本發明涉及醫學領域，具體而言，涉及一種破骨細胞培養基、其制備方法和培養破骨細胞方法。
背景技術：
人體的骨組織中含有成骨細胞和破骨細胞，共同負責完成骨吸收和骨形成兩個骨重塑過程，兩者處于動態平衡。破骨細胞是主要的骨吸收細胞，來源于骨髓造血干細胞，由骨髓中的多個單核巨噬細胞融合而成。破骨細胞數量和活性的增加與多種骨質流失的臨床疾病密切相關，包括骨質疏松、慢性腎臟病并發的礦物質和骨代謝紊亂；破骨細胞還主導骨移植物的骨吸收作用和炎癥性骨丟失等。這些疾病及其引發的骨折將嚴重影響患者的生活質量和生存時間。因此，為了在礦物質和骨代謝紊亂的發病機制與治療方面尋求突破，破骨細胞成為相關研究的重點。隨著時間的推移和科技的進步，破骨細胞的培養方法也日新月異。
破骨細胞主要分布于骨質表面與骨內血管通道周圍的小陷窩內。破骨細胞主要的生理功能是溶解與吸收骨質，參與骨組織的重建和維持血鈣的動態平衡。由于破骨細胞獨特的功能，對破骨細胞的研究在闡明骨代謝性疾病的病理生理機制以及為疾病診療提供新方法中具有至關重要的意義。然而，破骨細胞是高代謝終末分化細胞，具有不能傳代、存活時間短等特點，且破骨細胞在體內數量極少，難以分離獲得。
目前，破骨細胞培養方法主要有：機械分離法、骨髓單核細胞誘導培養法、脾臟造血干細胞培養法以及血液單核細胞誘導分化培養法等；這些方法不可避免都要使用培養液對細胞進行培養，且不同的階段采用不同配方的培養液進行，目前常見的原代細胞培養液多為含有血清的基礎培養液，誘導過程中則選擇添加誘導劑促使破骨細胞分化。然而，現有技術中誘導培養過程中所用的誘導劑單一簡單，誘導分化破骨細胞的效果并不理想，因此，提供一種可高效獲得破骨細胞的培養基是本領域亟待解決的一個技術問題。
有鑒于此，特提出本發明。
技術實現要素：
本發明的第一目的在于提供一種用于體外培養制備破骨細胞的培養基，以期通過改良培養基的組成從而提高破骨細胞的得率，為大量獲得破骨細胞提供保障。
本發明的第二目的在于提供一種所述培養基的制備方法，以實現該培養基的快速制備。
本發明的第三目的在于提供一種利用所述的培養基制備破骨細胞的方法，該方法合理利用培養基，在不同的階段采用不同的培養基，通過前期的提取純化培養以及后續的誘導培養體外制備破骨細胞，簡化了體外制備破骨細胞的流程。
為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：
本發明提供了一種破骨細胞培養基，所述培養基包括：骨髓細胞培養基和誘導培養基；其中，所述骨髓細胞培養基為含有巨噬細胞集落刺激因子10-40μg/L、含14-16％體積分數血清的基礎培養液；所述誘導培養基為含有20-70ng/mL RANKL、10-40ng/mL M-CSF、0.1-1μm/mL 1,25(OH)2D3、2-5ng/mL甲狀旁腺激素、6-10ng/mL白細胞介素、2-8ng/ml腫瘤壞死因子α、8-12ng/mL前列腺素E2和2-5ng/mL地塞米松的基礎培養液。
本發明提供的培養基含有骨髓細胞培養基和誘導培養基，該兩種培養基的基礎組分均為細胞基礎培養液，并且用于破骨細胞不同制備階段細胞的培養，較為特殊的是，在骨髓細胞培養基中加入了特定含量的巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和血清，M-CSF是一種具有譜系特異性的細胞因子。M-CSF為鏈間二硫鍵連接而成的二聚體糖蛋白，其對單核細胞的增殖、分化及維持其活性有重要促進作用，其次其在培養基中濃度選擇合理，為骨髓間質單核細胞的大量增殖提供了先決條件，另外，經過實驗驗證，14-16％體積分數的血清對于形成體積大，胞漿豐滿，細胞突起延展，細胞核呈圓形或橢圓形的培養細胞具有重要的促進作用。
在誘導培養基中，本發明創造性地加入了RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲狀旁腺激素、白細胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松等誘導因子，而且對各誘導因素在培養液中的濃度進行了限定，各誘導因子在協同的作用下，活使得經過前期培養獲得的骨髓間質細胞能夠大量地分化為破骨細胞，進而提高了破骨細胞的得率。
可選的，所述基礎培養液包括α-MEM培養液，DMEM，RPMI-1640，F12，M199，DMEM/F12中的一種或幾種。
為了提供本發明的培養基的應用效果，基礎培養液可以采用上述所列的多種成熟培養液，其中，綜合考慮培養效果，以α-MEM培養液為優選基礎培養液，在另一優選的方案中，基礎培養液為DMEM，RPMI-1640，F12，M199，DMEM/F12等體積的混合物。
可選的，所述血清為胎牛血清、馬血清和羊血清中的一種或幾種。
血清是很復雜的混合物,其組成成份雖大部分已為人所知，但還有一部分尚不清楚，而且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。
上述所列血清的主要成份有:
①蛋白質：是血清中主要成份。除包括可攜帶金屬離子、脂肪酸和自身是激素類蛋白外主要還有白蛋白、球蛋白。纖維粘連素細胞促進細胞附著；血清中巨球蛋白有抑制胰蛋白酶的作用；胎球蛋白促細胞附著；轉鐵蛋白能結合鐵離子，減少其毒性和被細胞利用。
②多肽：血小板促生長因子能促細胞分裂，是多肽家庭的主要成員之一，是主要的促細胞增殖因子；成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、神經細胞生長因子等，血清中含量雖很少，但對細胞生長也有一定作用。
③激素：激素對細胞的作用是多方面的，胰島素促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸，與促細胞分裂有關。類胰島素生長因子能與細胞表達的胰島素受體結合，從而有胰島素同樣的作用。促生長激素能夠促細胞增殖效應。血清中含有定量的氫化可的松，它可能兼有促細胞貼附和增殖作用。
可選的，所述誘導培養基中，還含有體積分數占8-9％的胎牛血清。
基于上述血清對細胞增殖所具備的促進作用，本申請中，在誘導培養基中也優選加入體積分數占8-9％的胎牛血清，鑒于細胞密度高時，血清中的氫化可的松可能有抑制細胞的作用和誘導其發生分化，因此，本申請誘導培養基中所加入的胎牛血清的體積分數為8-9％。
可選的，所述誘導培養基中，所述白細胞介素包括白細胞介素-1和白細胞介素-6。
可選的，所述誘導培養基中，所述白細胞介素-1與所述白細胞介素-6的濃度比為1-3。
白細胞介素的種類繁多，且功能非常復雜，在本申請中，優選白細胞介素-1和白細胞介素-6，該兩種白細胞介素(尤其是其濃度比為1-3)時，可與誘導培養基中的其他誘導因素產生協同效果，共同促進破骨細胞的分化。
上述的破骨細胞培養基的制備方法，包括以下步驟：
配制基礎培養液，并在基礎培養液中先加入既定體積分數的血清，然后再加入巨噬細胞集落刺激因子，使其濃度為10-40μg/L，得到骨髓細胞培養基；
在另一基礎培養液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲狀旁腺激素、白細胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各試劑達到預定濃度，得到誘導培養基。
上述的制備方法中，先制備基礎培養液并且定量，然后在基礎培養液中加入巨噬細胞集落刺激因子以及血清，或者在基礎培養液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲狀旁腺激素、白細胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松，實現培養基的制備，需要指出的是，本發明提供的培養基的組分是預先混在一起的，因此在未使用時，應在低溫條件下保藏，防止其失去活性。
可選的，所述RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲狀旁腺激素、白細胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松依次序先后加入。
一種根據所述的破骨細胞培養基培養破骨細胞的方法，包括以下步驟：
1)、將骨髓血細胞加入到骨髓細胞培養基中培養后，離心，并將所得的沉淀利用α-MEM培養液重懸，得到細胞懸液；
優選的，骨髓細胞的提取可以采用如下操作進行：
在無菌條件下取動物個體的骨，并且去除骨組織上的肌肉和軟組織，隨后剪開骨的兩端后利用骨髓細胞培養基將骨髓從一端吹下，反復消化清洗后，繼續加入一定量的骨髓細胞培養基培養預定時間，然后進行離心，離心后的沉淀利用α-MEM培養液重懸。
2)、將所述細胞懸液純化；
得到的細胞懸液由于其含有雜細胞較多，因此需要純化去除雜細胞，純化過程一般采用培養基篩選的辦法，使得目的細胞增殖，雜細胞被除去。
3)、將純化后的細胞接種至細胞培養板中，并在細胞培養板中加入誘導培養基進行培養，并每隔1-2天換液一次，得到分化的破骨細胞。
可選的，在步驟1)中，所述離心的條件為800-1200轉/分鐘，離心的時間為5-8分鐘。
可選的，在步驟2)中，所述純化具體包括：
將細胞懸液用α-MEM培養液稀釋到所需濃度，接種于培養板上，在35-37℃的CO2孵箱內培養20-25分鐘，再用α-MEM培養液洗去未貼壁細胞，得到純化后細胞。
與現有技術相比，本發明的有益效果為：
(1)、破骨細胞體外培養是研究骨吸收的基礎，如何獲得純度高，數量多的破骨細胞仍是目前該項研究的熱點，本發明提供的通體外培養破骨細胞的培養基以及培養方法，通過對培養基的組分進行特定的選擇，對骨髓中細胞分步進行培養純化以及誘導，實現快速大量制備破骨細胞的效果。
(2)、本發明提供的培養基組分合理優化，利于細胞的大量增殖和分化，為建立完善的體外破骨細胞培養體現提供了先決基礎。
(3)、本發明提供的這種體外破骨細胞的培養體現，實現了方法與培養基的結合，整個培養方法簡化，可控性強，通過提供培養基的方式實現即可在短時間內(不到7天)即可獲得大量多核、高活性的破骨細胞的制備。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明制備廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
本發明的實施例中，提供了一種破骨細胞培養基，所述培養基包括：骨髓細胞培養基和誘導培養基；其中，所述骨髓細胞培養基為含有巨噬細胞集落刺激因子10-40μg/L、含14-16％體積分數血清的基礎培養液；所述誘導培養基為含有10-70ng/mL RANKL、10-40ng/mL M-CSF、0.1-1μm/mL 1,25(OH)2D3、2-5ng/mL甲狀旁腺激素、6-10ng/mL白細胞介素、2-8ng/mL腫瘤壞死因子α、8-12ng/mL前列腺素E2和2-5ng/mL地塞米松的基礎培養液。
更為優選的，在上述方案的基礎之上，本發明的技術方案還可以包括以下一種或者多種限定，所述基礎培養液包括α-MEM培養液，DMEM，RPMI-1640，F12，M199，DMEM/F12中的一種或幾種。所述血清為胎牛血清、馬血清和羊血清中的一種或幾種。或者，所述誘導培養基中，還含有體積分數占8-9％的胎牛血清。優選的，所述誘導培養基中，所述白細胞介素包括白細胞介素-1和白細胞介素-6。更為優選的，所述誘導培養基中，所述白細胞介素-1與所述白細胞介素-6的濃度比為1-3。
本發明提供的上述的破骨細胞培養基的制備方法，包括以下步驟：配制基礎培養液，并在基礎培養液中先加入既定體積分數的血清，然后再加入巨噬細胞集落刺激因子，使其濃度為10-40μg/L，得到骨髓細胞培養基；在另一基礎培養液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲狀旁腺激素、白細胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各試劑達到預定濃度，得到誘導培養基。
另外，為了保證所制成的誘導培養基的活性，所述RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲狀旁腺激素、白細胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松依次序先后加入。
根據所述的破骨細胞培養基培養破骨細胞的方法，包括以下步驟：將骨髓血細胞加入到骨髓細胞培養基中培養后，離心，并將所得的沉淀利用α-MEM培養液重懸，得到細胞懸液；將所述細胞懸液純化；將純化后的細胞接種至細胞培養板中，并在細胞培養板中加入誘導培養基進行培養，并每隔1-2天換液一次，得到分化的破骨細胞。
另外，優選的，所述離心的條件為800-1200轉/分鐘，離心的時間為5-8分鐘。所述純化具體包括：將細胞懸液用α-MEM培養液稀釋到所需濃度，接種于培養板上，在35-37℃的CO2孵箱內培養20-25分鐘，再用α-MEM培養液洗去未貼壁細胞，得到純化后細胞。
接下來，本發明對于破骨細胞體外培養基及其制備方法舉出以下具體實施例，具體請參考實施例1-實施例6。
實施例1
本實施例提供的破骨細胞培養基及其制備方法如下：
破骨細胞培養基包括骨髓細胞培養基和誘導培養基；兩種培養基中，基礎培養液(α-MEM培養液)均為500mL。其中，所述骨髓細胞培養基為含有巨噬細胞集落刺激因子10μg/L、含14％體積分數胎牛血清的基礎培養液；所述誘導培養基為含有10ng/mL RANKL、35ng/mL M-CSF、0.1μm/mL 1,25(OH)2D3、2ng/mL甲狀旁腺激素、6ng/mL白細胞介素、2ng/mL腫瘤壞死因子α、8ng/mL前列腺素E2和2ng/mL地塞米松的基礎培養液。
制備方法：
配制基礎培養液，并在基礎培養液中先加入既定體積分數的胎牛血清，然后再加入巨噬細胞集落刺激因子，使其濃度為10μg/L，得到骨髓細胞培養基；在另一基礎培養液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲狀旁腺激素、白細胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各試劑達到預定濃度，得到誘導培養基。
實施例2
本實施例提供的破骨細胞培養基及其制備方法如下：
破骨細胞培養基包括骨髓細胞培養基和誘導培養基；兩種培養基中，基礎培養液(α-MEM培養液)均為500mL。其中，所述骨髓細胞培養基為含有巨噬細胞集落刺激因子30μg/L、含15％體積分數馬血清的基礎培養液；所述誘導培養基為含有68ng/mL RANKL、37ng/mLM-CSF、0.5μm/mL1,25(OH)2D3、3ng/mL甲狀旁腺激素、8ng/mL白細胞介素、5ng/mL腫瘤壞死因子α、10ng/mL前列腺素E2和4ng/mL地塞米松的基礎培養液。
制備方法：
配制基礎培養液，并在基礎培養液中先加入15％體積分數的馬血清，然后再加入巨噬細胞集落刺激因子，使其濃度為30μg/L，得到骨髓細胞培養基；在另一基礎培養液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲狀旁腺激素、白細胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各試劑達到預定濃度，得到誘導培養基。
實施例3
本實施例提供的破骨細胞培養基及其制備方法如下：
破骨細胞培養基包括骨髓細胞培養基和誘導培養基；兩種培養基中，基礎培養液(α-MEM培養液)均為500mL。其中，所述骨髓細胞培養基為含有巨噬細胞集落刺激因子35μg/L、含16％體積分數胎牛血清的基礎培養液；所述誘導培養基含有70ng/mL RANKL、40ng/mL M-CSF、1μm/mL 1,25(OH)2D3、5ng/mL甲狀旁腺激素、10ng/mL白細胞介素、8ng/mL腫瘤壞死因子α、12ng/mL前列腺素E2和5ng/mL地塞米松的基礎培養液。
制備方法：
配制基礎培養液，并在基礎培養液中先加入15％體積分數的胎牛血清，然后再加入巨噬細胞集落刺激因子，使其濃度為35μg/L，得到骨髓細胞培養基；在另一基礎培養液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲狀旁腺激素、白細胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各試劑達到預定濃度，得到誘導培養基。
實施例4
本實施例提供的破骨細胞培養基及其制備方法如下：
破骨細胞培養基包括骨髓細胞培養基和誘導培養基；兩種培養基中，基礎培養液(等體積比的DMEM，RPMI-1640，F12，M199，DMEM/F12)均為500ml。其中，所述骨髓細胞培養基為含有巨噬細胞集落刺激因子30μg/L、含15％體積分數(等體積比的胎牛血清、馬血清和羊血清)的基礎培養液；所述誘導培養基為含有66ng/mLRANKL、38ng/mLM-CSF、0.5μm/mL1,25(OH)2D3、4ng/mL甲狀旁腺激素、8ng/mL白細胞介素、6ng/mL腫瘤壞死因子α、10ng/mL前列腺素E2、含8％體積分數和4ng/mL地塞米松的基礎培養液。
制備方法：
配制基礎培養液，并在基礎培養液中先加入既定體積分數的血清，然后再加入巨噬細胞集落刺激因子，使其濃度為30μg/L，得到骨髓細胞培養基；在另一基礎培養液中加入培養基其他組份，使得各試劑達到預定濃度或體積含量，得到誘導培養基。
實施例5
本實施例提供的破骨細胞培養基及其制備方法如下：
破骨細胞培養基包括骨髓細胞培養基和誘導培養基；兩種培養基中，基礎培養液(α-MEM培養液)均為500mL。其中，所述骨髓細胞培養基為含有巨噬細胞集落刺激因子28μg/L、含15％體積分數胎牛血清的基礎培養液；所述誘導培養基為含有68ng/mLRANKL、38ng/mLM-CSF、0.5μm/mL1,25(OH)2D3、3ng/mL甲狀旁腺激素、2ng/mL白細胞介素-1、6ng/mL白細胞介素-1、4ng/mL腫瘤壞死因子α、10ng/mL前列腺素E2、3ng/mL地塞米松和占基礎培養液體積分數為9％的胎牛血清的基礎培養液。
制備方法：
配制基礎培養液，并在基礎培養液中先加入既定體積分數的胎牛血清，然后再加入巨噬細胞集落刺激因子，使其濃度為28μg/L，得到骨髓細胞培養基；在另一基礎培養液中加入各試劑，使得各試劑達到預定濃度，得到誘導培養基。
本發明提供的這種快速大量制備破骨細胞的方法具體包括如下的步驟：
試驗例
利用上述實施例1-5提供的培養基進行體外破骨細胞的培養，培養方法按照以下操作進行。
1)、將骨髓血細胞加入到骨髓細胞培養基中培養后，800-1200轉/分鐘，離心5-8分鐘，并將所得的沉淀利用于沉淀5倍體積的α-MEM培養液重懸，得到細胞懸液；
2)、將細胞懸液用α-MEM培養液稀釋后接種于培養板上，在35-37℃的CO2孵箱內培養20-25分鐘，再用α-MEM培養液洗去未貼壁細胞，得到純化后細胞；
3)、將純化后的細胞接種(接種密度為1.6×103個/cm2)至細胞培養板中，該細胞培養板中事先加入置入牛骨片以及玻片，并在細胞培養板中加入各實施例中的誘導培養基中進行培養，并每隔1天換液一次，培養5天之后采用TRAP的方法進行染色，并采用倒置熒光顯微鏡進行觀察和計數，具體的統計結果如下表1所示：
表1 試驗例1細胞計數結果和骨吸收陷窩情況
綜上所述，本發明提供的通過體外培養破骨細胞的培養基以及培養方法，通過對培養基的組分進行特定的選擇，對骨髓中細胞分步進行培養純化以及誘導，實現快速大量制備破骨細胞的效果，實現了方法與培養基的結合，整個培養方法簡化，可控性強，通過提供培養基的方式實現即可在短時間內(不到7天)獲得大量多核、高活性的破骨細胞的制備。
盡管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發明范圍內的所有這些變化和修改。