本發明屬于造紙廢棄物領用領域,特別涉及以造紙污泥為原料制備纖維素酶。
背景技術：
造紙污泥即造紙生產過程中（包括蒸煮、洗選、打漿、漂白、抄紙）各個工段產生的污水中所沉淀下的含有泥沙、造紙填料、細小纖維等（無機的、有機的）復雜物資的綜合性污泥。造紙污泥具有量大、氣味惡臭、隨污水流動的特點，且成分復雜，含水量高，處理難度大，一直都是造紙污水處理中令環保人士最為無奈、最為頭疼的事情。長期以來，絕大部分造紙污泥隨意外運、簡單填埋、被棄置填坑或焚燒等，不但占用大量土地，還造成嚴重的二次污染以及新的環境問題，給生態環境帶來了隱患。對造紙污泥的處理只有投資沒有效益，嚴重制約了很多企業的發展。
本發明根據造紙污泥獨有的特性，開發一種造紙污泥資源化利用的新技術，對該領域具有重要意義；同時以造紙污泥作為底物生產纖維素酶，降低纖維素酶的生產成本，可以解決纖維素酶由于生產成本高限制其應用的局限性問題。
技術實現要素：
發明目的：本發明的目的是以造紙污泥為原料制備纖維素酶，解決造紙污泥處理難的問題，同時降低纖維素酶的生產成本。
技術方案：一種以造紙污泥為原料制備纖維素酶的方法，包括以下步驟：
（1）造紙污泥的預處理
用清水將造紙污泥配置成質量濃度在5%～10%的泥水；利用離心機，在2000～3000 轉/分的轉速下，將泥水分離10～20分鐘后，除去上層清液和沉淀物底層的三分之一，得到沉淀物上層的三分之二混合物，常溫擠壓脫水，得到含水量為40%～60%的粗污泥；
（2）碳源底物的制備
利用質量濃度為15%～25%的磷酸溶液，在55～70℃溫度下，與粗污泥攪拌反應1～2小時，反應過程物料配比為磷酸溶液20～40份、粗污泥20～40份，反應完成后常溫擠壓脫水得到含水量40%～60%的一段污泥；
利用質量濃度為1.0%～1.5%的硫酸溶液，在微沸的條件下消煮一段污泥30～60分鐘，反應過程物料配比為硫酸溶液60～90份、一段污泥10～30份，反應完成后常溫擠壓脫水得到含水量40%～60%的二段污泥；
利用質量濃度為1.0%～1.5%的氫氧化鈉溶液，在微沸的條件下消煮二段污泥30～60分鐘，反應過程物料配比為磷酸溶液60～90份、二段污泥10～30份，反應完成后常溫擠壓脫水得到含水量40%～60%的三段污泥；
在抽濾的條件下，利用質量濃度為5%～10%的乙醇溶液清洗三段污泥，清洗過程物料配比為乙醇溶液60～90份、三段污泥5～10份，然后用清水清洗至pH值6.0～7.0范圍，清洗后烘干，得到碳源底物；
（3）纖維素酶的培養
菌種的活化：將里氏木霉菌種轉移至斜面培養基，置入生化培養箱中，在26℃環境下培養7天，得到活化菌種；
其中斜面培養基為綜合馬鈴薯培養基
種子液的培養：用接種環將活化菌種轉入裝有50ml種子培養基的250ml種子瓶中，置于水浴恒溫搖床上，在30℃、搖床轉速180 r/min的環境下培養2天，得到種子液；
其中種子培養基為葡萄糖40g/L，示蛋白胨1g/L，硫酸銨2.2g/L，尿素0.5g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.3g/L，氯化鈣0.3g/L，Mandels 微量元素1ml，并用檸檬酸緩沖液調節pH值為5.0的混合溶液
產酶培養基的配置與滅菌：將碳源底物與氮源和無機營養物按比例配置成產酶培養基，配置過程碳源底物濃度為40～60 g/L，并用檸檬酸緩沖液調節pH值為5.0后，置于121℃的高溫滅菌鍋中滅菌30min；
其中氮源為示蛋白胨1g/L、硫酸銨2.2g/L和尿素0.5g/L的混合物
其中無機營養物為磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.3g/L、Mandels 微量元素1ml和T-80 1mL的混合物
纖維素酶的培養：將種子液接種到裝有50ml產酶培養基的250ml三角瓶內，置于搖床上，在溫度28～40℃下，通氣培養6～7天，得到發酵液；發酵液經抽濾除去菌體及雜質，即為纖維素酶。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚,下面結合具體實施例對本發明進行詳細描述。
具體實施方式一：
步驟一：造紙污泥的預處理
用清水將造紙污泥配置成質量濃度在5%的泥水；利用離心機，在3000 轉/分的轉速下，將泥水分離20分鐘后，除去上層清液和沉淀物底層的三分之一，得到沉淀物上層的三分之二混合物，常溫擠壓脫水，得到含水量為40%的粗污泥；
步驟二：碳源底物的制備利用質量濃度為15%的磷酸溶液，在55℃溫度下，與粗污泥攪拌反應1小時，反應過程物料配比為磷酸溶液20份、粗污泥20份，反應完成后常溫擠壓脫水得到含水量40%的一段污泥；
利用質量濃度為1.0%的硫酸溶液，在微沸的條件下消煮一段污泥30分鐘，反應過程物料配比為硫酸60溶液份、一段污泥10份，反應完成后常溫擠壓脫水得到含水量40%的二段污泥；
利用質量濃度為1.0%的氫氧化鈉溶液，在微沸的條件下消煮二段污泥30分鐘，反應過程物料配比為磷酸溶液60份、二段污泥10份，反應完成后常溫擠壓脫水得到含水量40%的三段污泥；
在抽濾的條件下，利用質量濃度為5%的乙醇溶液清洗三段污泥，清洗過程物料配比為乙醇溶液60份、三段污泥5份，然后用清水清洗至pH值6.0范圍，清洗后烘干，得到碳源底物；
步驟三：纖維素酶的培養
菌種的活化：將里氏木霉菌種轉移至斜面培養基，置入生化培養箱中，在26℃環境下培養7天，得到活化菌種；
其中斜面培養基為綜合馬鈴薯培養基種子液的培養：用接種環將活化菌種轉入裝有50ml種子培養基的250ml種子瓶中，置于水浴恒溫搖床上，在30℃、搖床轉速180 r/min的環境下培養2天，得到種子液；
其中種子培養基為葡萄糖40g/L，示蛋白胨1g/L，硫酸銨2.2g/L，尿素0.5g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.3g/L，氯化鈣0.3g/L，Mandels 微量元素1ml，并用檸檬酸緩沖液調節pH值為5.0的混合溶液產酶培養基的配置與滅菌：將碳源底物與氮源和無機營養物按比例配置成產酶培養基，配置過程碳源底物濃度為40g/L，并用檸檬酸緩沖液調節pH值為5.0后，置于121℃的高溫滅菌鍋中滅菌30min；
其中氮源為示蛋白胨1g/L、硫酸銨2.2g/L和尿素0.5g/L的混合物其中無機營養物為磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.3g/L、Mandels 微量元素1ml和T-80 1mL的混合物纖維素酶的培養：將種子液接種到裝有50ml產酶培養基的250ml三角瓶內，置于搖床上，在溫度28℃下，通氣培養6天，得到發酵液；發酵液經抽濾除去菌體及雜質，即為纖維素酶。
具體實施方式二：具體實施方式二區別于實施方式一在于步驟一中造紙污泥質量濃度為10%，離心轉速3000 轉/分，離心時間20分鐘。步驟二中一段污泥工藝段，磷酸溶液質量濃度為25%，反應過程物料配比為磷酸溶液40份、粗污泥40份，反應溫度為70℃，反應時間為2小時；二段污泥工藝段，硫酸溶液質量濃度為1.5%，反應過程物料配比為硫酸溶液90份、一段污泥30份，反應溫度為微沸，反應時間為60分鐘；三段污泥工藝段，氫氧化鈉溶液質量濃度為1.5%，反應過程物料配比為氫氧化鈉溶液90份、二段污泥30份，反應溫度為微沸，反應時間為60分鐘；清洗工藝段，乙醇溶液質量濃度為10%，清洗過程物料配比為乙醇90份、三段污泥10份，然后用清水清洗至pH值7.0范圍。步驟三中產酶培養基的配置時，碳源底物濃度為60 g/L；纖維素酶的培養在溫度40℃下，通氣培養7天。
具體實施方式三：具體實施方式三區別于實施方式一在于步驟一中造紙污泥質量濃度為7.5%，離心轉速2500 轉/分，離心時間15分鐘。步驟二中一段污泥工藝段，磷酸溶液質量濃度為20%，反應過程物料配比為磷酸溶液30份、粗污泥30份，反應溫度為62.5℃，反應時間為1.5小時；二段污泥工藝段，硫酸溶液質量濃度為1.25%，反應過程物料配比為硫酸溶液75份、一段污泥20份，反應溫度為微沸，反應時間為45分鐘；三段污泥工藝段，氫氧化鈉溶液質量濃度為1.25%，反應過程物料配比為氫氧化鈉溶液75份、二段污泥20份，反應溫度為微沸，反應時間為45分鐘；清洗工藝段，乙醇溶液質量濃度為7.5%，清洗過程物料配比為乙醇60～90份、三段污泥7.5份，然后用清水清洗至pH值6.5范圍。步驟三中產酶培養基的配置時，碳源底物濃度為50 g/L；纖維素酶的培養在溫度34℃下，通氣培養6.5天。
具體實施方式四：具體實施方式四區別于實施方式一在于步驟一中造紙污泥質量濃度為6.25%，離心轉速3000 轉/分，離心時間12.5分鐘。步驟二中一段污泥工藝段，磷酸溶液質量濃度為17.5%，反應過程物料配比為磷酸溶液25份、粗污泥20份，反應溫度為58℃，反應時間為1.25小時；二段污泥工藝段，硫酸溶液質量濃度為1.1%，反應過程物料配比為硫酸溶液65份、一段污泥15份，反應溫度為微沸，反應時間為35分鐘；三段污泥工藝段，氫氧化鈉溶液質量濃度為1.1%，反應過程物料配比為氫氧化鈉溶液65份、二段污泥15份，反應溫度為微沸，反應時間為35分鐘；清洗工藝段，乙醇溶液質量濃度為6%，清洗過程物料配比為乙醇65份、三段污泥6份，然后用清水清洗至pH值7.0范圍。步驟三中產酶培養基的配置時，碳源底物濃度為45 g/L；纖維素酶的培養在溫度30℃下，通氣培養7天。
具體實施方式五：具體實施方式五區別于實施方式一在于步驟一中造紙污泥質量濃度為8.75%，離心轉速2500 轉/分，離心時間17.5分鐘。步驟二中一段污泥工藝段，磷酸溶液質量濃度為22.5%，反應過程物料配比為磷酸溶液35份、粗污泥30份，反應溫度為65℃，反應時間為1.75小時；二段污泥工藝段，硫酸溶液質量濃度為1.4%，反應過程物料配比為硫酸溶液85份、一段污泥25份，反應溫度為微沸，反應時間為55分鐘；三段污泥工藝段，氫氧化鈉溶液質量濃度為1.4%，反應過程物料配比為氫氧化鈉溶液85份、二段污泥25份，反應溫度為微沸，反應時間為55分鐘；清洗工藝段，乙醇溶液質量濃度為9%，清洗過程物料配比為乙醇85份、三段污泥9份，然后用清水清洗至pH值6.5范圍。步驟三中產酶培養基的配置時，碳源底物濃度為55 g/L；纖維素酶的培養在溫度38℃下，通氣培養6.5天。