一種比伐盧定的合成方法與流程

本發明屬于多肽藥物制備方法
技術領域：
，特別涉及比伐盧定的固相片段合成方法。
背景技術：
：比伐盧定外文名或通用名為Bivalirudin，具有以下結構：D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-L-甘胺酰-L-甘氨酰-L-甘氨酰-L-甘氨酰-L-天冬酰氨酰-L-甘氨酰-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L異亮氨酰-L-脯胺酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-酪胺酰-L-亮氨酸比伐盧定(bivalirudin)是一種近年來應用于臨床的直接凝血酶抑制劑，于2000年批準在美國上市，其有效抗凝成分為水蛭素衍生物片段，通過直接并特異性抑制凝血酶活性而發揮抗凝作用，作用可逆而短暫。早期的臨床研究顯示：比伐盧定抗凝治療效果確切，且出血事件的發生率較低，和傳統的肝素抗凝治療相比使用更為安全。對于接受經皮冠狀動脈介入治療（PCI）的患者，比伐盧定可用于替代肝素。大多數比伐盧定的III期試驗均使用缺血和出血結局的主要復合終點比較比伐盧定和肝素，這些試驗發現比伐盧定優于或不劣于肝素。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提出一種新的比伐盧定的合成方法，該方法顯著的提高了比伐盧定的收率與純度，反應簡單可控，適用于工業生產。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種比伐盧定的固相片段合成方法，其特點是：該方法以三苯甲基氯類型樹脂為起始，采用固相合成1-10全保護肽樹脂，將全保護十一肽從樹脂上切割下來在固相中接入11-20肽樹脂，經裂解得到比伐盧定粗品。本發明所要解決的技術問題還可以通過以下的技術方案來實現。本發明所述的比伐盧定的合成方法，其進一步優選的技術方案是：該方法的具體步驟如下：（1）在縮合劑與催化劑作用下，由Fmoc-Leu-OH和wangresin偶聯得到Fmoc-Leu-wangresin脂；（2）脫去Fmoc，在縮合劑作用下，依次偶聯Tyr,Glu,Glu,Ile,Glu,Glu,Phe,Asp得到Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-wangresin，即S1；（3）Fmoc-Gly-OH與CTCResin在有機堿作用下反應得到Fmoc-Gly-CTCResin；（4）脫去Fmoc，在縮合劑作用下，依次偶聯Asn,Gly-Gly,Gly-Gly,Pro,Arg,Pro,D-Phe得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-CTCresin，即S2；其中X為氨基保護基；（5）使用切割試劑切割S1得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly，即S3；（6）在縮合劑作用下，S3與S1反應得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-wangresin，即S4；當X是不為Boc的氨基保護基時，先脫除X，再裂解得到比伐盧定粗品；當X為Boc時，直接經裂解得到比伐盧定粗品。本發明所要解決的技術問題還可以通過以下的技術方案來實現。本發明所述的比伐盧定的合成方法，其進一步優選的技術方案是：1、所述的縮合劑選自DIC、EDC·HCl中任意一種與HOBt、Cl-HOBt、HOAt、HOCt中任意一種的組合。2、所述的縮合劑選自HBTU、HATU、HCTU、TBTU、PyBOP、PyAOP中任意一種與DIEA、TEA、NMM中任意一種的組合。3、所述的氨基保護基X可以為現有技術中可適用于本發明的任何氨基保護基，優選自Boc或者Fmoc。4、使用切割試劑選自20%的TFE/DCM溶液或者1-2%的TFA/DCM溶液。5、步驟（3）中所述的CTCResin替代度為0.5-2.0mmol/g，優選為1.0-1.5mmol/g。6、步驟（1）中所述的WangResin替代度為0.3-1.5mmol/g,優選0.5-0.6mmol/g。7、所述的有機堿選自DIEA、NMM、Py、DMAP中任意一種。8、所述催化劑選自Py、DMAP中任意一種。本發明涉及的英文縮寫所對應的中文名稱見下表：英文縮寫中文名稱英文縮寫中文名稱Pro脯氨酸CTCResin2-氯-三苯甲基氯樹脂Leu亮氨酸Wangresin王樹脂Arg精氨酸TEA三乙胺Tyr酪氨酸NMMN-甲基嗎啉Phe苯丙氨酸DIEAN,N-二異丙基乙胺Asp天冬氨酸DIC二異丙基碳二亞胺Asn天冬酰胺HOBt1-羥基苯并三氮唑Gly甘氨酸DMAP對二甲氨基吡啶Glu谷氨酸Boc叔丁氧羰基Ile異亮氨酸Trt三苯甲基Fmoc9-芴甲氧羰基TFE三氟乙醇tBu叔丁基TFA三氟乙酸pbf(2,3-二氫-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基HOAt1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑PIP六氫吡啶DCM二氯甲烷Py吡啶DMFN,N-二甲基甲酰胺HBTU苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽EDC·HCI1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽HCTU6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯PyBOP六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷PyAOP(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽HATU2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯本發明提供的合成方法中，所用到的原料、試劑及Fmoc-Gly-Gly-OH均可由市場購得。與現有技術相比，本發明方法既避免了多Gly10雜質的產生又成功的降低了Arg偶聯的難度，顯著的提高了比伐盧定的收率與純度。本發明工藝過程僅涉及氨基酸的縮合和脫保護，反應簡單可控，適用于工業生產。附圖說明圖1為實驗例制得的比伐盧定產品MS圖；圖2為實驗例制得的比伐盧定產品HPLC圖。具體實施方式下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例1，一種比伐盧定的合成方法：該方法以三苯甲基氯類型樹脂為起始，采用固相合成1-10全保護肽樹脂，將全保護十一肽從樹脂上切割下來在固相中接入11-20肽樹脂，經裂解得到比伐盧定粗品。實施例2，一種比伐盧定的合成方法，該方法的具體步驟如下：（1）在縮合劑與催化劑作用下，由Fmoc-Leu-OH和wangresin偶聯得到Fmoc-Leu-wangresin脂；（2）脫去Fmoc，在縮合劑作用下，依次偶聯Tyr,Glu,Glu,Ile,Glu,Glu,Phe,Asp得到Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-wangresin，即S1；（3）Fmoc-Gly-OH與CTCResin在有機堿作用下反應得到Fmoc-Gly-CTCResin；（4）脫去Fmoc，在縮合劑作用下，依次偶聯Asn,Gly-Gly,Gly-Gly,Pro,Arg,Pro,D-Phe得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-CTCresin，即S2；其中X為氨基保護基；（5）使用切割試劑切割S1得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly，即S3；（6）在縮合劑作用下，S3與S1反應得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-wangresin，即S4；當X是不為Boc的氨基保護基時，先脫除X，再裂解得到比伐盧定粗品；當X為Boc時，直接經裂解得到比伐盧定粗品。所述的縮合劑選自DIC、EDC·HCl中任意一種與HOBt、Cl-HOBt、HOAt、HOCt中任意一種的組合。或者選自HBTU、HATU、HCTU、TBTU、PyBOP、PyAOP中任意一種與DIEA、TEA、NMM中任意一種的組合。所述的氨基保護基X選自Boc或者Fmoc。使用切割試劑選自20%的TFE/DCM溶液或者1-2%的TFA/DCM溶液。步驟（3）中所述的CTCResin替代度為0.5-2.0mmol/g，優選為1.0-1.5mmol/g。步驟（1）中所述的WangResin替代度為0.3-1.5mmol/g,優選0.5-0.6mmol/g。所述的有機堿選自DIEA、NMM、Py、DMAP中任意一種。所述催化劑選自Py、DMAP中任意一種。實施例3，一種比伐盧定的合成方法實驗：實驗例1Fmoc-Leu-wangresin的制備稱取wangresin（0.53mmol/g）47.2g置于反應柱中，加入DCM400mL氮氣吹拂攪拌溶漲30min，抽干。稱取Fmoc-Leu-OH26.5g，HOBt11.1g,DMAP0.9g置于燒杯中，加入30%DCM/DMF135mL,攪拌溶解，降溫至3±2℃。量取DIC12.8mL加入上述燒杯中，反應溫度10±2℃，反應10min。加入反應柱中，30±5℃氮氣吹拂攪拌反應5小時，抽干溶劑，DMF洗滌3次，DCM洗滌4次，35℃鼓風干燥8小時，得Fmoc-Leu-wangresin55.6g，取代度0.47mmol/g。實驗例2Fmoc-Leu-wangresin的制備稱取wangresin（0.53mmol/g）47.2g置于反應柱中，加入DCM400mL溶漲30min，抽干。稱取Fmoc-Leu-OH26.5g，HOBt11.1g置于燒杯中，加入30%DCM/DMF135mL,攪拌溶解，降溫至3±2℃。量取DIC12.8mL加入上述燒杯中，反應溫度10±2℃，反應10min。加入反應柱中。量取Py20mL加入反應柱中，60±5℃氮氣吹拂攪拌反應5小時，抽干溶劑，DMF洗滌3次,DCM洗滌4次，35℃鼓風干燥8小時，得Fmoc-Leu-wangresin52.6g，取代度0.45mmol/g。實驗例3Fmoc-Gly-CTCResin的制備取CTCResin(1.2mmol/g)50.00g置于多肽反應器中，加入DCM400mL氮氣吹拂攪拌30分鐘，使樹脂充分溶脹后抽干DCM。稱取Fmoc-Gly-OH53.46g,加入DMF340mL攪拌溶解，加入DIEA94.5mL，冰浴15分鐘后加入多肽反應器中，氮氣吹拂攪拌反應2小時后抽干反應液，DMF洗滌3次，DCM洗滌4次，35℃鼓風干燥8小時，得Fmoc-Gly-CTCResin65.6g，取代度0.92mmol/g。實驗例4S1肽樹脂的制備取Fmoc-Leu-wangresin21.3g(10mmol)置于多肽反應器中，加入DCM200mL氮氣吹拂攪拌30分鐘，使樹脂充分溶脹后抽干DCM。加入DBLK80mL脫Fmoc保護2次，5+15分鐘，每次80mL。DMF洗滌5次，每次80mL，1分鐘。稱取Fmoc-Tyr(tBu)-OH9.2g(20mmol),HOBt3.0g(22mmol),加入DMF80mL攪拌溶解，冰浴5分鐘，加入DIC3.4mL(22mmol)，冰浴活化10分鐘后加入多肽反應柱中，氮氣吹拂攪拌反應1小時后抽干反應液，DMF洗滌3次，每次100mL。按此方法依次接入Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH。脫除Fmoc，得到S1肽樹脂。實驗例5S1肽樹脂的制備取Fmoc-Leu-wangresin21.3g(10mmol)置于多肽反應器中，加入DCM200mL氮氣吹拂攪拌30分鐘，使樹脂充分溶脹后抽干DCM。加入DBLK80mL脫Fmoc保護2次，5+15分鐘，每次80mL。DMF洗滌5次，每次80mL，1分鐘。稱取Fmoc-Tyr(tBu)-OH9.2g(20mmol),HBTU6.8g(19mmol)，加入DMF80mL攪拌溶解，冰浴5分鐘，加入DIEA5.2mL(30mmol)，冰浴活化10分鐘后加入多肽反應柱中，氮氣吹拂攪拌反應1小時后抽干反應液，DMF洗滌3次，每次100mL。按此方法依次接入Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH。脫除Fmoc，得到S1肽樹脂實驗例6S2肽樹脂的制備取Fmoc-Gly-CTCResin27.4g(25mmol)置于多肽反應器中，加入DCM200mL氮氣吹拂攪拌30分鐘，使樹脂充分溶脹后抽干DCM。加入DBLK80mL脫Fmoc保護2次，5+15分鐘，每次80mL。DMF洗滌5次，每次100mL，1分鐘。稱取Fmoc-Asn(Trt)-OH29.9g(50mmol),HOBt7.4g(55mmol),加入DMF100mL攪拌溶解，冰浴5分鐘，加入DIC8.5mL(55mmol)，冰浴活化10分鐘后加入多肽反應柱中，氮氣吹拂攪拌反應1小時后抽干反應液，DMF洗滌3次，每次100mL，1分鐘。按此方法依次接入Fmoc-Gly-Gly-OH,Fmoc-Gly-Gly-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Pro-OH,Boc-D-Phe-OH。DMF洗滌3次，DCM洗滌4次，35℃鼓風干燥8小時,得到S2肽樹脂。實驗例7S2肽樹脂的制備取Fmoc-Gly-CTCResin27.4g(25mmol)置于多肽反應器中，加入DCM200mL氮氣吹拂攪拌30分鐘，使樹脂充分溶脹后抽干DCM。加入DBLK80mL脫Fmoc保護2次，5+15分鐘，每次80mL。DMF洗滌5次，每次100mL，1分鐘。稱取Fmoc-Asn(Trt)-OH29.9g(50mmol),HBTU16.1g(45mmol),加入DMF100mL攪拌溶解，冰浴5分鐘，加入DIEA12.9mL(75mmol)，冰浴活化10分鐘后加入多肽反應柱中，氮氣吹拂攪拌反應1小時后抽干反應液，DMF洗滌3次，每次100mL，1分鐘。按此方法依次接入Fmoc-Gly-Gly-OH,Fmoc-Gly-Gly-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Pro-OH,Boc-D-Phe-OH。DMF洗滌3次，DCM洗滌4次，35℃鼓風干燥8小時,得到S2肽樹脂。實驗例8S3全保護肽的制備取實驗例6S2肽樹脂，加入600mL1%TFA/DCM溶液中室溫攪拌裂解2.0小時。濾去樹脂，加入無水碳酸鉀5g干燥8小時。過濾，濃縮至油狀。實施例9S3全保護肽的制備取實驗例7S2肽樹脂肽樹脂，加入600mL20%TFE/DCM溶液中室溫攪拌裂解1.5小時。濾除樹脂，樹脂再加入300mL20%TFE/DCM溶液中室溫攪拌裂解1.5小時后濾去樹脂，合并濾液，濃縮至油狀。實驗例10S4肽樹脂的制備取實驗例8所得S3全保護肽(25mmol)，加入30%DCM/DMF200mL溶解后倒入燒杯中。稱取HOBt3.7g(27.5mmol)加入燒杯中，溶解，降溫至5℃。取DIC4.3mL(27.5mmol)加入上述已降溫溶液中10±5℃反應15min，加入實施例4S1肽樹脂中反應3小時。DMF洗滌3次，DCM洗滌4次，35℃鼓風干燥8小時,得到S4肽樹脂。實驗例11S4肽樹脂的制備取實驗例9所得S3全保護肽(25mmol)，加入30%DCM/DMF200mL溶解后倒入燒杯中。稱取HATU8.6g(22.5mmol)加入燒杯中，溶解，降溫至5℃。取DIEA6.5mL(37.5mmol)加入上述已降溫溶液中10±5℃反應15min，加入實施例5S1肽樹脂中反應3小時。DMF洗滌3次，DCM洗滌4次，35℃鼓風干燥8小時,得到S4肽樹脂。實驗例12裂解配制TFA:苯甲硫醚:EDT:苯甲醚=90:5:3:2(體積比)的裂解液400mL冰浴至5℃。取實施例10所得S4肽樹脂加入上述裂解液中，25±5℃裂解2h，加入2400mL冰乙醚中析晶。離心，所得固體乙醚研洗離心3次，真空減壓干燥。得粗肽31.4g，HPLC定量含目的肽16.7g，收率76.6%。本例所得產品MS，HPLC見圖1-圖2。以上所述僅是本發明的優選實施方式，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來應用和實現本發明技術。當前第1頁1 2 3