抗IDO1蛋白單克隆抗體及其用途的制作方法

本發明涉及生物技術領域，具體涉及可特異結合IDO1蛋白的單克隆抗體Umab126、產生所述單克隆抗體的細胞株及應用該抗體用于診斷的方法和用途。

背景技術：

IDO1是一種細胞內含亞鐵血紅素的酶，通過催化氧化裂解色氨酸分子中的吲哚環，從而使色氨酸沿犬尿酸途徑分解代謝。IDO1在多種腫瘤組織中有高表達，通過降低腫瘤微環境中色氨酸濃度來抑制淋巴細胞的增值。因此，目前認為IDO1的高表達是導致機體對腫瘤產生免疫耐受的重要因素之一。目前臨床上常用免疫組織化學(IHC)病理實驗檢測腫瘤細胞中蛋白的表達狀況，然而IHC實驗的核心為特異性結合蛋白的單克隆抗體，其性能的優劣直接決定著整個檢測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結合特異性較高的針對IDO1蛋白的單克隆抗體對IHC檢測IDO1表達水平具有重要的意義。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種結合特異性較高的IDO1蛋白的單克隆抗體，及其在制備用于檢測IDO1蛋白的免疫檢測工具中的應用。

本發明提供了一種雜交瘤細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為CGMCC)，保藏日期為2016年4月27日，保藏編號為CGMCC No.12286。

本發明還提供了一種特異性結合IDO1蛋白的單克隆抗體Umab126，由上述雜交瘤細胞株產生。

本發明所述單克隆抗體的制備方法如下：

(1)重組表達載體的構建：根據IDO1ORF核苷酸序列(IDO1ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，1212bp；IDO1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)

設計引物PCR擴增IDO1ORF第1bp位到第1209bp位序列，基因兩側分別引入限制性內切酶位點SgfI和MluI，插入表達載體pCMV6-Entry，構建IDO1氨基酸序列第1位到第289位的重組表達質粒pCMV6-rIDO1；上游擴增引物序列，SEQ ID NO.3:CACGCGATCGCATGGCACACGCTATGGAAAACT下游擴增引物序列SEQ ID NO.4:ACCGACGCGTCTTCCTTCAAAAGGGATTTCTCA

(2)IDO1重組蛋白的表達與純化：將IDO1重組表達質粒轉化HEK293T細胞，裂解離心獲得上清，DDK親和層析柱純化，獲得純化的IDO1重組蛋白；

(3)單克隆抗體的篩選與制備：采用上述純化的IDO1重組蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾臟細胞與SP2/0細胞進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，獲得能分泌抗IDO1特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為Umab126，亞型鑒定為IgG1；通過無血清培養基制備抗體，通過親和層析柱純化獲得IDO1單克隆抗體Umab126。分別通過Western Blot、免疫組化實驗驗證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。

進一步采用OriGene高密度蛋白芯片對上述單克隆抗體的特異性進行驗證：OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000個HEK293T細胞蛋白過表達裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過Excel文件進行準確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣，每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監控每次免疫反應數據的重復性，以及定位陽性信號的方向。

本發明將所述單克隆抗體Umab126與上述芯片雜交并確定陽性信號位點，結果顯示本發明所述單克隆抗體Umab126特異性結合IDO1蛋白，而與其他蛋白無交叉反應。

本發明還提供了單克隆抗體Umab126在制備用于檢測IDO1蛋白的免疫檢測工具中的應用。

具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。

在具體的實施例中，本發明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗體Umab126，可檢測組織細胞中IDO1的表達狀況。

本發明還提供了上述單克隆抗體在制備用于標記腫瘤的試劑盒中的應用。其中所述腫瘤具體是指腫瘤細胞的增殖與IDO1的表達密切相關的腫瘤，包括但不限于黑色素瘤、肺癌、結腸癌、乳腺癌。

與現有技術相比，本發明提供了一種雜交瘤細胞株(保藏編號為CGMCC No.12286)，以及由此雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體Umab126。本發明還提供了單克隆抗體Umab126在制備用于檢測IDO1蛋白的免疫檢測工具中的應用，含單克隆抗體Umab126的免疫組化試劑盒，以及單克隆抗體Umab126在制備用于標記腫瘤的試劑盒中的應用。本發明所述單克隆抗體可與IDO1蛋白特異性結合，而與細胞內其他蛋白無交叉反應，顯著提高了IDO1蛋白免疫檢測的特異性、準確性和可靠性，真實反映腫瘤浸潤淋巴細胞內IDO1蛋白表達水平，可應用于黑色素瘤、肺癌、結腸癌、乳腺癌等腫瘤免疫微環境的檢測。

保藏信息

用于保藏的雜交瘤細胞株Umab126的分類命名為：IDO1鼠單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

保藏單位全稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；

保藏單位簡稱：CGMCC；

保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；

保藏日期：2016年4月27日；

保藏編號：CGMCC No.12286。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示實施例1克隆位點設計如圖，其中底紋部分為ORF區；

圖2示實施例2重組IDO1蛋白Western blot檢測結果圖，以anti-DDK檢測重組IDO1蛋白在HEK293T細胞中的表達，其中左側泳道為轉染空載體的HEK293T細胞裂解液為抗原的檢測結果、右側泳道為轉染pCMV6-rIDO1質粒的HEK293T細胞裂解液抗原的檢測結果；

圖3示實施例2重組IDO1蛋白SDS-PAGE結果圖，用抗DDK親和層析柱純化重組IDO1蛋白，純化后的蛋白通過SDS-PAGE膠電脈、考馬斯亮藍染色；

圖4示實施例3以單克隆抗體Umab126識別完整的IDO1(Full length IDO1,IDO1-FL)蛋白的Western blot檢測結果圖。泳道1為轉染pCMV6-Entry的細胞裂解液；泳道2為轉染pCMV6-IDO1-FL的細胞裂解液；

圖5示實施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人乳淋巴結組織免疫組化結果圖(一抗為IDO1單克隆抗體Umab126)；

圖6示實施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人扁桃體組織免疫組化結果圖(一抗為IDO1單克隆抗體Umab126)；

圖-7示實施例5 OriGene蛋白芯片鑒定結果圖(一抗為IDO1單抗Umab126，1:100；二抗為DyLight649-conjugated AffiniPure Fragment Goat-anti-Mouse IgG，1:400)。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例1、IDO1重組表達質粒的構建

以從美國傲銳東源生物科技有限公司獲得的質粒RC206592(含IDO1ORF 1212bp)為模板，設計兩條引物并分別引入酶切位點SgfI和MluI，克隆入表達載體pCMV6-Entry，建立IDO1重組表達質粒。克隆位點設計如圖1所示。

實施例2、IDO1重組蛋白的表達與純化

1、轉染HEK293T細胞：HEK293T細胞以1:3傳至培養皿中繼續培養；取7.5mLDMEM(無血清及抗生素)至50mL管中，加入300μLPEI MegaTran1.0混勻；加入75μg IDO1重組表達質粒DNA至混勻液中，混勻并靜置30分鐘；分別取515μL至各培養皿中于37℃5％CO₂培養箱中培養。轉染24小時后，每皿細胞添加25μL2M丁酸鈉至終濃度5mM。

2、裂解細胞：轉染48小時后，進行細胞裂解。吸去培養基，加入1mLPBS進行漂洗，吸去PBS。加入1mL裂解緩沖液，使用前加入蛋白酶抑制劑PI和PMSF。置于冰盒中在搖床上振蕩，收集所有培養皿中得裂解液，4℃離心，收集上清。取少量上清采用WB鑒定重組IDO1的表達，結果圖2。

3、DDK親和層析柱純化：以0.45μM，33mm PVDF膜濾器過濾離心后的裂解液上清并轉入15mL管，加入混合好的Beads 1mL，封口后放入360度混勻器中，于4℃結合2小時；取出15mL管，將裂解液倒入BIO-RAD層析柱中，并接住穿透液，滴盡后穿透液取樣WB檢測；以裂解緩沖液沖洗柱料1-2次，滴盡后再用TBST沖洗Beads 3次，滴盡后用0.1M Glycine pH3.5洗脫，第一次200μL，滴盡不收集，第二、三次各500μL，第三次250μL，收集至一個1.5mL離心管中，并迅速加入NaH₂PO₄(pH＝11.0)中和至pH7.0左右，每管加入甘油至終濃度為10％，Tween-80至終濃度為0.1％。純化后的重組IDO1蛋白用SDS-PAGE鑒定，見圖3。

由圖2結果可見，轉染pCMV6-rIDO1質粒的HEK293T細胞裂解液中WB檢測后在45kD處有明顯的特異條帶，與多肽的理論分子量45kD基本相符。表明細胞中重組IDO1蛋白特異表達。

由圖3結果可見，純化的蛋白在PAGE膠45kD處有明顯的特異條帶，與多肽的理論分子量45kD基本相符。表明已獲得了純度較好的IDO1重組蛋白。

實施例3、IDO1單克隆抗體的制備與篩選

根據標準方法用重組產生的純化的IDO1蛋白片段用于對Balb/c小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)進行免疫。具體方法如下：

1、動物免疫：經過純化的IDO1抗原以完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周齡Balb/c小鼠，免疫劑量為50μg/只，間隔兩周后進行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為50μg/只。免疫兩次后取尾血以ELISA法梯度稀釋測定血清效價；根據結果確定是否加強免疫，選取抗體效價最高的小鼠進行細胞融合。

2、細胞融合：骨髓瘤細胞采用Balb/c來源的sp2/0，融合時處于對數生長期；取已免疫小鼠脾臟，制成淋巴細胞單細胞懸液；小鼠脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(PH 8.0)1mL，加入不完全培養基及其余終止液，離心棄上清后加入HAT培養基懸浮混勻，MC定容到50mL，分裝到3.5cm培養皿中，放于濕盒中，置于37℃、5％CO₂恒溫培養箱中進行培養。

3、篩選和克隆：融合7-10天內挑選細胞克隆，使用IDO1純化重組蛋白進行ELISA測試。標記細胞株號。對陽性孔細胞進行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測定ELISA值，挑取OD280陽性值較高的單克隆孔進行有限稀釋，直至ELISA測定96孔板全板結果為陽性。挑取陽性值高的單克隆定株。其對應融合板細胞株為Umab126。

4、腹水單抗的制備與純化：10-12周齡的雄性Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1mL注射器腹腔注射經PBS洗滌重懸的單克隆細胞懸液，細胞用量為5×10⁶/只，每株抗體打2只小鼠。待小鼠腹水積聚后收集腹水，離心取上清，親和層析法進行腹水純化，根據抗體亞型選擇相應柱料，細胞株Umab126產生的單抗為IgG1，采用protein G進行純化。純化后的單抗濃度測定、WB檢測、分裝、凍存在-20℃。其中WB檢測結果見圖4。

由圖4結果可見，泳道2在分子量約45kD處有特異的條帶，表明單克隆抗體Umab126能特異地Western blot檢測完整的全長IDO1蛋白。

實施例4、單克隆抗體Umab126為一抗的免疫組化檢測

(1)實驗方法：

1、取福爾馬林固定的人淋巴結組織與人扁桃體組織塊進行石蠟包埋，使用Finesse組織切片機進行切片，組織厚度為6μm。

2、脫蠟與水化：分析純二甲苯3×10min，無水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去離子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修復液(0.01M，pH6.0枸櫞酸鈉緩沖液)高壓鍋高壓熱修復3min，待高壓鍋溫度降至約90℃時，打開高壓鍋，取出標本，然后自然冷卻至室溫。去離子水浸泡3min×3次。

4、使用3％過氧化氫滅活組織內源性過氧化物酶，室溫靜置10min。去離子水浸泡5min×3次。

5、加上封閉液(PBS+5％脫脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封閉液，勿沖洗，加入IDO1單抗(Umab126)，稀釋比：1:150，使用封閉液進行稀釋。置于濕盒中，37℃孵育60min。PBST(0.1％Tween-20)洗滌2次，每次洗滌5min。PBST(0.02％Tween-20)洗滌1次，每次洗滌5min。

7、滴加Polink-試劑盒2(Catlog No.D37-15)試劑1，37℃孵育10-20分鐘。使用PBS洗滌3次，每次5min。滴加Polink-2試劑盒(Catlog No.D37-15)試劑2，37℃孵育10-20分鐘，使用PBS洗滌3次，每次5min。

8、應用DAB溶液(中杉金橋ZLI-9019)顯色，顯色3～10min。蒸餾水洗滌。

9、蘇木精復染細胞核2min，蒸餾水漂洗，1％鹽酸分化。蒸餾水漂洗3次，室溫靜置1min。

10、脫水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5min x 3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性樹膠封片。

11、鏡檢，見圖5-6。

(2)實驗結果：

由圖5-6結果可見，在人淋巴結組織與人扁桃體組織中可見到特異性胞漿染色。結果與IDO1在細胞內的定位及組織表達特異性一致，表明單克隆抗體Umab126可用于免疫組織化學檢測IDO1蛋白的水平。

實施例5、單克隆抗體Umab126的特異性檢測

OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000個HEK293T細胞蛋白過表達裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一種蛋白裂解液的定位可以通過Excel文件進行準確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣，每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監控每次免疫反應數據的重復性，以及定位陽性信號的方向。以下為使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片進行Umab126抗體鑒定實驗的實驗方法：

1、將一張蛋白芯片放在50mL離心管中，使用40mL去離子水浸潤芯片，置于搖床上，室溫混合30分鐘。棄掉去離子水，使用10mLPBST平衡芯片。室溫處理10分鐘。

2、向50mL離心管中加入40mL5％脫脂牛奶(用PBST進行稀釋)置于搖床上，室溫封閉30分鐘。

3、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋一抗Umab126，稀釋比列為1:100。

4、將潔凈的封口膜粘貼到實驗臺上，滴加250-300μL一抗在封口膜上。

5、將蛋白芯片從封閉液中抽出，將蛋白芯片NC膜的一面朝下，從芯片的一邊接觸抗體，慢慢滑下，依靠液體表面張力，抗體將慢慢浸潤芯片NC膜，直至整張NC膜浸潤在一抗溶液中。整個操作過程避免產生氣泡。將芯片移到4℃環境下，靜置，一抗孵育過夜。在芯片上加蓋培養皿蓋，其上黏附一張濕紙巾，以防止長時間孵育導致抗體蒸發。

6、第二天將芯片移至50mL離心管中，使用PBST漂洗芯片兩次，去除多余的抗體。使用40mL PBST(0.1％Tween-20)洗滌芯片，置于搖床上混合均勻，洗滌三次，每次洗滌5min。

7、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋二抗DyLight649-conjugated AffiniPure Fragment Goat-anti-Mouse IgG，稀釋比例為1:400。

8、按照上述步驟4，步驟5進行二抗孵育操作。室溫孵育1小時。在芯片上方用鋁箔紙遮蓋，以防止發生信號漂白。

9、按照上述步驟6，使用PBST洗滌芯片。

10、使用去離子水沖洗芯片，以去除殘余的鹽分和變性劑。

11、室溫干燥芯片，確保芯片完全干燥。

12、使用芯片掃描儀讀取熒光信號。

13、根據BSA-Cy3以及BSA-Cy5確定芯片方向以及陽性信號的位點。

14、根據陽性信號位點找出對應蛋白裂解液ID，根據裂解液數據庫信息，查找到對應蛋白名稱，NCBI錄入號(accession number)，蛋白ID，蛋白大小等信息。

結果如圖7所示，單抗Umab126在OriGene蛋白芯片上能特異地識別IDO1蛋白，表明單抗Umab126的特異性較好。

<110>無錫傲銳東源生物科技有限公司

<120>抗IDO1蛋白單克隆抗體及其用途

<210> 1

<211>1212

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

ORIGIN

1 ATGGCACACG CTATGGAAAA CTCCTGGACA ATCAGTAAAG AGTACCATAT TGATGAAGAA

61 GTGGGCTTTG CTCTGCCAAA TCCACAGGAA AATCTACCTG ATTTTTATAA TGACTGGATG

121 TTCATTGCTA AACATCTGCC TGATCTCATA GAGTCTGGCC AGCTTCGAGA AAGAGTTGAG

181 AAGTTAAACA TGCTCAGCAT TGATCATCTC ACAGACCACA AGTCACAGCG CCTTGCACGT

241 CTAGTTCTGG GATGCATCAC CATGGCATAT GTGTGGGGCA AAGGTCATGG AGATGTCCGT

301 AAGGTCTTGC CAAGAAATAT TGCTGTTCCT TACTGCCAAC TCTCCAAGAA ACTGGAACTG

361 CCTCCTATTT TGGTTTATGC AGACTGTGTC TTGGCAAACT GGAAGAAAAA GGATCCTAAT

421 AAGCCCCTGA CTTATGAGAA CATGGACGTT TTGTTCTCAT TTCGTGATGG AGACTGCAGT

481 AAAGGATTCT TCCTGGTCTC TCTATTGGTG GAAATAGCAG CTGCTTCTGC AATCAAAGTA

541 ATTCCTACTG TATTCAAGGC AATGCAAATG CAAGAACGGG ACACTTTGCT AAAGGCGCTG

601 TTGGAAATAG CTTCTTGCTT GGAGAAAGCC CTTCAAGTGT TTCACCAAAT CCACGATCAT

661 GTGAACCCAA AAGCATTTTT CAGTGTTCTT CGCATATATT TGTCTGGCTG GAAAGGCAAC

721 CCCCAGCTAT CAGACGGTCT GGTGTATGAA GGGTTCTGGG AAGACCCAAA GGAGTTTGCA

781 GGGGGCAGTG CAGGCCAAAG CAGCGTCTTT CAGTGCTTTG ACGTCCTGCT GGGCATCCAG

841 CAGACTGCTG GTGGAGGACA TGCTGCTCAG TTCCTCCAGG ACATGAGAAG ATATATGCCA

901 CCAGCTCACA GGAACTTCCT GTGCTCATTA GAGTCAAATC CCTCAGTCCG TGAGTTTGTC

961 CTTTCAAAAG GTGATGCTGG CCTGCGGGAA GCTTATGACG CCTGTGTGAA AGCTCTGGTC

1021 TCCCTGAGGA GCTACCATCT GCAAATCGTG ACTAAGTACA TCCTGATTCC TGCAAGCCAG

1081 CAGCCAAAGG AGAATAAGAC CTCTGAAGAC CCTTCAAAAC TGGAAGCCAA AGGAACTGGA

1141 GGCACTGATT TAATGAATTT CCTGAAGACT GTAAGAAGTA CAACTGAGAA ATCCCTTTTG

1201 AAGGAAGGTT AA

//

<210> 2

<211>403

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 2

ORIGIN

1 MAHAMENSWT ISKEYHIDEE VGFALPNPQE NLPDFYNDWM FIAKHLPDLI ESGQLRERVE

61 KLNMLSIDHL TDHKSQRLAR LVLGCITMAY VWGKGHGDVR KVLPRNIAVP YCQLSKKLEL

121 PPILVYADCV LANWKKKDPN KPLTYENMDV LFSFRDGDCS KGFFLVSLLV EIAAASAIKV

181 IPTVFKAMQM QERDTLLKAL LEIASCLEKA LQVFHQIHDH VNPKAFFSVL RIYLSGWKGN

241 PQLSDGLVYE GFWEDPKEFA GGSAGQSSVF QCFDVLLGIQ QTAGGGHAAQ FLQDMRRYMP

301 PAHRNFLCSL ESNPSVREFV LSKGDAGLRE AYDACVKALV SLRSYHLQIV TKYILIPASQ

361 QPKENKTSED PSKLEAKGTG GTDLMNFLKT VRSTTEKSLL KEG

//