本發明屬于生物工程
技術領域：
，涉及一種生物法制備苯乙酸的方法。
背景技術：
：苯乙酸是一種重要的有機化合物，由于其具有羧基、亞甲基氫和苯環的典型反應，可以生成多種中間體，因此在醫藥、香料、農藥等行業應用廣泛，尤其是在青霉素工業鹽的生產上具有巨大的需求量。目前，苯乙酸的合成路線多達數十種，其中常見的有：氰化鈉法、苯乙烯法、苯乙酮法以及芐基鹵化物羰化法。國內苯乙酸的生產主要采用氰化鈉法，該方法主要分為兩步，首先由氯芐和氰化鈉合成苯乙腈，隨后通過酸堿水解法將苯乙腈轉化為苯乙酸。然而，在苯乙腈水解生產為苯乙酸的過程中，由于需要強酸強堿的參與以及持續保持高溫的過程，能耗較高。技術實現要素：本發明的主要目的在于提供一種生物法制備苯乙酸的方法，該方法的反應條件溫和、能耗低并且原料苯乙腈的轉化率較高。為達到上述目的，本發明的解決方案是：一種生物法制備苯乙酸的方法，其包括如下步驟：將苯乙腈分批次加入轉化液中，在轉化pH為6.0‐9.0和轉化溫度為20‐40℃的條件下反應5‐20個批次，待上一批次的苯乙腈的轉化率達到70％‐100％后加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的轉化率達到70％‐100％后終止反應，得到苯乙酸；其中，苯乙腈所分批次的數目可以為7‐15，優選為8‐12。下一批次的苯乙腈的添加時間為：待上一批次的苯乙腈的轉化率達到80％‐95％后加入下一批次，優選為85％‐90％。轉化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌。該轉化液的制備方法包括如下步驟：(1)、將E.coli工程菌在發酵培養基中進行擴增培養，離心以得到靜息細胞；(2)、收集靜息細胞，并將其懸浮在pH為6.0‐9.0的緩沖液中，得到轉化液。每批次所加入的苯乙腈的量可以相等，為0.1‐20mL/g靜息細胞，也可以為0.3‐10mL/g靜息細胞，還可以為0.5‐1mL/g靜息細胞。在步驟(1)中，發酵培養基的組分及含量如下：酵母膏16‐60gL‐1、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。在步驟(2)中的轉化液中，靜息細胞的濃度大于10gL‐1，優選為10‐100gL‐1，更優選為10‐50gL‐1，最優選為10‐20gL‐1。步驟(2)中的緩沖液為NaH2PO4/Na2HPO4緩沖液、KH2PO4/K2HPO4緩沖液中和Tris‐HCl緩沖液的任意一種。步驟(2)中還添加了苯乙腈的助溶劑，助溶劑為體積分數為1％‐25％的甲醇、乙醇、異丙醇和正己烷中的任意一種或幾種；步驟(2)中的緩沖液的濃度可以為20‐200mM。助溶劑的體積分數可以為5％‐10％。轉化pH可以為7‐9，優選為7‐8.5，更優選為7.95‐8.10。轉化溫度可以為25‐37℃，優選為30℃。由于采用上述方案，本發明的有益效果是：本發明采用生物法來制備苯乙酸，其先將苯乙腈分為若干體積相等的批次，每隔一定時間將一批次苯乙腈加入轉化液中(每批次所加入的苯乙腈的量也相等)，然后在pH為6.0‐9.0和溫度為20‐40℃的條件下反應，待上一批次的苯乙腈的轉化率達到一定程度后再加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的轉化率達到一定程度后終止反應，得到苯乙酸。由上述可知，本發明的方法以苯乙腈為起始原料，利用高密度發酵獲得的靜息細胞(用于分泌MG腈水解酶)為生物催化劑，并采用具有較高水解活性的MG腈水解酶和苯乙腈的分批次加入工藝相結合來生產苯乙酸，不僅工藝路線簡單、反應條件溫和以及沒有污染，而且能夠通過不斷控制苯乙腈的加入量來實現苯乙酸的高濃度積累，使單批次反應苯乙酸積累濃度高達1M，苯乙腈的轉化率大于99％，從而具有良好的工業化應用前景。另外，本發明的方法成本低廉，能耗也較低。總之，相對于現有技術而言，由MG腈水解酶介導的苯乙腈水解為苯乙酸的過程反應所需條件溫和，能夠有效地降低能耗，對環境友好，成為苯乙酸生產的一條有效取代途徑。附圖說明圖1為本發明的靜息細胞催化水解苯乙腈制備苯乙酸反應進程曲線圖。具體實施方式本發明公開了一種生物法制備苯乙酸的方法，該方法包括如下步驟：(1)、將用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌在發酵培養基中進行擴增培養，離心以得到靜息細胞；(2)、收集步驟(1)所得的靜息細胞，將該靜息細胞懸浮于pH為6.0‐9.0的緩沖液中，得到轉化液，故該轉化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌；(3)、將苯乙腈分批次加入轉化液中，在pH為6.0‐9.0和溫度為20‐40℃的條件下反應5‐20個批次，待上一批次的苯乙腈的轉化率達到70％‐100％后加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的轉化率達到70％‐100％后終止反應，得到苯乙酸。其中，在步驟(1)中，MG腈水解酶是由BCJ2315腈水解酶突變而來的，BCJ2315腈水解酶來自BurkholderiacenocepaciaJ2315。用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌詳見Wang等人在AppliedandEnvironmentMicrobiology,2015,81:24公開的非專利文獻《ProteinEngineeringofaNitrilasefromBurkholderiacenocepaciaJ2315forEfficientandEnantioselectiveProductionof(R)‐ο‐ChloromandelicAcid》的記載。步驟(1)中的發酵培養基含有以下組分并且每種組分的含量(如表1所示)如下：酵母膏16‐60g/L、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。在步驟(1)中，還可以根據實際情況添加發酵補料培養基(如表2所示)。在步驟(2)所得的轉化液中，靜息細胞的濃度應大于10gL‐1，優選為10‐100gL‐1，更優選為10‐50gL‐1，最優選為10‐20gL‐1。催化反應所需的MG腈水解酶是通過靜息細胞分泌的，所以靜息細胞的濃度影響的是MG腈水解酶的濃度。而MG腈水解酶的濃度越高則相對的催化效率越高，即單位時間內苯乙腈的轉化量越高。步驟(2)中的緩沖液為NaH2PO4/Na2HPO4緩沖液、KH2PO4/K2HPO4緩沖液中、Tris‐HCl緩沖液或其他任何常用pH緩沖液中的任意一種。步驟(2)中除了添加緩沖液外，還可以添加苯乙腈的助溶劑，助溶劑為體積分數為1％‐25％的甲醇、乙醇、異丙醇和正己烷中的任意一種或幾種。該緩沖液的濃度可以為20‐200mM，助溶劑的添加量可以為5％‐10％(v/v)。在步驟(3)中，每批次的苯乙腈的反應條件均相同，均在轉化pH為6.0‐9.0和轉化溫度為20‐40℃的條件下反應。當前一個批次的反應結束后，要重新檢測pH值和溫度并判斷其是否在上述范圍內，若不在，則需要將反應條件重新調整為初始反應條件，即pH為6.0‐9.0中的任意一個數值和溫度為20‐40℃中的任意一個數值。例如，對轉化時pH的調節可以采用氨水、NaOH溶液或者Na2CO3溶液進行。其中，氨水的濃度可以為1M到純氨水，優選為2‐10M，更優選為4‐8M，最優選為6M。轉化時pH和溫度直接對MG腈水解酶的活力即MG腈水解酶的催化效率產生影響。酶的活力在不同的轉化溫度或者不同的轉化pH條件下是不同的。本發明選擇的轉化溫度與轉化pH適于酶的最佳催化效率的發揮。在步驟(3)中，苯乙腈所分成的批次的數目還可以為7‐15，優選為8‐12。在步驟(3)中，每批次的苯乙腈的加入需要在前一批次苯乙腈反應達到一定程度之后。例如，前一批次的苯乙腈的轉化率達到70％‐100％后加入下一批次，優選為80％‐95％，更優選為85％‐90％。在步驟(3)中，每批次所加入的苯乙腈的量相等，為0.1‐20mL/g靜息細胞，優選為0.3‐10mL/g靜息細胞，更優選為0.5‐1mL/g靜息細胞。在整個反應過程中，MG腈水解酶的催化效率由于受到苯乙腈毒性的影響，是逐漸降低的，從而導致每批次苯乙腈的轉化效率是逐漸降低的，因此，上一批次的苯乙腈必須在達到一定的轉化率后再加入下一批次的苯乙腈，這樣能夠促使反應朝著終產物苯乙酸的方向移動。隨著苯乙腈加入批次數目的增加，每批次苯乙腈的加入量可以適當降低，或者每批次苯乙腈的反應時間可以適當增加。在本發明的一個優選實施例中，通過采用適當延長每批次的反應時間的方式，已經達到較高的轉化率。作為本發明的一個優選實施例，靜息細胞催化水解苯乙腈制備苯乙酸反應進程曲線圖如圖1所示。圖1的縱坐標表示濃度，橫坐標表示時間，■圖例代表苯乙腈的濃度變化，●圖例代表苯乙酸的濃度積累。由圖1可知，苯乙酸生成量能夠達到1M，由于反應過程中向轉化液中添加苯乙腈以及氨水造成的反應液體積的膨脹，實際檢測濃度會低于1M。由此可知，本發明的制備苯乙酸的方法反應轉化率高，單批次濃度積累高，生產安全簡便，無任何副產品，不污染環境。本發明的測定MG腈水解酶活性的方法和下列實施例中酶活力的單位特定義如下：在pH8.0的50mM的NaH2PO4/Na2HPO4緩沖體系中，以100mM的苯乙腈為底物，20mg/ml(濕重)的靜息細胞濃度下，30℃下震蕩30min，2M鹽酸終止反應，HPLC方法檢測苯乙腈轉化情況。若苯乙腈轉化完全，則認為該批次細胞酶活力合格，可用于進行后續苯乙酸的制備。以下結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例本實施例公開了一種生物法制備苯乙酸的方法，其包括如下步驟：(1)、取出在‐80℃下保藏的E.coli工程菌，在LB瓊脂平板上進行接種，之后于37℃培養過夜；(2)、挑取LB瓊脂平板上的單克隆菌落，并將其接種于LB液體培養基中，之后于37℃培養過夜；(3)、從過夜培養后的LB液體培養基中取適量菌液，接種于LB液體培養基中，于37℃培養8h，之后接種于發酵培養基(如表1所示，最終pH值為7)中，于37℃培養至OD600為20，然后加入適量IPTG，降溫至30℃繼續培養16h，離心收集菌體(取沉淀物)，用pH為8.0的NaH2PO4/Na2HPO4緩沖液洗滌兩次，得到靜息細胞；在37℃培養的過程中可以視情況添加發酵補料培養基。發酵補料培養基是為了提高靜息細胞的發酵濃度，而不斷的向發酵培養基中補加的營養成分。理論上當發酵培養基當中的碳源消耗至較低水平時即開始添加，實際操作過程中則通過觀察發酵液的pH變化情況，當pH開始升高(一般反應3‐4h)時則開始添加發酵補料培養基(如表2所示)。(4)、取20g靜息細胞加入到1L100mMpH為8.0的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液中，然后加入100mL乙醇，攪拌均勻，使靜息細胞懸浮在pH為6.0‐9.0的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液中，得到轉化液；(5)、將苯乙腈分為5個批次，先將第一批次加入轉化液中，加入量為11.5ml/L，在pH為7.95‐8.10和溫度為30℃的條件下反應，待該批次的苯乙腈的轉化率達到100％后加入下一批次，并視情況重新調節pH為7.95‐8.10和溫度為30℃，以此類推，直至加入第五批次，待第五批次的苯乙腈的轉化率達到100％后終止反應，得到苯乙酸。表1發酵培養基的組分含量表組分含量酵母膏16‐60gL‐1蛋白胨12‐80gL‐1甘油1‐500mlL‐1K2HPO424.75gL‐1KH2PO43.47gL‐1MgSO41gL‐1表2發酵補料培養基的組分含量表組分含量酵母膏60gL‐1蛋白胨80gL‐1甘油500ml上述的對實施例的描述是為便于該
技術領域：
的普通技術人員能理解和使用本發明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限于上述實施例，本領域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明范疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3