本發明涉及一種提高吡咯喹啉醌產量的方法，屬于生物
技術領域：
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背景技術：
：吡咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinone，PQQ)，化學名稱為4，5-二氫-4，5-二氧化-1-氫吡咯(2，3f)醌-2，7，9一三羧酸，別名Methaxatin，是1979年由Salisbury等人發現的，最初描述是在細菌細胞中作為膜結合脫氫酶的氧化還原輔因子。目前，在許多不同生物體內都發現存在PQQ，它可以防止活細胞被體內或體外的氧損傷；還可作為營養因子和維生素促進細胞生長和提高細菌在極端條件下的耐受性；哺乳動物細胞分化中誘導蛋白激酶的產生；通過增加不溶性磷酸鹽的可利用性和作為生物防治劑來提高作物生產力；利用氧化還原特性應用于生物傳感器；眾多發現已經將PQQ具有異常高的氧化還原循環能力和它在抗神經細胞衰老、抗癌、藥劑、作為信號分子等方面的潛力關聯起來，其應用一旦成功，PQQ將發揮不可替代的重要作用。總之，吡咯喹啉醌有多種功能，作為營養因子或維生素參與多種生命活動，在農業、醫藥、輕工業和食品業等方面具有重要的開發價值。目前，化學法生產PQQ步驟繁雜、產率低、副產物多、提取純化步驟多，并用到有毒化學試劑，污染嚴重且后續處理困難。微生物發酵法具有降低生產成本，清潔低碳、溫和可控等優勢；同時發酵法一般以甲醇為唯一碳源，培養基以無機鹽為主，這有利于產品的提取。迄今發現的能過量產生PQQ的野生菌包括：無色桿菌屬、交替單胞菌屬、彎桿菌屬、生、甲烷單胞菌屬、甲基菌屬、甲基單胞菌屬、嗜甲基菌屬、甲基桿菌屬、微環菌屬、枝動菌屬、假單胞菌屬、精朊桿菌屬、原單胞菌屬、硫桿菌、黃色桿菌屬，以及粘球菌屬和副球菌屬等。目前的微生物產吡咯喹啉醌的研究，主要集中在高產野生菌的篩選、基因工程菌的構建等方面，而少有對產吡咯喹啉醌營養因子的研究。技術實現要素：為了克服上述問題，本發明提供了一種提高吡咯喹啉醌產量的方法，通過控制培養基中特定氨基酸含量以及維生素含量，有效地提高了吡咯喹啉醌的產量。在一種實施方式中，所述方法包括控制培養基中纈氨酸含量為150～200mg/L。在一種實施方式中，所述方法還包括控制培養基中維生素B2含量為4～8mg/L。在一種實施方式中，所述培養基中還含有氮源1～5g/L，硫酸鎂0.3～2.4g/L，磷酸二氫鉀1.4～2.8g/L，磷酸氫二鈉3～6g/L，氯化錳5～10mg/L，葉酸0.05～0.5mg/L，甲醇7～50g/L；初始pH6.5～7.2。在一種實施方式中，所述氮源可以是氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀。在一種實施方式中，所述培養基具體是：硫酸銨3g/L，硫酸鎂0.8g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉4g/L，氯化錳6mg/L，葉酸0.25mg/L，甲醇9g/L，纈氨酸175mg/L，維生素B2含量為6mg/L；初始pH7.0。在一種實施方式中，所述方法是以淺綠黃假單胞菌(Pseudomonasviridiflava)為發酵菌株進行發酵生產。在一種實施方式中，所述淺綠黃假單胞菌可以是以下任意一種：CGMCC1.3319、CGMCC1.3198、CGMCC1.3118。在一種實施方式中，所述發酵生產是在35℃、200rpm下發酵生產72h。本發明還要求保護按照上述方法發酵生產得到的吡咯喹啉醌及其在農業、醫藥、輕工業和食品業方面的應用。本發明的有益效果：本發明通過對淺綠黃假單胞菌產吡咯喹啉醌的營養因子進行分析，發現通過控制培養基中特定氨基酸含量以及維生素含量，能夠有效地提高吡咯喹啉醌的產量。采用本發明的方法，能夠使菌株產吡咯喹啉醌產量提高15％～89％。此外，本發明方法簡便、易控，適合工業化應用。具體實施方式吡咯喹啉醌的純化與提取：純化儀器如AKTAavant蛋白純化儀，將發酵上清液膜慮后以1mL/min流速經過DEAE陰離子交換柱，接著用2～5倍柱體積的檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)洗滌平衡，再以含有lMNaCl的檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)進行梯度洗脫，洗脫體積為10～20CV，得到初步純化后的呈紅色的PQQ產物。吡咯喹啉醌分析方法：(1)NBT－Gly化學法：見《3種檢測吡咯喹啉醌的方法比較》(生物技術通訊,2011,22(4):544-547.)。(2)HPLC分析：流動相為12.5mM磷酸二氫鉀溶液：甲醇＝85：15(v/v)；進樣量10～20μL；流速0.8～1.2mL/min；檢測波長254nm；柱溫30℃；檢測器為DAD；色譜柱為WatersSunFireTMC18反向柱(5μm，4.6mm×250mm)。(3)紫外吸收光譜分析：利用紫外-可見光分光光度計，對PQQ標準品和純化后的PQQ溶液直接進行220-400nm的波長掃描，測定二者的紫外吸收光譜是否一致。實施例1將淺綠黃假單胞菌CGMCC1.3198、CGMCC1.3118，分別活化后，分別接種到發酵培養基中進行發酵生產PQQ，其中發酵的條件是：在35℃、200rpm下發酵72h。發酵結束后測定上清液中PQQ含量。發酵培養基中含有：硫酸銨3g/L，硫酸鎂0.8g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉4g/L，氯化錳6mg/L，葉酸0.25mg/L，甲醇9g/L，纈氨酸含量為150mg/L，維生素B2含量為8mg/L；初始pH7.0。結果顯示，CGMCC1.3198、CGMCC1.3118的發酵上清中PQQ含量分別為30.96mg/L、20.25mg/L，比以不添加纈氨酸和維生素B2的發酵培養基發酵生產得到的PQQ含量分別提高了72％、35％。實施例2將淺綠黃假單胞菌CGMCC1.3198、CGMCC1.3118，分別活化后，分別接種到發酵培養基中進行發酵生產PQQ，其中發酵的條件是：在35℃、200rpm下發酵72h。發酵結束后測定上清液中PQQ含量。發酵培養基中含有：硫酸銨3g/L，硫酸鎂0.8g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉4g/L，氯化錳6mg/L，葉酸0.25mg/L，甲醇9g/L，纈氨酸含量為200mg/L，維生素B2含量為4mg/L；初始pH7.0。結果顯示，CGMCC1.3198、CGMCC1.3118的發酵上清中PQQ含量分別為32.04mg/L、19.80mg/L，比以不添加纈氨酸和維生素B2的發酵培養基發酵生產得到的PQQ含量分別提高了78％、32％。實施例3將3株淺綠黃假單胞菌CGMCC1.3319、CGMCC1.3198、CGMCC1.3118，分別活化后，分別接種到發酵培養基中進行發酵生產PQQ，其中發酵的條件是：在35℃、200rpm下發酵72h。發酵結束后測定上清液中PQQ含量。基礎發酵培養基中含有：硫酸銨3g/L，硫酸鎂0.8g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉4g/L，氯化錳6mg/L，葉酸0.25mg/L，甲醇9g/L；初始pH7.0。實驗組是在基礎發酵培養基的基礎上額外添加一定終濃度的氨基酸和/或維生素：A組：不添加；B組：175mg/L纈氨酸；C組：6mg/L維生素B2；D組：175mg/L纈氨酸、6mg/L維生素B2；E組：100mg/L纈氨酸；F組：250mg/L纈氨酸；G組：175mg/L蘇氨酸；H組：6mg/L維生素B1；I組：2mg/L維生素B2。表1不同培養基發酵生產對PQQ產量的影響CGMCC1.3319CGMCC1.3198CGMCC1.3118A組21mg/L18mg/L15mg/LB組12.9％8.3％7.2％C組5％12.8％9.8％D組15％89％45％E組9.4％8.1％6.5％F組13.1％8.2％7.0％G組4.3％2.9％7.1％H組6.2％3.3％10.8％I組8.0％10.8％6.7％注：B組～G組數據，為相應菌株相對于A組的PQQ產量提高的質量百分比。由表1數據可知，纈氨酸和維生素B2組合使用能夠有效提高淺綠黃假單胞菌發酵生產PQQ的產量，而且對CGMCC1.3198的提高作用要明顯強于其他兩株菌。雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。當前第1頁1 2 3