一種分子標(biāo)志物在口腔鱗狀細(xì)胞癌診斷和治療中的應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種分子標(biāo)志物在口腔鱗狀細(xì)胞癌診斷和治療中的應(yīng)用，具體的該分子標(biāo)志物為GDPD2。

背景技術(shù)：

口腔鱗癌是口腔部位及周邊最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率占到口腔部位腫瘤總發(fā)病率的80％以上，是值得引起人們高度關(guān)注和重視的惡性疾病之一。雖然在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家口腔鱗癌的發(fā)病率有所下降，但在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率仍然呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。近年來(lái)隨著醫(yī)療水平的不斷提高，許多惡性腫瘤的治療方面取得了不小的進(jìn)步，通過(guò)治療提高了患者的5年生存率。但在口腔鱗癌的治療方面，由于此疾病的發(fā)生早期不易被患者察覺(jué)等特殊性，致使該疾病的治療滯后，癌癥晚期的治療難度加大。因而有必要加大對(duì)口腔鱗癌治療的關(guān)注度，尋找出口腔鱗癌的更好的治療方法。

口腔鱗癌的治療方面，常規(guī)的治療方法包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、免疫治療等。這些治療方法雖然在一定程度上會(huì)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但又存在較大的治療弊端。例如放療、化療會(huì)不可避免的引起嚴(yán)重副反應(yīng)而手術(shù)治療存在操作不易進(jìn)行等特點(diǎn)，單純手術(shù)治療無(wú)法根治腫瘤等方面的缺陷。免疫治療的療效并不明顯。而基因治療和分子靶向治療為近年來(lái)新興的腫瘤治療手段，由于其副反應(yīng)小、療效確切等方面的優(yōu)勢(shì)得到了科研工作者的青睞。

分子靶向治療是指在細(xì)胞分子水平上，調(diào)控腫瘤相關(guān)基因、干預(yù)腫瘤異常的信號(hào)通路或阻斷能量通路，尋找可干預(yù)的分子靶點(diǎn)對(duì)口腔鱗癌的靶向治療具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于口腔鱗狀細(xì)胞癌診斷和治療的生物標(biāo)志物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了GDPD2基因或其表達(dá)產(chǎn)物的用途，用于制備診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括通過(guò)通過(guò)測(cè)序技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)或免疫測(cè)定的方法檢測(cè)GDPD2基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的變化。

進(jìn)一步，所述核酸擴(kuò)增技術(shù)選自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴(kuò)增和基于核酸序列的擴(kuò)增。

本發(fā)明提供了一種診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過(guò)檢測(cè)樣本中GDPD2基因基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的變化來(lái)診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒或制劑。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒或制劑。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)GDPD2基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)GDPD2基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的GDPD2蛋白的特異性抗體或配體；所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)GDPD2基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括GDPD2蛋白的特異性抗體或配體。

本發(fā)明所述的基因芯片或基因檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)包括GDPD2基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平。所述蛋白芯片或蛋白免疫檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)包括GDPD2蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。將口腔鱗狀細(xì)胞癌的多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可大大提高口腔鱗狀細(xì)胞癌診斷的準(zhǔn)確率。

本發(fā)明提供了GDPD2基因在制備治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的藥物組合物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述藥物組合物包括GDPD2基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的促進(jìn)劑。

進(jìn)一步，所述促進(jìn)劑包括GDPD2基因表達(dá)產(chǎn)物、促進(jìn)型miRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分子化合物

本發(fā)明提供了一種抑制細(xì)胞增殖的方法，所述方法為向培養(yǎng)體系中加入GDPD2基因、蛋白或其促進(jìn)劑。

本發(fā)明提供了一種組合藥物，所述組合藥物包括上述的藥物組合物、和含抗腫瘤劑的藥物組合物。

進(jìn)一步，抗腫瘤劑的藥物組合物包括但不限于免疫治療劑如西妥昔單克隆抗體，化學(xué)治療劑或化學(xué)放射性治療劑如卡波鉑或者是一種相關(guān)類別的鉑類藥物、紫杉烷或者是一種類別的紫衫烷，或者是兩者。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了分子標(biāo)志物GDPD2與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)受試者GDPD2的變化，可用于口腔鱗癌的診斷。

本發(fā)明提供了一種治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的分子手段，通過(guò)改變口腔鱗癌的分子靶標(biāo)的表達(dá)從而干預(yù)或者抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌。

附圖說(shuō)明

圖1顯示利用QPCR檢測(cè)GDPD2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況；

圖2顯示利用QPCR檢測(cè)GDPD2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)情況；

圖3顯示利用QPCR檢測(cè)GDPD2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的轉(zhuǎn)染情況；

圖4顯示MTT法檢測(cè)GDPD2對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖活性的影響；

圖5顯示利用transwell小室檢測(cè)GDPD2基因?qū)谇击[狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲的影響。

具體的實(shí)施方式

本發(fā)明經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，通過(guò)大量篩選，首次發(fā)現(xiàn)了在口腔鱗狀細(xì)胞癌中GDPD2呈現(xiàn)特異性低表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)特異提高GDPD2的表達(dá)平或表達(dá)產(chǎn)物的活性，能夠有效地抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和侵襲，從而達(dá)到抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的效果。在此基礎(chǔ)上完成本發(fā)明。

GDPD2蛋白是一種甘油磷酸二酯磷酸二酯酶，用于水解甘油磷酸肌醇產(chǎn)生1-磷酸肌醇和甘油。該蛋白在成骨分化和生長(zhǎng)中起著重要的作用。

可用于本發(fā)明的GDPD2多核苷酸或蛋白(多肽)序列包括各種來(lái)源和物種的GDPD2，并且包括野生型、突變型的GDPD2，或其活性片段。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述GDPD2來(lái)源于人類，一種代表性的人GDPD2的編碼序列或氨基酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。

本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。

編碼GDPD2的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。

本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼GDPD2蛋白的多核苷酸。

本發(fā)明的人GDPD2核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。

本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CHO、COS、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。

用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl₂法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl₂。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。

在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)志物”是其在組織或細(xì)胞中的表達(dá)水平與正常或健康細(xì)胞或組織的表達(dá)水平相比發(fā)生改變的任何基因或蛋白。

本文包含用于檢測(cè)生物標(biāo)志物表達(dá)的現(xiàn)有技術(shù)中任何可用方法。本發(fā)明生物標(biāo)志物的表達(dá)可在核酸水平上被檢測(cè)(如，RNA轉(zhuǎn)錄物)或蛋白質(zhì)水平。通過(guò)“檢測(cè)表達(dá)”旨在確定RNA轉(zhuǎn)錄物或其生物標(biāo)志物基因的表達(dá)產(chǎn)物的數(shù)量或存在。因此，“檢測(cè)表達(dá)”包含一生物標(biāo)志物被確定不能被表達(dá)、不能被檢測(cè)表達(dá)，表達(dá)在低水平、表達(dá)在正常水平或過(guò)表達(dá)的實(shí)例。為了確定低表達(dá)，被檢查的所述身體樣本能夠與相應(yīng)的來(lái)自健康人的身體樣本比較。那就是說(shuō)，所述表達(dá)的“正?！彼绞巧飿?biāo)志物的表達(dá)水平，例如在來(lái)自人類主體或未被口腔鱗狀細(xì)胞癌折磨的病患的宮頸組織樣本中的生物標(biāo)志物表達(dá)水平。這個(gè)樣本可以以標(biāo)準(zhǔn)化形式呈現(xiàn)。在一些實(shí)施例中，生物標(biāo)志物過(guò)表達(dá)的確定需不比較身體樣本和相應(yīng)來(lái)自健康人的身體樣本。

本發(fā)明所述核酸擴(kuò)增技術(shù)選自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。其中，PCR需要在擴(kuò)增前將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接擴(kuò)增RNA。

通常，PCR使用變性、引物對(duì)與相反鏈的退火以及引物延伸的多個(gè)循環(huán)，以指數(shù)方式增加靶核酸序列的拷貝數(shù)；RT-PCR則將逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)用于從mRNA制備互補(bǔ)的DNA(cDNA)，然后將cDNA通過(guò)PCR擴(kuò)增以產(chǎn)生DNA的多個(gè)拷貝；TMA在基本上恒定的溫度、離子強(qiáng)度和pH的條件下自身催化地合成靶核酸序列的多個(gè)拷貝，其中靶序列的多個(gè)RNA拷貝自身催化地生成另外的拷貝，TMA任選地包括使用阻斷，部分、終止部分和其他修飾部分，以改善TMA過(guò)程的靈敏度和準(zhǔn)確度；LCR使用與靶核酸的相鄰區(qū)域雜交的兩組互補(bǔ)DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在熱變性、雜交和連接的重復(fù)多個(gè)循環(huán)中通過(guò)DNA連接酶共價(jià)連接，以產(chǎn)生可檢測(cè)的雙鏈連接寡核苷酸產(chǎn)物；SDA使用以下步驟的多個(gè)循環(huán)：引物序列對(duì)與靶序列的相反鏈進(jìn)行退火，在存在dNTPαS下進(jìn)行引物延伸以產(chǎn)生雙鏈半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸產(chǎn)物，半修飾的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行的核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的切刻，以及從切口3'端進(jìn)行的聚合酶介導(dǎo)引的物延伸以置換現(xiàn)有鏈并產(chǎn)生供下一輪引物退火、切刻和鏈置換的鏈，從而引起產(chǎn)物的幾何擴(kuò)增。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，“探針”通常指能通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定法。

作為探針，可以使用熒光標(biāo)記、放射標(biāo)記、生物素標(biāo)記等對(duì)癌檢測(cè)用多核苷酸進(jìn)行了標(biāo)記的標(biāo)記探針。多核苷酸的標(biāo)記方法本身是公知的。可通過(guò)如下方法檢查試樣中是否存在受試核酸：固定受試核酸或者其擴(kuò)增物，與標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，洗滌，以及然后測(cè)定與固相結(jié)合的標(biāo)記。備選地，還可固定癌檢測(cè)用多核苷酸，使受試核酸與其雜交，然后應(yīng)用標(biāo)記探針等檢測(cè)結(jié)合于固相上的受試核酸。在這種情況下，結(jié)合于固相上的癌檢測(cè)用多核苷酸也稱為探針。使用多核苷酸探針測(cè)定受試核酸的方法在本領(lǐng)域也是公知的。可以如下進(jìn)行該方法：在緩沖液中使多核苷酸探針與受試核酸在Tm或者其附近(優(yōu)選在±4℃以內(nèi))接觸用于雜交，洗滌，然后測(cè)定雜交的標(biāo)記探針或者與固相探針結(jié)合的模板核酸。

在作為探針使用的多核苷酸的大小優(yōu)選為18個(gè)或更多個(gè)核苷酸、更優(yōu)選為20個(gè)或更多個(gè)核苷酸，以及編碼區(qū)域的全長(zhǎng)或更少。作為引物使用時(shí)，該多核苷酸大小優(yōu)選為18個(gè)或更多個(gè)核苷酸，以及50個(gè)或更少核苷酸。

術(shù)語(yǔ)“芯片”也稱為“陣列”，指包含連接的核酸或肽探針的固體支持物。陣列通常包含按照不同的已知位置連接至基底表面的多種不同的核酸或肽探針。這些陣列，也稱為“微陣列”，通?？梢岳脵C(jī)械合成方法或光引導(dǎo)合成方法來(lái)產(chǎn)生這些陣列，所述光引導(dǎo)合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的組合。陣列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝膠、聚合物表面、諸如光纖的纖維、玻璃或任何其它合適的基底上的核酸或肽?？梢砸砸欢ǖ姆绞絹?lái)包裝陣列，從而允許進(jìn)行全功能裝置的診斷或其它方式的操縱。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“抗體”是指選擇性結(jié)合目標(biāo)抗原的天然或合成抗體。該術(shù)語(yǔ)包括多克隆和單克隆抗體。除了完整的免疫球蛋白分子外，那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物以及選擇性結(jié)合目標(biāo)抗原的免疫球蛋白分子的人類或人源化形式也包括在術(shù)語(yǔ)“抗體”的范圍內(nèi)，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性即可?！皢慰寺】贵w”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類變體一般以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過(guò)包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過(guò)程得到的。

單克隆抗體還包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性即可。

多克隆抗體包含對(duì)產(chǎn)生人抗體的動(dòng)物(例如，小鼠)免疫GDPD2蛋白質(zhì)而得的抗體。當(dāng)制備了嵌合抗體或人源化抗體之后，可以將可變區(qū)(例如，F(xiàn)R)和/或恒定區(qū)中的氨基酸用其他氨基酸替換等。

本發(fā)明中的GDPD2促進(jìn)劑，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可促進(jìn)GDPD2基因和/或蛋白的表達(dá)或活性，從而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述GDPD2促進(jìn)劑包括GDPD2基因表達(dá)產(chǎn)物、促進(jìn)型miRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分子化合物。

通?？蓪⑦@些促進(jìn)劑配置于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳的pH約為6-8，盡管pH值可隨被配置物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配置好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑給藥，其中包括但并不限于口服給藥、非胃腸道給藥、通過(guò)吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、或通過(guò)植入的貯藥裝置給藥。本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)非胃腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞠內(nèi)、損傷部位內(nèi)、和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。只要能達(dá)到目標(biāo)組織即可。

本發(fā)明中的藥物組合物，含有安全有效量的本發(fā)明GDPD2蛋白或其促進(jìn)劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類藥物組合物，可以通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制備?；钚猿煞值慕o藥量是治療的有效量。

本發(fā)明的藥物組合物可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的GDPD2蛋白的缺失或不足，通過(guò)提高GDPD2蛋白的表達(dá)或增強(qiáng)GDPD2蛋白的功能，從而治療因GDPD2蛋白減少導(dǎo)致的口腔鱗狀細(xì)胞癌。

本發(fā)明的藥物還可與其他治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同時(shí)給藥。還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時(shí)給藥，而其它劑量可以單獨(dú)給藥。在治療過(guò)程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“治療”是指以治愈、改善、穩(wěn)定或預(yù)防疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的對(duì)患者進(jìn)行的醫(yī)學(xué)管理。該術(shù)語(yǔ)包括積極療法，即專門以改善疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的的治療，并且還包括病因治療，即以除去相關(guān)疾病、病理狀態(tài)或病癥的病因?yàn)槟康牡闹委煛４送猓撔g(shù)語(yǔ)還包括姑息治療，即設(shè)計(jì)用于緩解癥狀而非治愈疾病、病理狀態(tài)或病癥的治療；預(yù)防性治療，即以最大程度降低或者部分或完全抑制相關(guān)疾病、病理狀態(tài)或病癥的發(fā)展為目的的治療；以及支持性治療，即用于補(bǔ)充另一種以改善相關(guān)疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的的特定療法的治療。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“樣本”是指從目標(biāo)患者得到的組合物，其包含細(xì)胞和/或其他分子體—將進(jìn)行特征化和/或識(shí)別，例如，根據(jù)物理、生化、化學(xué)和/或生理特征。例如，短語(yǔ)“臨床樣本”或“疾病樣本”及其變體，是指從目標(biāo)患者獲得的任何樣本，將預(yù)期或已知所述樣本中能夠獲得細(xì)胞和/或分子體，例如將被特征化的生物標(biāo)志物。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1 篩選與口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集6例周圍正常粘膜組織和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織，均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)，所有患者術(shù)前未接受任何形式的治療。手術(shù)切下的樣本于液氮中凍存，患者均知情同意，上述所有標(biāo)本的取得均通過(guò)組織倫理委員會(huì)的同意。

2、RNA樣品的制備(利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒進(jìn)行操作)

取出凍存于液氮中的組織樣本，把組織樣本放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，按照試劑盒中的說(shuō)明書(shū)提取分離RNA。具體如下：

1)加入Trizol，室溫放置5min；

2)加入氯仿0.2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5-10min；

3)12000rpm離心15min，將上層水相移到另一新的離心管中(注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì))，加入等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10min；

4)12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗滌沉淀(4℃保存)，洗滌沉淀物，振蕩混勻，4℃，12000rpm離心5min；

5)棄去乙醇液體，室溫下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；

6)用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度及濃度，凍存于-70℃冰箱。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記

用Low RNA Input Linear Amplification Kit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)用Cy3分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

4、雜交

基因芯片采用Aglient公司的人全基因組表達(dá)譜芯片,每張芯片包括45015個(gè)寡核苷酸，其中有43376個(gè)人基因探針和1639個(gè)實(shí)驗(yàn)控制探針。按芯片使用說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行，溫度在65℃，經(jīng)17h 10r/min滾動(dòng)雜交，37℃洗片。

5、數(shù)據(jù)處理

雜交后芯片用Agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動(dòng)以100％和10％PMT各掃描1次，2次結(jié)果Agilent軟件自動(dòng)合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用Feature Extraction進(jìn)行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用Bioconductor程序包進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后Ratio值為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：ratio≥4為上調(diào)基因，ratio≤0.25為下調(diào)基因。

6、結(jié)果

與正常粘膜組織相比，GDPD2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)量顯著下調(diào)。

實(shí)施例2 QPCR測(cè)序驗(yàn)證GDPD2基因的差異表達(dá)

1、對(duì)GDPD2基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式選擇正常粘膜組織和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織各80例。

2、RNA提取 步驟如實(shí)施例1所述。

3、逆轉(zhuǎn)錄：

1)反應(yīng)體系：

2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件

按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件進(jìn)行。

42℃60min，99℃2min，5℃5min。

3)聚合酶鏈反應(yīng)

1)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genebank中GDPD2基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增引物，由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下：

GDPD2基因：

正向引物為5’-TACCGTATCCACCGAAGA-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物為5’-CAAGTAGATGACCAGGACAA-3’(SEQ ID NO.4)。

管家基因GAPDH的引物序列為：

正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)

2)按照表1配制25μl PCR反應(yīng)體系：

表1 PCR反應(yīng)體系

3)PCR反應(yīng)條件：94℃4min，(94℃20s，60℃30s、72℃30s)×30個(gè)循環(huán)。以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量，每個(gè)樣進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算口腔鱗狀細(xì)胞癌組織與正常粘膜組織熒光定量RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

6、結(jié)果

如圖1所示，與對(duì)照組相比，GDPD2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例3 GDPD2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)

1、細(xì)胞培養(yǎng)

口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113、HN13，正常粘膜上皮細(xì)胞系HIOEC購(gòu)自于上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院。HIOEC的培養(yǎng)基為K-SFM；Tca8113、HN13的培養(yǎng)基為DMEM；以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基在37℃、5％CO₂、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、細(xì)胞總RNA的提取

1)當(dāng)細(xì)胞達(dá)80-90％融合時(shí)終止培養(yǎng)，0.25％胰蛋白酶消化收集細(xì)胞于1.5m1EP管中，每管中加入lm1Trizol緩慢搖動(dòng)破碎細(xì)胞，冰上放置10min。

2)去蛋白，去DNA：每個(gè)1.5m1EP管加入0.2ml三氯甲烷，搖晃15s，室溫放置10min。4℃，12000rpm離心15min。

剩余操作步驟同組織中RNA提取過(guò)程。

3、逆轉(zhuǎn)錄

具體步驟同實(shí)施例2.

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常粘膜上皮細(xì)胞相比，GDPD2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113、HN13中表達(dá)均下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例4 GDPD2基因的過(guò)表達(dá)

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca8113，以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO₂、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、GDPD2基因的過(guò)表達(dá)

GDPD2基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GDPD2基因的編碼序列(如SEQ ID NO.1所示)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-CCGAAGCTTGCCACCATGGACTGGTCCCTGGCATT-3’(SEQ ID NO.7)

反向引物：5’-CGGCTCGAGCTCCATCATGAAATTGTTGATCC-3’(SEQ ID NO.8)

從成人胎腦的cDNA文庫(kù)(clontech公司，貨號(hào)：638831)中擴(kuò)增全長(zhǎng)的GDPD2基因的編碼序列，上述cDNA序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI雙酶切后插入到經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI雙酶切的真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1中，連接獲得的重組載體pcDNA3.1-GDPD2用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3、轉(zhuǎn)染

將口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞分為三組，分別為對(duì)照組(Tca8113)、空白對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC)、和GDPD2過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GDPD2)。使用脂質(zhì)體2000進(jìn)行載體的轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染方法按照說(shuō)明書(shū)的指示進(jìn)行。pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-GDPD2的轉(zhuǎn)染濃度均為0.5μg/ml。

4、QPCR檢測(cè)GDPD2基因的轉(zhuǎn)錄水平

4.1細(xì)胞總RNA的提取

具體步驟同實(shí)施例3。

4.2逆轉(zhuǎn)錄 步驟同實(shí)施例2。

4.3 QPCR擴(kuò)增 步驟同實(shí)施例2。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，GDPD2基因過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖3顯示，與非轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染GDPD2組中過(guò)表達(dá)GDPD2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

實(shí)施例5 MTT法檢測(cè)Tca8113細(xì)胞增殖活性

應(yīng)用MTT法檢測(cè)GDPD2基因過(guò)表達(dá)對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖活性的影響。

1、細(xì)胞培養(yǎng) 將Tca8113細(xì)胞按1×10³/孔接種于96孔板，每孔100μ1，37℃，5％CO₂孵箱內(nèi)孵育培養(yǎng)。

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染 步驟同實(shí)施例3。

3、MTT檢測(cè)

1)分別于轉(zhuǎn)染1～7天時(shí)，棄掉各孔培養(yǎng)基，加入MTT(5mg/ml)20μl。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4h。

2)吸去混合液，每孔加入DMSO 200μl，震蕩10min使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫儀上測(cè)490nm處的光吸收值，記錄結(jié)果。

4、以時(shí)間為橫軸，光吸收值(OD)為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

5、結(jié)果：

結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GDPD2組的細(xì)胞增殖顯著降低。

實(shí)施例6 Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染第6天收集不同組別的Tca8113細(xì)胞，重懸于培養(yǎng)液中，使細(xì)胞終濃度為2×10⁶/ml，吸取100μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室中。應(yīng)用Transwell小室方法觀察GDPD2基因過(guò)表達(dá)對(duì)Tca8113細(xì)胞侵襲性的影響。

1、將Matrigel(4μg/μl)放入4℃融化，準(zhǔn)備冰盒(冰浴環(huán)境)。Matrigel用DMEM稀釋8倍后使用。在Transwell小室濾膜(8μm孔徑)的外表面涂8μg人纖粘連蛋白，置超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干。

2、在6孔Transwell小室濾膜的內(nèi)表面鋪以100μ1/孔的Matrigel膠，37℃、5％CO₂孵箱內(nèi)孵育1h，形成一個(gè)基質(zhì)屏障層備用。

3、在6孔板每孔內(nèi)加入含20％FBS的DMEM培養(yǎng)液2.5m1。

4、收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，重懸于培養(yǎng)液中，終濃度為2×10⁶/ml。

5、將細(xì)胞懸液加入Transwell小室中，每孔100μ1，將小室浸于6孔板的條件培養(yǎng)基中，37℃、5％CO₂孵箱內(nèi)孵育24h。

6、將Transwell小室取出，濾膜用甲醇固定1分鐘。

7、HE染色：蘇木精染色3min，水洗；伊紅染色10～30s，水洗。并用棉簽擦掉未穿過(guò)膜的細(xì)胞。

8、顯微鏡下觀察、照相并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，每膜計(jì)數(shù)上下左右中5個(gè)不同視野的透過(guò)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。每組平行設(shè)3個(gè)濾膜。

9、數(shù)據(jù)處理

用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

10、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，Tca8113、pcDNA3.1-GDPD2、pcDNA3.1-GDPD2組細(xì)胞在transwell小室中培養(yǎng)24h后，pcDNA3.1-GDPD2組聚碳酸酯膜下室面的細(xì)胞數(shù)顯著減少。

上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120> 一種分子標(biāo)志物在口腔鱗狀細(xì)胞癌診斷和治療中的應(yīng)用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atggactggt ccctggcatt cctgctggtc atctctctac tggtcacata tgcatccttg 60

ctattggtcc tggccctgct cctgcggctt tgtagacagc ccctgcatct gcacagcctc 120

cacaaggtgc tgctgctcct cattatgctg cttgtggcgg ctggccttgt gggactggac 180

atccaatggc agcaggagtg gcatagcttg cgtgtgtcac tgcaggccac agccccattc 240

cttcatattg gagcagccgc tggaattgcc ctcctggcct ggcctgtggc tgataccttc 300

taccgtatcc accgaagagg tcccaagatt ctgctactgc tcctattttt tggagttgtc 360

ctggtcatct acttggcccc cctatgcatc tcctcaccct gcatcatgga acccagagac 420

ttaccaccca agcctgggct ggtgggacac cgaggggccc ccatgctggc tcccgagaac 480

accctgatgt ccttgcggaa gacagctgaa tgcggagcta ctgtgtttga gactgatgtg 540

atggtcagct ccgatggggt ccccttcctc atgcatgatg agcacctcag caggaccacg 600

aatgtagcct ctgtattccc aacccgaatc acagcccaca gcagtgactt ctcctggact 660

gaactgaaga gactcaatgc tggatcctgg ttcctagaga ggcgaccctt ctggggggcc 720

aaaccgctgg caggccctga tcagaaagag gctgagagtc agacggtacc agcattagaa 780

gagctattgg aggaagctgc agccctcaac ctttccatca tgttcgactt gcgccgaccc 840

ccacagaacc acacatacta tgacactttt gtgatccaga cattggagac tgtgctgaat 900

gcaagggtgc cccaagccat ggtcttttgg ctaccagatg aagatcgggc taatgtccaa 960

cgacgggcac ctggaatgcg ccagatatat ggacgtcagg gaggcaacag aacggagagg 1020

ccccagtttc ttaacctccc ctatcaagat ctgccactat tggatatcaa ggcattgcat 1080

aaggataatg tctcggtgaa cctatttgta gtgaacaagc cctggctctt ctctctgctt 1140

tggtgtgcag gggtggattc ggtcaccacc aacgactgcc agctgctgca gcagatgcgt 1200

taccctatct ggcttattac ccctcaaacc tacctaatca tatgggtcat taccaattgt 1260

gtttccacca tgctgctttt gtggaccttc ctcctccaaa gaagatttgt taagaagaga 1320

gggaaaactg gcttagaaac agcagtgctg ctgacaagga tcaacaattt catgatggag 1380

tga 1383

<210> 2

<211> 460

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Asp Trp Ser Leu Ala Phe Leu Leu Val Ile Ser Leu Leu Val Thr

1 5 10 15

Tyr Ala Ser Leu Leu Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu Arg Leu Cys Arg

20 25 30

Gln Pro Leu His Leu His Ser Leu His Lys Val Leu Leu Leu Leu Ile

35 40 45

Met Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Val Gly Leu Asp Ile Gln Trp Gln

50 55 60

Gln Glu Trp His Ser Leu Arg Val Ser Leu Gln Ala Thr Ala Pro Phe

65 70 75 80

Leu His Ile Gly Ala Ala Ala Gly Ile Ala Leu Leu Ala Trp Pro Val

85 90 95

Ala Asp Thr Phe Tyr Arg Ile His Arg Arg Gly Pro Lys Ile Leu Leu

100 105 110

Leu Leu Leu Phe Phe Gly Val Val Leu Val Ile Tyr Leu Ala Pro Leu

115 120 125

Cys Ile Ser Ser Pro Cys Ile Met Glu Pro Arg Asp Leu Pro Pro Lys

130 135 140

Pro Gly Leu Val Gly His Arg Gly Ala Pro Met Leu Ala Pro Glu Asn

145 150 155 160

Thr Leu Met Ser Leu Arg Lys Thr Ala Glu Cys Gly Ala Thr Val Phe

165 170 175

Glu Thr Asp Val Met Val Ser Ser Asp Gly Val Pro Phe Leu Met His

180 185 190

Asp Glu His Leu Ser Arg Thr Thr Asn Val Ala Ser Val Phe Pro Thr

195 200 205

Arg Ile Thr Ala His Ser Ser Asp Phe Ser Trp Thr Glu Leu Lys Arg

210 215 220

Leu Asn Ala Gly Ser Trp Phe Leu Glu Arg Arg Pro Phe Trp Gly Ala

225 230 235

Lys Pro Leu Ala Gly Pro Asp Gln Lys Glu Ala Glu Ser Gln Thr Val

245 250 255

Pro Ala Leu Glu Glu Leu Leu Glu Glu Ala Ala Ala Leu Asn Leu Ser

260 265 270

Ile Met Phe Asp Leu Arg Arg Pro Pro Gln Asn His Thr Tyr Tyr Asp

275 280 285

Thr Phe Val Ile Gln Thr Leu Glu Thr Val Leu Asn Ala Arg Val Pro

290 295 300

Gln Ala Met Val Phe Trp Leu Pro Asp Glu Asp Arg Ala Asn Val Gln

305 310 315 320

Arg Arg Ala Pro Gly Met Arg Gln Ile Tyr Gly Arg Gln Gly Gly Asn

325 330 335

Arg Thr Glu Arg Pro Gln Phe Leu Asn Leu Pro Tyr Gln Asp Leu Pro

340 345 350

Leu Leu Asp Ile Lys Ala Leu His Lys Asp Asn Val Ser Val Asn Leu

355 360 365

Phe Val Val Asn Lys Pro Trp Leu Phe Ser Leu Leu Trp Cys Ala Gly

370 375 380

Val Asp Ser Val Thr Thr Asn Asp Cys Gln Leu Leu Gln Gln Met Arg

385 390 395 400

Tyr Pro Ile Trp Leu Ile Thr Pro Gln Thr Tyr Leu Ile Ile Trp Val

405 410 415

Ile Thr Asn Cys Val Ser Thr Met Leu Leu Leu Trp Thr Phe Leu Leu

420 425 430

Gln Arg Arg Phe Val Lys Lys Arg Gly Lys Thr Gly Leu Glu Thr Ala

435 440 445

Val Leu Leu Thr Arg Ile Asn Asn Phe Met Met Glu

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taccgtatcc accgaaga 18

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caagtagatg accaggacaa 20

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ctctggtaaa gtggatattg t 21

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cggctcgagc tccatcatga aattgttgat cc 32