一種優化的pIFN?γ肽鏈及在提高畢赤酵母分泌表達豬IFN?γ產量和活性中的應用的制作方法

本發明涉及基因工程
技術領域：
，具體地，涉及一種優化的pIFN-γ肽鏈及在提高畢赤酵母分泌表達豬IFN-γ產量和活性中的應用。
背景技術：
：豬伽馬干擾素（porcineInterferonGamma，pIFN-γ）是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤活性和免疫調節功能的細胞因子。豬伽馬干擾素屬于Ⅱ型干擾素中的唯一成員，主要是由活化的T細胞和NK細胞產生的一種具有廣譜抗病毒活性和免疫調節功能的細胞因子。豬伽馬干擾素在生豬養殖中具有廣闊的運用前景，在生豬養殖中可作為抗生素類替代藥品、豬腫瘤性疾病的治療及流行性疾病的防治等用途。目前國內研究者構建的各類pIFN-γ表達菌株存在目的蛋白表達效率低下，采用分泌表達方式表達量一般為100～300mg/L，采用胞內表達方式目的蛋白純化成本高昂，產量一般占細胞總蛋白1/5～1/3；此外，表達的pIFN-γ還存在活性較低的問題，阻礙了pIFN-γ在生豬養殖中的進一步運用。為此，構建一種能夠高效分泌表達具有高活性的pIFN-γ工程菌對于推動pIFN-γ在生豬養殖業中的應用是十分必要的。目前，未見有關能夠提高pIFN-γ分泌表達水平及其活性的改良氨基酸序列的報道。技術實現要素：本發明為了克服現有技術的上述不足，提供了一種優化的pIFN-γ肽鏈，優化的pIFN-γ肽鏈能提高畢赤酵母分泌表達豬IFN-γ產量和活性。本發明的另一個目的是提供一種優化的pIFN-γ肽鏈提高畢赤酵母分泌表達豬IFN-γ產量和活性中的應用。本發明的另一個目的是提供一種提高畢赤酵母分泌表達豬IFN-γ產量和活性的方法。為了實現上述目的，本發明是通過以下方案予以實現的：一種提高畢赤酵母分泌表達豬IFN-γ產量和活性的pIFN-γ肽鏈，pIFN-γ肽鏈的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。優化的pIFN-γ肽鏈命名為pIFN-γ-C。天然未經過改造的pIFN-γ肽鏈序列如SEQIDNO：2所示。本發明提供的優化的pIFN-γ肽鏈是在天然pIFN-γ肽鏈序列第129和131位氨基酸殘基由精氨酸（R）定向突變為組氨酸（H）得到的。SEQIDNO：1所示氨基酸序列的pIFN-γ肽鏈在提高畢赤酵母分泌表達豬IFN-γ產量和活性中的應用。一種提高畢赤酵母分泌表達豬IFN-γ產量和活性的方法，具體為將SEQIDNO：1所示序列的pIFN-γ肽鏈整合到畢赤酵母中，得到的重組畢赤酵母分泌表達的豬IFN-γ的產量和活性大大提高。一種提高畢赤酵母分泌表達豬IFN-γ產量和活性的方法，包括如下步驟：將SEQIDNO：1所示序列的pIFN-γ肽鏈對應的核苷酸片段插入質粒pPICZαA中，重組質粒轉入畢赤酵母X33野生型感受態細胞，利用質粒上的抗性基因，通過高抗篩選得到具有目的基因高拷貝的畢赤酵母重組子，獲得能高效分泌表達具有高活性pIFN-γ的畢赤酵母工程菌。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：將本發明提供的優化后的pIFN-γ肽鏈整合到畢赤酵母中，可以大大提高畢赤酵母分泌表達豬IFN-γ產量和活性，因此，本發明提供的優化后的pIFN-γ肽鏈對于推動pIFN-γ在生豬養殖業中的應用是十分必要的。附圖說明圖1為引入酶切位點的pIFN-γ-C基因高保真PCR擴增結果，圖中M為DL2000標準分子量Marker，泳道1為引入酶切位點的pIFN-γ（484bp）。圖2為菌落PCR篩選DH5α陽性轉化子（陽性克隆約1000bp），圖中M為DL2000標準分子量Marker，陽性克隆長度約1000bp。圖3為質粒pPICZαA-pIFN-γ-C反向測序結果。圖4畢赤酵母轉化子的高抗篩選結果，圖中1為0.5mg/mLZeocin平板篩選結果，2為1mg/mLZeocin平板篩選結果，1和2中菌落為原位一一對應關系。圖5為誘導發酵上清SDS-PAGE電泳結果；1-4號泳道為抗1.0mg/mLZeocin的酵母轉化菌株誘導表達發酵上清，第5號泳道為X33野生型誘導表達發酵上清，表達的pIFN-γ-C理論分子量為17.5Kda。圖6為pIFN-γ-C蛋白的Western-blot鑒定結果；泳道1-8為抗1.0mg/mLZeocin的酵母轉化菌株誘導表達發酵上清，M為Bio-RadDualColor標準分子量預染Marker，表達的pIFN-γ-C理論分子量為17.5Kda。圖7為Ni-親和層析純化pIFN-γ-C結果；泳道1-8為Eltionbuffer洗脫樣品，表達的pIFN-γ理論分子量為17.5Kda。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。實施例1天然未經過改造的pIFN-γ肽鏈序列如SEQIDNO：2所示，本發明利用本領域常用的基因突變方法將天然pIFN-γ肽鏈序列第129和131位氨基酸殘基由精氨酸（R）定向突變為組氨酸（H），得到SEQIDNO：1所示的優化的pIFN-γ肽鏈。（1）根據本發明提供的優化的pIFN-γ基因的核苷酸序列SEQIDNO：1為表達基因，分泌表達pIFN-γ突變體。優化的pIFN-γ-C基因通過體外全基因合成得到。全基因合成得到的pIFN-γ序列高保真PCR結果如圖1所示（目的產物上下游分別引入XhoⅠ與XbaⅠ酶切位點）。（2）構建pIFN-γ畢赤酵母重組分泌表達載體：將畢赤酵母分泌表達載體pPICZαA與上述步驟（1）中得到的pIFN-γ基因高保真PCR產物用XhoⅠ與XbaⅠ進行雙酶切，用PCR純化回收試劑盒和DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別對基因和質粒雙酶切產物進行回收，將回收的基因與質粒用T4連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，構建得到pIFN-γ重組畢赤酵母分泌表達載體pPICZαA-pIFN-γ-C，保存載體的菌株命名為DH5α-pPICZαA-pIFN-γ-C。用質粒通用引物5’AOXⅠ、3’AOXⅠ通過菌落PCR篩選DH5α陽性轉化子結果如圖2所示，將所有陽性克隆菌落送樣測序，將測序結果完全一致的菌落保種，測序結果如圖3所示。（3）pIFN-γ-C畢赤酵母分泌表達菌株的構建與高拷貝菌株的篩選：將上述步驟（3）中構建的重組表達載體用SacⅠ單酶切線性化后，電擊轉化畢赤酵母野生型X33感受態細胞，涂布YPDSZ篩選平板，置于30℃培養箱中培養至長出單菌落，隨機挑取約100個單菌落分別溶于10uL無菌水中，用無菌牙簽沾取菌液分別一一對應接種于含0.5mg/mL和1.0mg/mLZeocin的兩塊YPDZ平板，將平板置于30℃培養箱中培養，通過高濃度的Zeocin（博來霉素）YPDZ平板篩選具有目的基因高拷貝的畢赤酵母轉化子。畢赤酵母轉化子的高抗篩選結果如圖4所示。（4）pIFN-γ-C畢赤酵母分泌表達菌株的誘導發酵：將上述步驟（3）中得到的抗1.0mg/mLZeocin的酵母表達菌株接種于BMGY液體培養基，30℃、230rpm震蕩培養至OD595nm值5-6時，按照無菌操作要求，離心收集菌體沉淀，按4：1或5：1的比例（如40或50mLBMGY液體培養基培養物轉入10mLBMMY液體培養基中），將菌體沉淀轉接于含1%甲醇的BMMY液體培養基，28℃、230rpm誘導發酵48小時，每隔24小時向BMMY液體培養基補加甲醇至1%，48小時后離心收集誘導發酵上清。誘導發酵上清SDS-PAGE電泳結果如圖5所示；誘導發酵上清Western-blot結果如圖6所示，Western-blot所用一抗為抗His標簽鼠單克隆抗體，二抗為羊抗鼠IgG-HRP抗體。（5）誘導發酵上清中pIFN-γ-C的Ni親和層析：按照氨酸親和層析樹脂填料Ni-NTAHis-Bind要求，對上述誘導發酵上清中的pIFN-γ-C進行純化，Ni親和層析結果如圖7所示。（6）優化后的pIFN-γ的發酵產量和活性對比，以未優化的SEQIDNO：2序列通過質粒轉入畢赤酵母并表達為對照，在5升發酵罐內發酵后，pIFN-γ和pIFN-γ-C的表達水平和活性分別如表1和2所示。表1為pIFN-γ和pIFN-γ-C5升發酵罐發酵水平實驗組表達量（mg/L）pIFN-γ303pIFN-γ-C1921表2為pIFN-γ和pIFN-γ-C5升發酵罐發酵產品活性實驗組活性單位（U/ml）pIFN-γ3.47×106pIFN-γ-C9.28×108由表1、2的結果可知，經優化的pIFN-γ-C的表達量和活性遠高于未優化的pIFN-γ。上述結果說明調整pIFN-γ的氨基酸序列有得于畢赤酵母的表達及提高其活性。實施例2天然未經過改造的pIFN-γ肽鏈序列如SEQIDNO：2所示，本發明利用本領域常用的基因突變方法將天然pIFN-γ肽鏈序列第129和131位氨基酸殘基由精氨酸（R）定向突變為組氨酸（H），得到SEQIDNO：1所示的優化的pIFN-γ肽鏈。（1）將SEQIDNO：1所示氨基酸序列的pIFN-γ肽鏈插入質粒pPICZαA，轉入與畢赤酵母GS115野生型感受態細胞，利用質粒上的抗性基因，通過高抗篩選得到具有目的基因高拷貝的畢赤酵母重組子，可以獲得能高效分泌表達具有高活性pIFN-γ的畢赤酵母工程菌。（2）優化后的pIFN-γ的發酵產量和活性對比，以未優化的SEQIDNO：2序列通過質粒轉入畢赤酵母并表達為對照，在5升發酵罐內發酵后，pIFN-γ和pIFN-γ-C的表達水平和活性分別如表3和4所示。表3為pIFN-γ和pIFN-γ-C5升發酵罐發酵水平實驗組表達量（mg/L）pIFN-γ248pIFN-γ-C1681表4為pIFN-γ和pIFN-γ-C5升發酵罐發酵產品活性實驗組活性單位（U/ml）pIFN-γ1.77×106pIFN-γ-C6.94×108由表3、4的結果可知，經優化的pIFN-γ-C的表達量和活性遠高于未優化的pIFN-γ。上述結果說明調整pIFN-γ的氨基酸序列有得于畢赤酵母的表達及提高其活性。實施例3天然未經過改造的pIFN-γ肽鏈序列如SEQIDNO：2所示，本發明利用本領域常用的基因突變方法將天然pIFN-γ肽鏈序列第129和131位氨基酸殘基由精氨酸（R）定向突變為組氨酸（H），得到SEQIDNO：1所示的優化的pIFN-γ肽鏈。（1）將SEQIDNO：1所示氨基酸序列的pIFN-γ肽鏈插入質粒pPICZαA，轉入與畢赤酵母KM71野生型感受態細胞，利用質粒上的抗性基因，通過高抗篩選得到具有目的基因高拷貝的畢赤酵母重組子，可以獲得能高效分泌表達具有高活性pIFN-γ的畢赤酵母工程菌。（2）優化后的pIFN-γ的發酵產量和活性對比，以未優化的SEQIDNO：2序列通過質粒轉入畢赤酵母并表達為對照，在5L發酵罐內發酵后，pIFN-γ和pIFN-γ-C的表達水平和活性分別如表5和6所示。表5為pIFN-γ和pIFN-γ-C5升發酵罐發酵水平實驗組表達量（mg/L）pIFN-γ189pIFN-γ-C843表6為pIFN-γ和pIFN-γ-C5升發酵罐發酵產品活性實驗組活性單位（U/ml）pIFN-γ3.59×106pIFN-γ-C8.42×108由表5、6的結果可知，經優化的pIFN-γ-C的表達量和活性遠高于未優化的pIFN-γ。上述結果說明調整pIFN-γ的氨基酸序列有得于畢赤酵母的表達及提高其活性。SEQUENCELISTING<110>華南農業大學<120>一種優化的pIFN-γ肽鏈及在提高畢赤酵母分泌表達豬IFN-γ產量和活性中的應用<130><160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>143<212>PRT<213>改造后的pIFN-γ肽鏈序列<400>1GlnAlaProPhePheLysGluIleThrIleLeuLysAspTyrPheAsn151015AlaSerThrSerAspValProAsnGlyGlyProLeuPheLeuGluIle202530LeuLysAsnTrpLysGluGluSerAspLysLysIleIleGlnSerGln354045IleValSerPheTyrPheLysPhePheGluIlePheLysAspAsnGln505560AlaIleGlnArgSerMetAspValIleLysGlnAspMetPheGlnArg65707580PheLeuAsnGlySerSerGlyLysLeuAsnAspPheGluLysLeuIle859095LysIleProValAspAsnLeuGlnIleGlnArgLysAlaIleSerGlu100105110LeuIleLysValMetAsnAspLeuSerProArgSerAsnLeuArgLys115120125HisLysHisSerGlnThrMetPheGlnGlyGlnArgAlaSerLys130135140<210>2<211>143<212>PRT<213>未改造pIFN-γ肽鏈序列<400>2GlnAlaProPhePheLysGluIleThrIleLeuLysAspTyrPheAsn151015AlaSerThrSerAspValProAsnGlyGlyProLeuPheLeuGluIle202530LeuLysAsnTrpLysGluGluSerAspLysLysIleIleGlnSerGln354045IleValSerPheTyrPheLysPhePheGluIlePheLysAspAsnGln505560AlaIleGlnArgSerMetAspValIleLysGlnAspMetPheGlnArg65707580PheLeuAsnGlySerSerGlyLysLeuAsnAspPheGluLysLeuIle859095LysIleProValAspAsnLeuGlnIleGlnArgLysAlaIleSerGlu100105110LeuIleLysValMetAsnAspLeuSerProArgSerAsnLeuArgLys115120125ArgLysArgSerGlnThrMetPheGlnGlyGlnArgAlaSerLys130135140當前第1頁1 2 3