利用PCR?RFLP檢測綿羊FTH?1基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及以綿羊的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為分子遺傳標(biāo)記，特別涉及綿羊FTH-1基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：在動物育種中，人們期望通過對生長、繁殖等性狀密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記的選擇，達(dá)到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進(jìn)展。分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種(MolecularMark-AssistSelection,MAS)，該技術(shù)是借助DNA分子標(biāo)記對遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對畜禽的綜合性狀進(jìn)行品種改良，它是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的方法，進(jìn)行新品種選育?；蚨鄳B(tài)性是指不同物種或者同一物種內(nèi)的不同個體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括堿基的替換、插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)是由美國麻省理工學(xué)院的人類基因組研究中心的學(xué)者Lander(1996)提出的一類遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。SNP作為新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數(shù)量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90％以上。SNP與罕見的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于1％的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于1％時才被稱為單核苷酸多態(tài)性。它的變異形式有：顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型的堿基變異的SNPs約占2/3。根據(jù)基因組中單核苷酸多態(tài)性產(chǎn)生的位置，可分為以下3類：基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Coding-regionSNPs,cSNPs)、基因周邊單核苷酸多態(tài)性(PerigenicSNPs,pSNPs)以及基因間單核苷酸多態(tài)性(IntergenicSNPs,iSNPs)。研究表明，位于編碼區(qū)內(nèi)的cSNP比較少。基因編碼區(qū)內(nèi)的cSNP又可分為2種：一種是編碼區(qū)內(nèi)的同義cSNP(SynonymouscSNP)，即SNP所致編碼序列的改變并不會影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變；另一種是編碼區(qū)內(nèi)的非同義cSNP(Non-SynonymouscSNP)，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。由于SNPs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個、3個或4個等位基因構(gòu)成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)SNPs：即DNA序列測定方法、聚合酶鏈反應(yīng)—單鏈構(gòu)象多態(tài)(PolymeraseChainReaction-SingleStrandConformationPolymorphism，PCR-SSCP)與DNA測序結(jié)合法、等位特異性PCR(AlleleSpecificPCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測技術(shù)中，DNA序列測定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實際的理想SNP檢測方法；當(dāng)然，利用PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當(dāng)降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測SNP位點，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。限制性片段長度多態(tài)性-聚合酶鏈反應(yīng)(RestrictionFragmentLengthPolymorphism-PolymeraseChainReaction，RFLP-PCR)方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點后設(shè)計上下游引物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準(zhǔn)確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。FTH1(FerritinHeavyPolypeptide1)即鐵蛋白重鏈多肽1，它是動植物體內(nèi)廣泛存在的一種可溶性組織蛋白，負(fù)責(zé)體內(nèi)鐵的存儲和維持細(xì)胞內(nèi)鐵的平衡，也參與細(xì)胞增殖和免疫反應(yīng)。FTH1是鐵蛋白活性的主要調(diào)節(jié)子，細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)重鏈鐵蛋白會改變細(xì)胞的表型。FTH1還具有抗細(xì)胞凋亡的作用。先前的研究通過轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒干擾FTH-1的表達(dá)，實時定量檢測到16SrRNA的相對表達(dá)量降低，細(xì)胞中凋亡抑制因子表達(dá)量隨之降低，故細(xì)胞的凋亡速度就會相應(yīng)的增快，布魯氏菌造成的抑制巨噬細(xì)胞凋亡的程度會相對減弱。此外，F(xiàn)TH-1會對動物的生長和繁殖產(chǎn)生影響。研究表明，F(xiàn)TH-1在高產(chǎn)蛋性能雞卵巢中的表達(dá)量明顯高于低產(chǎn)蛋性能雞；FTH-1在人類和牛的囊胚期上調(diào)表達(dá)；對產(chǎn)卵前和產(chǎn)卵的鵝下丘腦、垂體前葉和卵巢鐵蛋白重鏈mRNA的表達(dá)水平做定量分析，發(fā)現(xiàn)mRNA在排卵后卵泡和閉鎖卵泡的表達(dá)量比發(fā)育中的卵泡和卵巢基質(zhì)表達(dá)量更高；通過構(gòu)建抑制消減雜交cDNA文庫得出FTH-1在發(fā)情期綿羊卵巢組織中的表達(dá)量顯著高于乏情期；通過對多胎的濟(jì)寧青山羊和單胎的遼寧絨山羊下丘腦、垂體和卵巢的mRNA構(gòu)建抑制消減雜交cDNA文庫，篩選出FTH-1基因與濟(jì)寧青山羊的多胎性有關(guān)。綜上，F(xiàn)TH-1在動物繁殖中起著十分重要的作用。關(guān)于動物FTH-1基因遺傳變異的研究國內(nèi)外多見于人、鼠、豬等動物，而未有綿羊FTH-1基因遺傳變異或SNP研究的報道。由于目前中國綿羊FTH-1基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，使該基因位點的功能研究及該基因遺傳變異與繁殖性狀關(guān)聯(lián)的研究成為空白。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供在于一種利用PCR-RFLP檢測綿羊FTH-1基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用，可針對其基因位點上的突變進(jìn)行檢測，提前淘汰劣勢個體，加快高繁種羊群體的建立。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：綿羊FTH-1基因第1046位為A或G的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法為：以包含F(xiàn)TH-1基因的待測綿羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增綿羊FTH-1基因；用限制性內(nèi)切酶XspI消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定綿羊FTH-1基因第1046位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為：上游引物：5’-TCCATAGTAGAGACGGTTCC-3’20nt；下游引物：5’-GCACAAAAGACTAAAGCCC-3’19nt。所述的PCR擴增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，34個循環(huán)；72℃延伸10min。所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為1.5-3.0％的瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果FTH-1基因第1046位堿基多態(tài)性為：AA型表現(xiàn)：152bp和326bp；AG型表現(xiàn)：478bp、326bp和152bp；GG型表現(xiàn)：478bp。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：本發(fā)明利用RFLP-PCR方法對綿羊FTH-1基因第1046位點上的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測，該位點位于FTH-1基因的第三內(nèi)含子，該核苷酸多態(tài)性能夠作為一個分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。本發(fā)明通過設(shè)計特定的PCR引物擴增片段，能夠用RFLP-PCR方法簡單、快速、成本低、精確的檢測上述FTH-1基因的單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對FTH-1基因的SNP進(jìn)行了基因分型和基因頻率分析，以及與綿羊繁殖性狀之間進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果顯示FTH-1基因的核苷酸多態(tài)位點能夠成為分子遺傳輔助育種的標(biāo)記。本發(fā)明提供的檢測方法為FTH-1基因的SNP與生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國綿羊生長性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的綿羊種群。附圖說明圖1為綿羊血樣基因組DNA電泳檢測圖；圖2為綿羊FTH-1基因PCR擴增的478bp片段的電泳圖；M為Marker；圖3為綿羊FTH-1基因478bp片段PCR產(chǎn)物的XspI酶切電泳檢測FTH-1基因多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；泳道2，9：AG基因型個體(478bp，326bp，152bp)；泳道3，5，7，8：GG基因型個體(478bp)；泳道4，6：AA基因型個體(326bp，152bp)；泳道1：MarkerDL2000(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；圖4為綿羊FTH-1基因1046位SNP的不同基因型測序峰圖，其中A對應(yīng)AA基因型，B對應(yīng)AG基因型，C對應(yīng)GG基因型。具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，所述實施例是對本發(fā)明的解釋，而不是限定。本發(fā)明以FTH1基因保守序列設(shè)計引物擴增FTH1基因第3內(nèi)含子478bp片段，以綿羊基因組為模板，進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后尋找該擴增片段的單核苷酸多態(tài)；針對發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)性分析，并提供其檢測方法，使得FTH1基因的核苷酸多態(tài)性成為一種能夠快速、方便檢測的分子遺傳標(biāo)記，為加快建立具有高繁綿羊種群提供依據(jù)。a、綿羊FTH-1基因多態(tài)性的檢測1、綿羊血樣的采集及處理取綿羊血樣10mL，加入0.5mol/L的EDTA500μL抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80℃保存?zhèn)溆?。本發(fā)明采用綿羊品種，具體如表1所示。表1綿羊樣品來源表2、血樣基因組DNA的提取(1)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500μL至1.5mLEppendorf管，加入等體積PBS緩沖液，充分混勻，12000r/min離心10min(4℃)，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色。(2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500μL，搖動，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提緩沖液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超純水500mL，滅菌、調(diào)pH至8.0，4℃保存?zhèn)溆谩?3)加蛋白酶K3μL(20mg/mL)并混勻，55℃過夜至澄清，尚未澄清者，可補加1μL蛋白酶K混勻繼續(xù)消化至澄清。(4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500μL，溫和搖動離心管20min，使其充分混勻；4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中，重復(fù)一次。(5)加氯仿500μL，充分混勻20min，4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中。(6)加0.1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動離心管直至白色的絮狀沉淀析出，-20℃保存30～60min。(7)4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。(8)4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的超純水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-20℃保存。3、DNA池的構(gòu)建(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測選部分DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇DNA樣品條帶均一、無拖尾、無降解的樣品進(jìn)行DNA池的構(gòu)建。(2)OD值測定用紫外光光度計測定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。DNA濃度(ng/μL)＝50×OD260值×稀釋倍數(shù)(3)品種DNA池的構(gòu)建DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μL，然后從綿羊20個濃度為50ng/μLDNA樣品中取10μL混合構(gòu)建成品種DNA池；綿羊血樣基因組DNA的檢測結(jié)果見圖1，從圖中可以看出綿羊基因組DNA的質(zhì)量非常高。4、PCR擴增PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和1次反應(yīng)所需的PCR反應(yīng)的個數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個1.5mL或者2.0mL離心管中，充分混勻后瞬時離心，再分裝到每個0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時離心后進(jìn)行PCR擴增；PCR反應(yīng)體系見表2。表2PCR反應(yīng)體系體系成分體積(μL)2*ReactionMix12.5上游引物(10pmol/L)1.0下游引物(10pmol/L)1.0TaqDNA聚合酶(0.5U/μL)0.3DNA模板(50ng/μL)1.0滅菌超純水(H2O)9.2總體積25.0引物對P：上游引物：5’-TCCATAGTAGAGACGGTTCC-3’20nt；下游引物：5’-GCACAAAAGACTAAAGCCC-3’19nt。表3PCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，34個循環(huán)；72℃延伸10min5、PCR產(chǎn)物純化和測序PCR擴增完成之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖2所示，可以清楚看到478bp的條帶；然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化：在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟如下：(1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。(3)向膠塊中加入等體積溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。(4)將上一步所得溶液加入一個吸附柱中，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min離心1min，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min離心1min，倒掉廢液，將離心吸附柱放入收集管中，12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50℃溫箱數(shù)分鐘，徹底晾干。(7)將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘。12000r/min離心1min收集DNA溶液。(8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步驟7。把以綿羊DNA池為模板的PCR純化產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。綿羊FTH1基因目的片段478bp的測序結(jié)果如圖4所示。對測序峰圖進(jìn)行分析，其中在同一位點有兩個不同峰的是發(fā)生了單核苷酸突變；位于綿羊FTH-1基因的第1046位出現(xiàn)了A、G兩種檢測結(jié)果，即為篩查到的綿羊FTH-1基因的SNP多態(tài)性，該位點是為A或G的堿基多態(tài)性。b、綿羊FTH-1基因A>G突變多態(tài)性的RFLP-PCR檢測由于篩查到的堿基多態(tài)性為自然酶切位點，能被常用的內(nèi)切酶進(jìn)行PCR-RFLP來鑒定。當(dāng)綿羊的FTH1基因第1046位未發(fā)生A>G突變時，即為突變前A，利用引物對P擴增的FTH-1基因序列C^TAG，為XspI的限制性內(nèi)切酶識別位點；可直接通過XspI對目的片段的酶切進(jìn)行基因分型。1、RFLP-PCR反應(yīng)條件PCR產(chǎn)物擴增體系和反應(yīng)條件分別如表2和表3所述，PCR擴增產(chǎn)物的1.5％瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2所示，可以看到設(shè)計的引物對P能夠擴增478bp的片段。2、PCR擴增產(chǎn)物的XspI酶切(1)10μLXspI酶切反應(yīng)體系：5μLPCR產(chǎn)物，10×buffer(緩沖液)2.0μL，XspI(10U/μL)為0.3μL，2.7μL滅菌純水(H2O)；(2)酶切消化條件：37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化12～16h。(3)XspI消化PCR產(chǎn)物后瓊脂糖凝膠電泳分析用3.0％的瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳1小時，核酸染料染色檢測酶切結(jié)果，用UVP凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc-ItTSImagingSystem)照相分析，并判型、記錄其基因型；由于PCR-RFLP擴增的478bp片段中不包含其它的XspI酶切識別位點，當(dāng)FTH-1基因第1046位未發(fā)生A>G突變時，PCR擴增的FTH-1基因產(chǎn)物被限制性內(nèi)切酶XspI識別后，在C^TAG對擴增片段酶切，將擴增片段切為2段；而當(dāng)FTH-1基因第1046位發(fā)生突變，不能形成新的限制性內(nèi)切酶XspI酶切識別位點，擴增片段不能被酶切；由于綿羊為2倍體動物，所以當(dāng)發(fā)生A>G的突變時，可形成3種不同的基因型，分別為AA、AG、GG，其PCR-RFLP檢測的凝膠結(jié)果如圖3所示：其中，AA基因型為野生型，它的兩條DNA鏈的SNP位點均能被XspI酶切，表現(xiàn)為326bp和152bp條帶；發(fā)生突變后的GG的兩條鏈的SNP位點均不能被酶切，表現(xiàn)為478bp條帶；雜合子AG的兩條鏈中的一條的SNP位點能夠被識別而另一條不能被識別，表現(xiàn)為478bp，326bp和152bp條帶；根據(jù)條帶的個數(shù)和條帶的大小，能夠很清楚的判定是否發(fā)生了點突變，將三種基因型區(qū)分開，從而檢測其SNP多態(tài)性。(4)不同基因型個體PCR產(chǎn)物的測序驗證利用ABI3730測序儀對不同基因型個體PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行正反雙向測序；同時，進(jìn)行SNP位置分析，結(jié)果表明包含478bp、326bp和252bp條帶的雜合子AG基因型個體其第1046位的測序圖的確表示為A或G，如圖4B所示，自左向右第8個峰為兩個峰；而AA基因型、GG基因型分別為A、G，分別如圖4A，圖4C所示。c、不同綿羊群體中FTH-1基因第1046位的SNP作為分子標(biāo)記的應(yīng)用1、群體單核苷酸多態(tài)性的檢測利用上述的SNP多態(tài)性檢測方法對424份小尾寒羊和432份湖羊DNA樣品進(jìn)行SNP多態(tài)性的鑒定；統(tǒng)計其SNP位點的頻率分布情況。2、SNP位點的頻率統(tǒng)計分析基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數(shù)占總個體數(shù)的比率。PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位點的AA基因型頻率；NAA表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)；N為檢測群體的總數(shù)量?；蝾l率是指一個群體中某一基因數(shù)對其等位基因總數(shù)的相對比率。計算的公式可以寫成：PA＝(2NAA+NAa1+NAa2+……+NAan)/2N。式中，PA表示等位基因A頻率，NAA表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)量，NAai表示群體中具有Aai基因型個體數(shù)量，a1-an為等位基因A的n個不同的復(fù)等位基因；統(tǒng)計結(jié)果見表4。表4綿羊FTH-1基因第1046位SNP基因頻率分布表3、基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析基因型數(shù)據(jù)：XspI識別的基因型(AA、AG和GG)生長性狀數(shù)據(jù)：湖羊和小尾寒羊第一胎產(chǎn)羔數(shù)利用SAS(9.2)軟件分析基因位點與繁殖性狀(產(chǎn)羔數(shù))的相關(guān)性。先對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計分析，確定是否存在離群值，根據(jù)數(shù)據(jù)特征，利用t分析、方差分析或是多元線性模型分析基因型效應(yīng)。在數(shù)據(jù)處理中，根據(jù)影響產(chǎn)羔數(shù)因素不同，考慮到環(huán)境效應(yīng)、年齡、基因型效應(yīng)及相關(guān)的互作效應(yīng)，采用固定模型進(jìn)行分析，同時，根據(jù)實際情況進(jìn)行取舍。完整的模型如下：Yijk＝μ+Gj+Eijk其中：Yijk為個體表型記錄；μ為群體均值；Gj為各位點的基因型效應(yīng)；Eijk為隨機誤差。結(jié)果表明(見表5和表6)：對于XspI可識別的第1046位的SNP位點，GG基因型為優(yōu)勢基因型；性狀關(guān)聯(lián)分析表明，在湖羊群體中，GG基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)顯著的高于AA基因型，而在小尾寒羊群體中各基因型個體差異不顯著。結(jié)果說明GG基因型可以成為一個提高湖羊產(chǎn)羔性狀育種速度的分子遺傳標(biāo)記。根據(jù)這個研究結(jié)果，可以通過選擇，建立基因型為GG純合型湖羊群體，提高其產(chǎn)羔率。表5FTH1基因單核苷酸多態(tài)性與湖羊繁殖性狀之間的關(guān)聯(lián)分析表6FTH1基因單核苷酸多態(tài)性與小尾寒羊繁殖性狀之間的方差分析注：具有相同字母肩標(biāo)的平均值間差異不顯著(P>0.05)，具有不同字母肩標(biāo)的平均值間差異顯著(P<0.05)。核苷酸序列表<110>蘭州大學(xué)<120>利用PCR-RFLP檢測綿羊FTH-1基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1tccatagtagagacggttcc20<210>2<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>2gcacaaaagactaaagccc19當(dāng)前第1頁1 2 3