽提緩沖液500μL，輕輕吹打，使血細胞沉淀脫離離心管壁，37℃水浴1h。
③加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)，并混勻，55℃水浴中消化過夜(16h左右)至絮狀沉淀不見，溶液澄清，尚未澄清的，可補加1μL蛋白酶K混勻繼續消化直至澄清。
④將反應液冷卻至室溫，加入500μL Tris飽和酚，溫和搖動15min，使其充分混勻，4℃，12000r/min離心10min，將上層水相轉入另一滅菌離心管，重復上述步驟1次。
⑤加入氯仿500mL，溫和搖動20min，使其充分混勻，4℃，12000r/min離心15min，將上層水相轉入另一滅菌的1.5mL離心管。
⑥加入氯仿、異戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉入另一1.5mL離心管中。
⑦加入0.1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉動離心管直至白色的絮狀沉淀析出。
⑧4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。
⑨4℃，12000r/min離心10min，棄上清液，室溫下使乙醇揮發干凈。
⑩干燥后的DNA溶液中加入80～100μL的超純水溶解，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度儀檢測其質量，-80℃保存。
2.DNA池的構建
用紫外光光度計測定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計算DNA含量和OD260/OD280的比值，DNA濃度(ng/μL)＝50×OD260值×稀釋倍數。如果OD260/OD280比值小于1.6，說明樣品中含有較多的蛋白質或酚，則應進行純化；如果比值大于1.8，則應該考慮去除RNA純化。DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μL，然后從2個綿羊群體中隨機選擇10個濃度為50ng/μL DNA樣品中取5μL混合構建DNA池。
二、擴增引物設計
1.綿羊NELF基因PCR引物的設計
以NCBI所公布的綿羊序列(NC_019477.2)為參考，利用Primer 5.0軟件設計能夠擴增包含綿羊NELF基因第454位點的PCR引物，其引物序列如下：
上游引物F:5’-TTGCCCCTTTCGTTGCTC-3’ 18nt；
下游引物R:5’-TTTCTCCACTGTCACCGCC-3’ 19nt。
三、PCR擴增
PCR反應體系如表2所示。
表2 PCR反應體系
PCR反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s，64℃退火50s，72℃延伸30s，34個循環；72℃后延伸10min。
四、PCR產物測序
將用以上混合的DNA池為模板擴增的PCR產物送上海生工有限公司進行雙向測序。對綿羊NELF基因目的片段測序結果與參考序列進行比對，發現在基因組的第454位存在一個T>C的突變(參見圖1、圖2以及圖3)。
五、PCR產物變性及SSCP檢測
對于PCR擴增后的產物首先變性，然后進行聚丙烯酰胺凝膠檢測，最終根據不同的帶型結果判定其SNP多態性。具體步驟如下：
(1)根據不同的擴增片段，選擇30％丙烯酰胺(29:1)配成10％～12％的聚丙烯酰胺凝膠(見表3)。
(2)加好上述溶液后，用玻璃棒慢慢攪動，使其充分混勻。立即緩慢倒入已準備好的底部密封的玻璃板之間，注意不要產生氣泡；倒好凝膠后，立即插上梳子，切勿在梳子齒下留有氣泡。
(3)待膠凝固后，拔掉梳子，輕輕的甩干點樣孔中的水分，然后將玻璃板固定到垂直電泳槽上，并往槽中倒入1×TBE緩沖液。
(4)取8μL PCR產物，加入8μL變性緩沖液(95％甲酰胺、10mol/L EDTA、0.05％溴酚蘭、0.05％二甲苯青)，瞬時離心后在PCR儀中98℃變性10min，取出后立即置于冰上，30min后即可上樣。
(5)4℃、先250V預電泳20min，然后120V電泳4h(根據擴增片段大小、凝膠濃度以及玻璃板的長度確定電壓大小和電泳時間)。
(6)將電泳槽中的1×TBE緩沖液倒出回收，然后從玻璃板中取出凝膠，用蒸餾水漂洗2次后，加入適量的0.1％的硝酸銀溶液，放于搖床避光輕輕搖15min(硝酸銀可回收利用2～3次)。
(7)加入顯色液(2％氫氧化鈉+0.1％甲醛)浸沒凝膠，邊搖邊觀察，直到凝膠上顯現電泳帶。
(8)待條帶清晰后，倒掉顯色液，迅速用去離子水清洗2～3次。銀染后的聚丙烯酰胺凝膠利用凝膠成像系統成像保存，留做后續的分析統計。
表3中性聚丙烯酰胺凝膠的組成
PCR-SSCP圖片如圖4所示。不同的帶型表示不同的基因型。從圖中可以看出NELF基因454位點存在三種基因型，即TT、TC、CC，其中，TT基因型和CC基因型均為兩個條帶，且TT基因型與CC基因型相比，遠離上樣端的條帶距離上樣端更遠，TC基因型具有相應的三個條帶。
六、綿羊NELF基因SNP位點的頻率統計及其與繁殖性狀的關聯分析
1.基因和基因型頻率
基因型頻率是指一個群體中某一性狀的各種基因型之間的比率。計算公式如下：
PBB＝NBB/N
其中PBB代表某一位點的BB基因型頻率；NBB表示群體中具有BB基因型的個體數；N為檢測群體的總數量。
基因頻率是指一個群體中某一基因對其等位基因的相對比率。計算公式可寫成：
PB＝(2NBB+NBb1+NBb2+NBb3+NBb4+……+NBbn)/2N
式中，PB表示等位基因B頻率，NBB表示群體中具有BB基因型的個體數量，NBbi表示群體中具有Bbi基因型個體數量，b1～bn為等位基因B的n個互不相同的復等位基因。
各品種中的基因頻率與基因型頻率的統計結果如表4所示：
表4 2個綿羊品種中NELF基因的基因型和等位基因頻率
從表3中可以看出等位基因T的頻率變化范圍為0.460～0.506，等位基因C的頻率變化范圍為0.494～0.500，由此可見，在2個綿羊品種中，對于等位基因C的選擇具有很大的潛力。
2.相關分析統計模型
利用SAS(9.2)軟件分析基因位點與繁殖性狀(產羔數)的相關性。先對數據進行描述性統計分析，確定是否存在離群值，根據數據特征，利用t分析、方差分析或是多元線性模型分析基因型效應。在數據處理中，根據影響產羔數因素不同，考慮到環境效應、年齡、基因型效應及相關的互作效應，采用固定模型進行分析，同時，根據實際情況進行取舍。完整的模型如下：
Yijk＝μ+Gj+Eijk
其中：Yijk為個體表型記錄；μ為群體均值；Gj為各位點的基因型效應；Eijk為隨機誤差。
表5 NELF基因單核苷酸多態性與綿羊繁殖性狀之間的方差分析
注：平均值肩標上具有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，平均值肩標上字母不同表示差異顯著(P<0.05)。
表6 NELF基因單核苷酸多態性與湖羊繁殖性狀之間的方差分析
表7 NELF基因單核苷酸多態性與小尾寒羊繁殖性狀之間的方差分析
參見表5、6、7，結果表明，在綿羊NELF基因序列的第454位單核苷酸多態位點上的不同基因型與綿羊產羔數關聯分析表明，TC基因的個體的產羔數顯著高于TT和CC兩種基因型的個體。如果分品種來看，對于湖羊來說TC基因型的個體的產羔數顯著高于TT和CC基因型個體。但對于小尾寒羊來說，TC基因型的個體的產羔數與TT和CC基因型個體差異不顯著。從群體來看，TC基因型與TT和CC基因型差異顯著，但在品種上只在湖羊上檢測到了差異性，而在小尾寒羊上未檢測到，這可能是品種特異性造成的。因此推測TC基因型可作為湖羊早期選擇的分子育種基因標記。
總之，本發明所述的方法能夠快速的檢測綿羊NELF基因的單核苷酸多態性，為NELF基因的SNP與繁殖性能關系的建立奠定基礎，以便用于中國綿羊用繁殖性狀的標記輔助選擇(MAS)育種提供基礎資料，快速建立遺傳資源優良的綿羊種群。
核苷酸序列表
<110> 蘭州大學
<120> 利用PCR-SSCP快速檢測綿羊NELF基因單核苷酸多態性的方法及其應用
<160> 2
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ttgccccttt cgttgctc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tttctccact gtcaccgcc 19
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