一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法與流程

本發明具體涉及生物學技術領域，具體涉及一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法。

背景技術：

蜱類是一種專性、非永久性寄生于陸生脊椎動物的醫學節肢動物，可通過直接叮咬和釋放毒素或攜帶病原體對宿主造成傷害。在進出境口岸蜱種類的調查中，對蜱蟲的鑒定及進化分型具有重要意義。目前，我國對于蜱種的鑒定主要依靠形態學方法，還沒有簡單、穩定的分子生物學手段。

技術實現要素：

為了解決現有技術的缺陷及不足，本發明提供了一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法，能夠在低DNA模板濃度下快速、穩定的鑒定蜱蟲的種類。

本發明采用的技術解決方案是：一種蜱蟲巢式PCR特異性引物，包括設計的兩對特異性引物，具體為：

T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；

T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；

T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；

T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。

一種蜱蟲巢式PCR鑒定方法，包括以下步驟：

(1)將需要檢測的蜱蟲樣品進行形態學上初步分型；

(2)將經過形態學初步分型鑒定處理后的蜱蟲樣品，每種各取一只，進行基因組提取DNA，蜱蟲樣品無需RNA酶處理；

(3)以蜱蟲樣品基因組DNA為模板，以所述的T18sF1+T18sR1為第一套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、雙蒸水，進行第一輪PCR；

(4)以第一輪PCR產物DNA為模板，分別以所述的T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1為第二套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、雙蒸水，進行第二輪PCR；

(5)取第二輪PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；

(6)將第二輪PCR產物進行序列測定；

(7)根據NCBI數據庫中記載的蜱蟲18s rRNA基因序列，進行系統進化分析，最終得出蜱蟲樣品鑒定結果。

所述的步驟(3)中的第一輪PCR反應條件為：預熱95℃，5min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 2min，共10個循環；末次延伸72℃，10min，4℃保存10min。

所述的步驟(4)中的第二輪PCR反應條件為：預熱95℃，5min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 2min，共25個循環；末次延伸72℃，10min，4℃保存10min。

所述的步驟(3)中蜱蟲樣品基因組DNA量為2μl，第一套引物中T18sF1+T18sR1各為1μl，LAtaq酶為0.25μl，dNTP為2μl，10×Loading buffer為2.5μl，雙蒸水16.25μl。

所述的步驟(4)中第一輪PCR產物DNA量為1μl，第二套引物T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1各為1μl，LAtaq酶為0.25μl，dNTP為2μl，10×Loading buffer為2.5μl，雙蒸水17.25μl。

所述的步驟(5)中第二輪PCR產物量為2μl。

本發明的有益效果是：本發明提供了一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法，采用更為敏感的巢式PCR方法，單蜱蟲甚至蜱蟲的部分組織器官提取的微量基因組DNA即可作為模板進行鑒定，通過在基因水平上進行蜱蟲的分型、系統進化分析，本發明巢式PCR方法第一輪只需10個循環，第二輪需25個循環，縮短了簡單的兩輪普通PCR所需時間。

附圖說明

圖1為18s rRNA巢式PCR方法克隆示意圖。

圖2為溫州口岸進口生牛皮中截獲蜱蟲形態學觀察。

圖3為兩輪輪PCR產物分別經瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定結果。

圖4為根據18s rRNA基因序列對蜱蟲進行系統進化分析結果。

具體實施方式

根據蜱蟲18s rRNA序列保守區設計兩對特異性引物

T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；

T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；

T 18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；

T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。

巢式PCR具體步驟

(1)蜱蟲

溫州口岸進口生牛皮中截獲蜱蟲，形態學上進行初步分型。

(2)提取蜱蟲基因組

形態學鑒定后，每一種蜱蟲取一只，按照基因組提取試劑盒(ZYMOL)說明進行基因組提取DNA，樣品無需RNA酶處理。

(3)克隆策略

克隆分兩步，按照圖1所示，

①以蜱蟲基因組DNA為模板(2μl)，以T18sF1+T18sR1為第一套引物(各1μl)，LAtaq酶(0.25μl)，dNTP(2μl)，10×Buffer(2.5μl)，ddH₂O(16.25μl)進行第一輪PCR，PCR程序為：

②以第一輪PCR產物DNA為模板(1μl)，分別以T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1為第二套引物(各1μl)，LAtaq酶(0.25μl)，dNTP(2μl)，10×Buffer(2.5μl)，ddH₂O(17.25μl)進行第一輪PCR，PCR程序為：

(4)PCR產物鑒定

取第二輪PCR產物2μl進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

(5)測序

將第二輪PCR產物送測序公司進行序列測定。

(6)根據18s rRNA基因序列進行基因型分析

在NCBI數據庫中下載蜱蟲18s rRNA基因序列，通過MEGA5.0軟件，進行系統進化分析

實驗結果

1、截獲蜱蟲形態學觀察

根據形態學觀察，將所截獲蜱蟲分成10種，命名為T1～T10，如圖2所示。

2、提取蜱蟲基因組

每種蜱蟲取一只，按照基因組提取試劑盒(ZYMOL)說明進行基因組提取DNA，所提基因組DNA濃度為50～100ng/μl。

3、巢式PCR結果

以所獲得的蜱蟲基因組DNA為模板，經兩輪PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定產物，如圖3所示。以T18sF1+T18sR1為第一套引物，進行PCR，結果顯示T3、T4、T5、T8、T10均出現目的條帶，但其余5種蜱蟲未出現擴增產物條帶，如圖3a；以第一輪產物為模板，進行第二輪巢式PCR后，10種測試樣品均出現目的條帶，如圖3b。將克隆產物送公司進行測序。

4、根據18srRNA基因序列進行基因型分析

測序產物，通過拼接后，為18s rRNA基因序列。與NCBI中已公布的蜱蟲18s rRNA基因序列進行比對分析，通過MEGA5.0軟件，進行系統進化分析，結果表明，T1、T2、T3、T4、T8可能為Amblyomma或Aponomma的亞種；T5、T9與Boophilus和Rhipicephalus序列相似性為100％；T6、T10為Boophilus和Rhipicephalus的亞種，如圖4所示。

本發明通過建立了更為敏感的巢式PCR方法。單蜱蟲甚至蜱蟲的部分組織器官提取的微量基因組DNA即可作為模板進行鑒定。

現有技術對于蜱蟲的分型主要通過形態學觀察，本發明是在基因水平上進行蜱蟲的分型、系統進化分析，與形態學方法具有本質的區別。

本發明中，巢式PCR方法第一輪只需10個循環，第二輪需25個循環，縮短了簡單的兩輪普通PCR所需時間。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，本發明的保護范圍并不僅局限于上述實施例，凡屬于本發明思路下的技術方案均屬于本發明的保護范圍。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理前提下的若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。