本發明屬于生物科學領域，涉及microRNA的檢測。
背景技術：
：MicroRNA是長度為22～25個核苷酸的單鏈小RNA，其不編碼蛋白，但可以通過抑制同源mRNA的表達或誘導其降解而對mRNA進行調控，從而影響相關蛋白的生成。MicroRNA種類很多，表達位置和用途各不相同。其中，microRNA-34a在腦、心肌、肺、肝臟、前列腺、神經組織中有廣泛表達，能夠與多種基因的mRNA非特異性結合，常被用于研究在腫瘤發生中以及各系統疾病的病理生理過程中所起的作用。例如，肝細胞癌(HCC)是一種惡性程度極高的癌癥，在全球的發病率和病死率均非常高。對于該病的研究持續多年，目前的治療方法也多種多樣，但總體的預后依然很差，這是由于肝細胞癌的早期診斷方法以及結果敏感性有局限。基于前人的研究成果，發明人發現了HCC組織中microRNA-34a的表達水平明顯低于正常組織和癌旁組織，在轉移性癌組織中microRNA-34a的表達水平明顯低于非轉移性癌組織；它在HCC組織中的表達與腫瘤惡性程度、腫瘤個數、腫瘤體積、淋巴結轉移、浸潤深度、TNM分期密切相關，與其它因素，如患者年齡、性別、肝功能、腫瘤部位等無相關性。同時，還發現microRNA-34a與其靶標Notch1在HCC及癌旁組織中均負相關(MicroRNA-34a、Notch1在肝細胞癌組織中的表達以及臨床意義，于泳等，世界華人消化雜志，2014年第22卷第14期)。在上述的肝細胞癌中，microRNA-34a在病灶區和癌旁區的表達量會有所不同；而在另一些情況下，外周血中的microRNA-34a的表達量與一些疾病的發生有相關性。例如，已經發現，在風濕性關節炎、肺癌、阿爾茨海默癥中，外周血的microRNA-34a的表達量發生變化。現有技術對于microRNA-34a的研究已經取得了很多有價值的結論，針對它的研究依然繼續。本領域中依然有能夠精確檢測microRNA-34a的表達量的需要。技術實現要素：本發明針對microRNA-34a的PCR檢測，提供一種能夠有效擴增microRNA-34a的體系和方法。在第一個方面，本發明的microRNA-34a的檢測體系包括逆轉錄反應體系和PCR擴增反應體系，其中，所述逆轉錄反應體系包括逆轉錄引物，所述PCR擴增反應體系包括PCR正向引物和PCR反向引物；其中，逆轉錄引物的序列為：GAGTTGACTGTCCTGGACTGGTGGTACGTCAACTCACAACCAGC(SEQIDNO:1)；PCR正向引物的序列為：CTGGTCCTGGCAGTGTCTTG(SEQIDNO:2)；PCR反向引物的序列為：ACTGTCCTGGACTGGTGG(SEQIDNO:3)。優選地，所述逆轉錄反應體系還包括逆轉錄酶、dNTP、逆轉錄緩沖液、MgCl2、RNA酶抑制劑、無RNA酶水。優選地，所述PCR反應體系還包括DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTP。進一步地，在第二個方面，本發明提供一種microRNA-34a的檢測試劑盒，包括逆轉錄反應中使用的逆轉錄引物和PCR擴增反應中使用的PCR正向引物和PCR反向引物；逆轉錄引物的序列如SEQIDNO:1所示，PCR正向引物的序列如SEQIDNO:2所示，PCR反向引物的序列如SEQIDNO:3所示。優選地，所述檢測試劑盒還包括逆轉錄反應和PCR擴增反應中所使用的其它試劑，如逆轉錄酶、逆轉錄緩沖液、MgCl2、RNA酶抑制劑、無RNA酶水、DNA聚合酶、PCR緩沖液和dNTP。在第三個方面，本發明提供檢測microRNA-34a的方法，包括逆轉錄和PCR擴增兩個步驟，其中，所述逆轉錄步驟使用的逆轉錄引物的序列如SEQIDNO:1所示，PCR擴增步驟使用的PCR正向引物的序列如SEQIDNO:2所示，所使用的PCR反向引物的序列如SEQIDNO:3所示。優選地，所述逆轉錄步驟的反應條件為25℃5min，42℃60min，60℃15min；所述PCR步驟的反應條件為95℃1min，40個循環的95℃15s、58℃40s、72℃30s，72℃1min。本發明提供的逆轉錄引物、PCR正向引物和PCR反向引物能夠有效結合和擴增microRNA-34a，檢測多種組織或血液中microRNA-34a的量。相比于常規指導設計的引物，其擴增效率更高、更靈敏，特別適合microRNA-34a表達量低的情況的檢測。附圖說明圖1：使用本發明的檢測體系對正常肝細胞和肝細胞癌細胞的檢測結果，其中1為正常肝細胞檢測結果，2為肝細胞癌細胞的檢測結果；圖2：本發明的檢測體系與常規檢測體系的擴增結果比較，其中1為本發明的結果，2為常規檢測體系的結果。具體實施方式下面將結合具體實施方式說明本發明，但本發明的內容不限于此。以下實施例中，如未明確說明，則所使用的方法均為本領域常規的方法，本領域技術人員根據現有技術完全可以知道如何實施所述方法并獲得相應結果，所使用的試劑和儀器均為本領域常規試劑和儀器，可以通過常規的商業途徑獲得。根據NCBI查詢的結果，人microRNA-34a的成熟體序列為uggcagugucuugcugguugu。實施例1：microRNA-34a的擴增1、miRNA的提取取正常肝細胞和肝細胞癌細胞(這兩種細胞獲取自本醫院的患者，患者知情同意做科學研究)的組織勻漿液，采用天根生物科技有限公司的miRNA提取試劑盒，按照說明書要求提取樣本中的miRNA：200μL樣本加入等體積的裂解液震蕩后靜置5min，然后加入5μL外源性參照cel-mir-39，按照說明書進行操作，最后用30μL的去核酸水溶解miRNA。測定miRNA的濃度和純度，以A260/A280在1.6～2.2之間，濃度為2～20ng/μL的miRNA為模板做逆轉錄實驗，備用。2、逆轉錄將逆轉錄體系的各種試劑在室溫下溶解，震蕩混勻后置于冰上，并按照表1配制反應液。表1：逆轉錄反應體系組分每管體積(μL)miRNA模板2MMLV逆轉錄酶(200單位/μL)(promega公司)0.4MMLV10倍逆轉錄酶緩沖液(promega公司)4dNTP混合物(10mmol)1.6RNA酶抑制劑(40單位/μL)0.4MicroRNA-34a逆轉錄引物(SEQIDNO:1)(1μmol)1cel-mir-39逆轉錄引物(1μmol)1無核酸水補充到40其中，cel-mir-39逆轉錄引物序列為：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGATACGACCTGTTTCCT。兩管的模板分別為正常肝細胞和肝細胞癌細胞的miRNA。將配好的反應體系充分混勻并將液體輕離心至反應管底部，置于PCR儀上進行反應。逆轉錄反應的條件為：25℃5min，42℃60min，60℃15min。反應結束后置于冰上。3、PCR擴增反應按照下表2配制PCR擴增體系：表2：PCR擴增體系其中，cel-mir-39的探針為JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP，正向引物為CAGAGTCACCGGGTGTAAAT，反向引物為CAGTGCGTGTCGTGGAGT；microRNA-34a的探針為MAR-TGCACTGGATACGACGCTGGT-MAR。將反應物混勻，在以下條件下進行反應：95℃1min，(95℃15s，58℃40s，72℃30s)40個循環，72℃1min。在AppliedBiosystems的實時熒光定量PCR儀上進行反應。對正常組織中獲得的PCR結果進行測序。測序結果與預期結果一致。由圖1的結果可見，本發明的檢測體系能夠擴增出microRNA-34a，在正常組織中的表達量高于肝細胞癌中的表達量，這與之前的研究結果一致，可見本發明的檢測體系能夠有效地反應出檢測樣本中的microRNA-34a的量。實施例2：不同擴增引物的檢測結果本領域技術人員已知，PCR反應擴增的關鍵因素包括引物與模板的匹配度、引物的擴增效率、Taq酶的效率、緩沖液的質量等，其中引物與模板的匹配度和引物的擴增效率是設計引物時需要仔細分析、比較的方面，也是引物設計中最不容易預測效果的因素。通過軟件，如Primer等設計的高得分引物序列并不一定比低得分的引物序列具有更好的效果。因此，引物設計包括很強的創造性工作。關于miRNA的反轉錄和擴增，本領域已經給出了很多引物設計思路，最常規的是使用莖環結構引物，但針對不同模板，莖環結構的序列以及與模板匹配的引物序列都會對擴增結果產生影響。取正常肝細胞，以本發明的檢測體系和對照檢測體系進行對比。其中，對照檢測體系的microRNA-34a的逆轉錄引物和PCR正向及反向引物均根據現有技術的指導進行設計，具體為：逆轉錄引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAACCAG；PCR正向引物：ACACTCCAGCTGGGTGGCAGTGTCTTGC；PCR反向引物：TGGTGTCGTGGAGTCG；探針為：MAR-TGCACTGGATACGACGTCTTG-MAR。以與實施例1相同的方法進行逆轉錄和PCR擴增反應。實驗結果如圖2所示。由結果可見，本發明的擴增體系能夠更有效地擴增microRNA-34a，比對照檢測體系更敏感，擴增效率更高，說明本發明的引物與模板的結合性更高，擴增能力更強，適用于microRNA-34a表達量減少，比如患有癌癥的情況，從而可以更靈敏地檢測出microRNA-34a的表達量是否發生變化。實施例3：外周血單個核細胞中micro-34a的檢測取類風濕關節炎患者的外周血單個核細胞樣品20份(以下稱實驗組)，健康對照人群的外周血單個核細胞樣品10份(以下稱對照組)，利用TRIzol法提取樣品中的總RNA，按照表3分別配制逆轉錄反應體系。表3：逆轉錄反應體系將配好的反應體系充分混勻并將液體輕離心至反應管底部，置于PCR儀上進行反應。逆轉錄反應的條件為：25℃5min，42℃60min，60℃15min。反應結束后置于冰上。以該反應產物為模板，按照下表4配制PCR擴增體系：表4：PCR擴增體系組分體積(μL)dNTP混合液(10mmol)2MgCl2(25mmol)210倍Taq緩沖液(無Mg離子，TAKARA)2Taq(5單位/μL，TAKARA)0.2正向引物(SEQIDNO:2)(10μmol)0.4反向引物(SEQIDNO:3)(10μmol)0.4去核酸酶水補充到20將反應物混勻，在以下條件下進行反應：95℃1min，(95℃15s，58℃40s，72℃30s)40個循環，72℃1min。將得到的產物進行定量分析(以對照組中表達量最低的一個樣品測量值為基準，對其它樣品的測量值進行統一化表示)。對照組的結果分別為：1.00、1.22、1.07、1.46、1.23、1.52、1.18、1.05、1.33、1.29；實驗組的結果分別為：5.32、1.87、6.09、3.26、3.85、2.74、1.96、4.26、2.48、6.65、4.37、3.80、4.48、1.44、2.51、2.24、5.08、4.68、3.97、3.53。由結果可以看出，對照的健康人群組中，microRNA-34a的表達量個體間差異不大，數值較低。而實驗組中，個體間的表達量差異很大，有2個樣品的檢測值與對照組相差不大。將這些結果與已確定的診斷結果相對照，microRNA-34a的表達量與類風濕性關節炎的病程相符性達到75％。進一步說明本發明的引物和檢測體系能夠有效擴增microRNA-34a，對組織樣品和外周血樣品均有效。上述實施例僅用于表明本發明的引物和方法能夠靈敏、高效地檢測microRNA-34a，并不代表可以通過本發明的檢測microRNA-34a的方法來判斷疾病的存在或進程。本領域技術人員已知，疾病是通過一些標準指標表征的；而microRNA-34a在組織或血液中的變化僅是疾病的一個現象，不能作為診斷標準。序列表<110>中國人民解放軍第四軍醫大學第一附屬醫院<120>MicroRNA-34a的檢測體系和方法<130>Y161264-OI<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>microRNA-34a逆轉錄引物<400>1gagttgactgtcctggactggtggtacgtcaactcacaaccagc44<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>mircroRNA-34aPCR正向引物<400>2ctggtcctggcagtgtcttg20<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>microRNA-34aPCR反向引物<400>3actgtcctggactggtgg18當前第1頁1 2 3