本發明涉及一種用于微生物法定量檢測維生素B12的微孔板、其試劑盒及其制備方法，屬于微生物法檢測領域。
背景技術：
目前，國內外關于維生素B12的檢測方法都比較復雜，一般有微生物法、高效液相法和酶聯免疫法。其中，高效液相法檢測的下限較微生物法要高出很多，精度較好，但是需要昂貴的精密儀器和試劑，樣品處理過程較為復雜，難以在生產上進行推廣應用；另外，酶聯免疫法檢測結果與實際數值出入較大。而微生物法可靈敏地檢測出具有生物活性的維生素B12，這是微生物法區別于其他方法的最大特點及優勢。
現有的微生物方法利用德氏乳桿菌(Lactobacillus leichmannii)對維生素B12的特異性和靈敏性，定量測定出試樣中維生素B12的含量。在測定用培養基中供給除維生素B12以外的所有營養成分，這樣微生物生長產生的透光率就會同標準曲線工作液及未知待測溶液中維生素B12的含量相對應；以不同濃度標準溶液的透光率相對于各濃度水平標準物質的濃度繪制標準曲線，根據標準曲線即可計算出試樣中維生素B12的含量。
但是包被有德氏乳桿菌的試劑盒卻存在諸多缺陷，現有方法在-80℃使微孔板中的微生物懸浮液冷凍休眠，然后將微孔板中的微生物團在真空下冷凍干燥。一些微生物為了適應不利環境，發生變異或重組，因此加入水或樣品后，有些微生物在無維生素的條件下仍能生長，導致高檢測背景，而且在個別情況下還會導致錯誤結果。另外，現有方法采用在真空下冷凍干燥，還可導致至少約20％的菌種損失。
因此，需要進一步改進微生物方法利用德氏乳桿菌(Lactobacillus leichmannii)對維生素B12檢測的方法。
技術實現要素：
為了克服上述現有方法的不足，本發明提供一種用于微生物法定量檢測維生素B12的微孔板，可減少菌種損失，提高檢測結果的準確性。
本發明的另一目的在于提供上述微孔板的制備方法。
本發明的還一目的在于提供包含該微孔板的試劑盒。
本發明的再一目的在于提供一種用于微生物法定量檢測維生素B12的試劑盒的制備方法。
為了實現上述目的，本發明所述的一種用于微生物法定量檢測維生素B12的微孔板，其由如下步驟制備而成：
1)活化德氏乳桿菌，將活化后的德氏乳桿菌菌株接種到乳桿菌肉湯培養基中，32-40℃培養18-24h，2000轉/min離心2-3min，棄去上清液；
2)加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液，混勻后離心2-3min，棄去上清液，重復前述操作一次，然后再加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液，混勻，制得菌懸液；吸1-2ml菌懸液至10ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液中，混勻制成測試菌液；
3)將所述測試菌液2-12μl添加至微孔板各孔中，分別在25mTorr、50mTorr、500mTorr、5Torr、50Torr、200Torr的低真空環境下稍稍加熱測試菌液，使測試菌液在25℃-35℃的溫度條件下沸騰而產生泡沫，并在所述低真空環境和室溫下蒸發干燥24-72h，或者冷凍后再以升華的方式干燥24-72h。
其中，步驟1)中的活化德氏乳桿菌采用活化方式：
將11g脫脂奶粉加入89ml蒸餾水中，混勻，115℃滅菌15分鐘，即為液體培養基；
將0.1-0.4g粉末德氏乳桿菌菌株加入10ml所述液體培養基中，36±1℃培養直至凝乳，得凝乳狀菌種，放置于0--4℃保存；
將0.1-0.4ml上步驟中培養好的凝乳狀菌種加入10ml所述液體培養基中，36±1℃培養直至凝乳；
重復幾次上一步驟，不同的是每次使用的菌種均是上一步驟獲得的培養物，待凝乳時間穩定后表明菌種已活化好。
所述德氏乳桿菌菌株為德氏乳桿菌ATCC7830。
步驟2)中海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液中，各自的濃度分別為190-210mM、9-11mM。
為了實現本發明的另一目的，提供一種制備用于微生物法定量檢測維生素B12的微孔板的方法，其由如下步驟制備而成：
1)活化德氏乳桿菌，將活化后的德氏乳桿菌菌株接種到乳桿菌肉湯培養基中，32-40℃培養18-24h，2000轉/min離心2-3min，棄去上清液；
2)加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液，混勻后離心2-3min，棄去上清液，重復前述操作一次，然后再加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液，混勻，制得菌懸液；吸1-2ml菌懸液至10ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液中，混勻制成測試菌液；
3)將所述測試菌液2-12μl添加至微孔板各孔中，分別在25mTorr、50mTorr、500mTorr、5Torr、50Torr、200Torr的低真空環境下稍稍加熱測試菌液，使測試菌液在25℃-35℃的溫度條件下沸騰而產生泡沫，并在所述低真空環境和室溫下蒸發干燥24-72h，或者冷凍后再以升華的方式干燥24-72h，從而制得定量檢測維生素B12用微孔板。
其中，步驟1)中的活化德氏乳桿菌采用活化方式：
將11g脫脂奶粉加入89ml蒸餾水中，混勻，115℃滅菌15分鐘，即為液體培養基；
將0.1-0.4g粉末德氏乳桿菌菌株加入10ml所述液體培養基中，36±1℃培養直至凝乳，得凝乳狀菌種，放置于0--4℃保存；
將0.1-0.4ml上步驟中培養好的凝乳狀菌種加入10ml所述液體培養基中，36±1℃培養直至凝乳；
重復幾次上一步驟，不同的是每次使用的菌種均是上一步驟獲得的培養物，待凝乳時間穩定后表明菌種已活化好。
所述德氏乳桿菌菌株為德氏乳桿菌ATCC7830。
步驟2)中海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液中，各自的濃度分別為190-210mM、9-11mM。
本發明還提供一種包含上述微孔板的試劑盒。
所述試劑盒，還包含維生素B12標準品、維生素B12測試培養基以及無菌水。
具體地說，本發明所述試劑盒，包含包被有德氏乳桿菌ATCC7830菌株的上述微孔板、3×0.012μg維生素B12標準品、3×(0.5-0.6)g維生素B12測試培養基(蛋白胨10g/L、牛肉提取物10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、聚山梨醇酯80 1g/L、檸檬酸銨2g/L、醋酸鈉5g/L、硫酸鎂0.1g/L、硫酸錳0.05g/L、磷酸氫二鉀2g/L)以及3×30ml無菌水。
本發明所述的試劑盒的制備方法，其包括如下步驟：
a.先制備包含包被有德氏乳桿菌菌株的微孔板：
1)活化德氏乳桿菌，將活化后的德氏乳桿菌菌株接種到乳桿菌肉湯培養基中，32-40℃培養18-24h，2000轉/min離心2-3min，棄去上清液；
2)加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液，混勻后離心2-3min，棄去上清液，重復前述操作一次，然后再加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液，混勻，制得菌懸液；吸1-2ml菌懸液至10ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液中，混勻制成測試菌液；
3)將所述測試菌液2-12μl添加至微孔板各孔中，分別在25mTorr、50mTorr、500mTorr、5Torr、50Torr、200Torr的低真空環境下稍稍加熱測試菌液，使測試菌液在25℃-35℃的溫度條件下沸騰而產生泡沫，并在所述低真空環境和室溫下蒸發干燥24-72h，或者冷凍后再以升華的方式干燥24-72h，從而制得定量檢測維生素B12用微孔板；
b.然后制備包含維生素B12標準品及維生素B12測試培養基(蛋白胨10g/L、牛肉提取物10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、聚山梨醇酯80 1g/L、檸檬酸銨2g/L、醋酸鈉5g/L、硫酸鎂0.1g/L、硫酸錳0.05g/L、磷酸氫二鉀2g/L)。
其中，所述活化德氏乳桿菌采用活化方式：
將11g脫脂奶粉加入89ml蒸餾水中，混勻，115℃滅菌15分鐘，即為液體培養基；
將0.1-0.4g粉末德氏乳桿菌菌株加入10ml所述液體培養基中，36±1℃培養直至凝乳，得凝乳狀菌種，放置于0--4℃保存；
將0.1-0.4ml上步驟中培養好的凝乳狀菌種加入10ml所述液體培養基中，36±1℃培養直至凝乳；
重復幾次上一步驟，不同的是每次使用的菌種均是上一步驟獲得的培養物，待凝乳時間穩定后表明菌種已活化好。
所述德氏乳桿菌菌株為德氏乳桿菌ATCC7830。
所述海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液中，各自的濃度分別為190-210mM、9-11mM。
本發明所述的用于微生物法定量檢測維生素B12的微孔板及其試劑盒，通過在制備中加入海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液保護劑，以及改進菌液的干燥方法，可降低了試劑盒中的菌種損失，提高了維生素B12檢測結果的準確性，經活菌計數，制備的微孔板中的德氏乳桿菌干燥泡沫中保存的活性菌種數，均超過了所添加菌液中菌種總數的90％(普通冷凍干燥法至少損失約20％的菌種)。
附圖說明
圖1為本發明所述的用于微生物法定量檢測維生素B12的檢測標準曲線。
具體實施方式
下面參考附圖來說明本發明的實施例。在本發明的一個附圖或一種實施方式中描述的元素和特征可以與一個或更多個其他附圖或實施方式中示出的元素和特征相結合。應當注意，為了清楚的目的，附圖和說明中省略了與本發明無關的、本領域普通技術人員已知的部件或處理的表示和描述。
下面結合附圖對本發明做進一步描述。
實施例1
1.微孔板制備
(1)活化德氏乳桿菌ATCC 7830
將11g脫脂奶粉加入89ml蒸餾水中，混勻，以10ml為單位分裝至試管中，115℃滅菌15分鐘，此溶液即為液體培養基。
將0.3g粉末德氏乳桿菌ATCC 7830菌株加入10ml培養基中，36±1℃培養直至凝乳，放置于冰箱保存。
將0.3ml上步驟中培養好的菌種加入10ml培養基中，36±1℃培養直至凝乳。
重復幾次上一步驟，待凝乳時間穩定后表明菌種已活化好。
(2)測試菌液制備
將活化后的德氏乳桿菌ATCC 7830菌株接種到乳桿菌肉湯培養基中，36℃±1℃培養24h，2000轉/min離心2min，使其停止培養，棄去上清液；
加入200mM海藻糖和10mM CaCl2混合溶液10ml，混勻，2000轉/min離心2min，棄去上清液，再加10mL保護劑，混勻。如前離心操作，棄去上清液。再加10mL保護劑，混勻。吸1ml該菌懸液至10mL保護劑中，混勻制成測試菌液。
(3)微孔板包被
將2μl測試菌液等分添加至微孔板各孔中，依次在25mTorr、50mTorr、500mTorr、5Torr、50Torr、200Torr的低真空環境下稍稍加熱菌液(此時可以使微生物更好地包被在微孔板上，并最大限度地保持微生物的活性)，使菌液在25℃的室溫條件下沸騰從而產生泡沫，并在所述低真空環境和室溫下蒸發干燥約72小時從而制得所述維生素B12檢測用微孔板。
經活菌計數，上述方法制備的微孔板中的德氏乳桿菌干燥泡沫中保存的活性菌種數，均超過了所添加菌液中菌種總數的90％(普通冷凍干燥法至少損失約20％的菌種)。
2.標準品制備
定量獲取0.012μg維生素B12標準品至棕色帶蓋試劑瓶中，每個試劑盒中包含3瓶標準品。使用時用2ml試劑盒中的無菌水溶解1瓶標準品，獲得0.6μg/100ml的標準品儲備液，然后根據操作說明書稀釋至所需濃度，0標準品為無菌水。
3.培養基制備
稱量蛋白胨10g、牛肉提取物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、聚山梨醇酯80 1g、檸檬酸銨2g、醋酸鈉5g、硫酸鎂0.1g、硫酸錳0.05g、磷酸氫二鉀2g，混勻。稱取0.5-0.6g混合培養基粉末加入1個培養基瓶中，每個試劑盒包含3瓶。
4.無菌水制備
將雙蒸水在121℃高壓滅菌15分鐘，每瓶30ml，每個試劑盒中包含3瓶無菌水。
5.其它
試劑盒中還包含2片粘合箔。
實施例2
1.微孔板制備
包被德氏乳桿菌株采用德氏乳桿菌ATCC 7830，步驟如下：將活化后的菌株(活化處理方式同實施例1)接種到乳酸桿菌肉湯培養基中，38℃±1℃培養18h，以2000轉/分鐘離心3min，使其停止培養，棄去上清液。加入190mM蔗糖和9mM CaCl2保護劑混合液10ml，混勻，再離心2min，棄去上清液，再加10mL保護劑，混勻。如前離心操作，棄去上清液。再加10mL保護劑，混勻。吸2ml該菌懸液至10mL保護劑中，混勻制成測試菌液。
將1μl所述菌液等分添加至微孔板各孔中，分別在25mTorr、50mTorr、500mTorr、5Torr、50Torr、200Torr的低真空環境下稍稍加熱菌液，使菌液在35℃的室溫條件下沸騰從而產生泡沫，而后將泡沫冷凍隨后以升華的方式干燥，從而制得所述維生素B12檢測用微孔板。
經活菌計數，上述方法制備的微孔板中的德氏乳桿菌干燥泡沫中保存的活性菌種數，均超過了所添加菌液中菌種總數的90％(普通冷凍干燥法至少損失約20％的菌種)。
2.標準品制備
定量獲取0.012μg維生素B12標準品至棕色帶蓋試劑瓶中，每個試劑盒中包含3瓶標準品。使用時用2ml試劑盒中的無菌水溶解1瓶標準品，獲得0.6μg/100ml的標準品儲備液，然后根據操作說明書稀釋至所需濃度，0標準品為無菌水。
3.培養基制備
稱量蛋白胨10g、牛肉提取物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、聚山梨醇酯80 1g、檸檬酸銨2g、醋酸鈉5g、硫酸鎂0.1g、硫酸錳0.05g、磷酸氫二鉀2g，混勻。稱取0.5-0.6g混合培養基粉末加入1個培養基瓶中，每個試劑盒包含3瓶。
4.無菌水制備
將雙蒸水在121℃高壓滅菌15分鐘，每瓶30ml，每個試劑盒中包含3瓶無菌水。
5.其它
試劑盒中還包含2片粘合箔。
采用上述試劑盒對維生素B12進行檢測，在精密度和準確度上均表現優良。
實驗例1
本實驗例在于研究本發明所述試劑盒的精密度。
使用3批次試劑盒(實施例1制備的試劑盒)檢測NIST參考物質1849A【美國國家標準與技術研究所奶粉參考物質，濃度目標值為4.82μg/100g】，做平行實驗，結果見表1。每個批次檢測NIST參考物質1849A的1種稀釋(最終濃度在標準曲線范圍內)。
表1
測定NIST參考物質濃度的變異系數非常小(0.81％)，表明精密度高。3個批次間標準品原始結果的變異低于10％。
使用3批次試劑盒(實施例2制備的試劑盒)檢測NIST參考物質1849A【美國國家標準與技術研究所奶粉參考物質，濃度目標值為4.82μg/100g】，做平行實驗，結果見表2。每個批次檢測NIST參考物質1849A的1種稀釋(最終濃度在標準曲線范圍內)。
表2
測定NIST參考物質濃度的變異系數非常小(4.94％)，表明精密度高。3個批次間標準品原始結果的變異低于10％。
實驗例2
本實驗例在于研究本發明所述試劑盒的準確度。
分別采用本實施例1試劑盒與對比試劑盒檢測NIST參考物質1849A，按各自產品操作說明書進行樣品提取，并分別做4個稀釋(最終濃度均在標準曲線范圍內)，每個稀釋做3個平行，結果見表3。
現有試劑盒微孔板的制備方式：
德氏乳桿菌ATCC 7830的培養物過量接種于10ml乳酸桿菌培養基中，培養36小時。在對數生長期通過離心(2500G×5分鐘)停止培養，將細胞團用0.85％NaCl溶液洗滌3遍，懸浮于10ml分析培養基中，然后用分析培養基1-10倍稀釋。微孔板的每個微孔中加入3μl微生物懸浮液，在-80℃使微孔中的微生物懸浮液冷凍休眠，然后將微孔中的微生物團在真空下冷凍干燥。
準確度＝檢測結果/實際濃度×100％
表3
校準曲線
該檢測標準曲線的范圍為0.06-0.3μg/100g。為了得到樣品中維生素B12的含量，必須將從標準曲線讀取的樣品結果乘以稀釋倍數。數據處理軟件在最終計算時包含稀釋系數，并輸出結果為μg維生素B12/100克樣品。典型的曲線如圖1所示。
雖然已經詳細說明了本發明及其優點，但是應當理解在不超出由所附的權利要求所限定的本發明的精神和范圍的情況下可以進行各種改變、替代和變換。而且，本申請的范圍不僅限于說明書所描述的過程、設備、手段、方法和步驟的具體實施例。本領域內的普通技術人員從本發明的公開內容將容易理解，根據本發明可以使用執行與在此所述的相應實施例基本相同的功能或者獲得與其基本相同的結果的、現有和將來要被開發的過程、設備、手段、方法或者步驟。因此，所附的權利要求旨在在它們的范圍內包括這樣的過程、設備、手段、方法或者步驟。