一種雅致放射毛霉羧肽酶Y基因及其應用的制作方法

本發明涉及一種雅致放射毛霉羧肽酶Y基因及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術：

羧肽酶Y(carboxypeptidase Y，CPY)是絲氨酸類蛋白酶，活性中心由絲氨酸、天門冬氨酸和組氨酸(Ser-Asp-His)組成，它可以水解肽鏈C末端氨基酸殘基形成游離的氨基酸，其廣泛的存在于細菌，真菌，植物與動物中。CPY具有很寬的底物譜，可以水解任何的羧基末端氨基酸，特別是對大部分其他羧肽酶來說難以水解的脯氨酸等殘基，因此它可以應用于多肽的測序和質譜分析。

羧肽酶Y因其可以切割多肽C末端任意氨基酸的水解特性而被廣泛應用，而不同來源的羧肽酶Y的酶學性質并不相同，目前已被報道的CPY主要來源于釀酒酵母、畢赤酵母與裂殖酵母等，其中釀酒酵母來源的CPY被研究的最為清楚。

雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)是腐乳發酵生產的主要菌種之一，擁有非常豐富且高活性的胞外蛋白酶系，CPY也在其中，具有非常大的工業應用潛力。

技術實現要素：

本發明首先提供了一種編碼羧肽酶Y的基因cpy，是以腐乳工業生產用菌雅致放射毛霉為出發菌株，分離其總RNA，反轉錄獲得羧肽酶Y的cDNA，通過RACE獲得基因全長信息。該cpy基因全長1557bp，如SEQ ID NO.1所示，編碼518aa。成熟酶具有水解肽鏈C末端的氨基酸，使其變為游離氨基酸的功能。

本發明還將獲得的基因與載體pPIC9K連接，構建重組表達載體pPIC9K-procpy，轉化畢赤酵母，培養所得重組畢赤酵母，經過誘導后成功表達該基因，得到羧肽酶Y的酶原。將表達的酶原經過體外激活、純化后測定酶活，結果表明SEQ ID NO.1所示基因表達的羧肽酶具有高催化活性的功能。

本發明所提供的羧肽酶Y在酸性條件下具有較高酶活，可以應用于蛋白水解液的脫苦，還可以用于多肽的測序和質譜分析。

附圖說明

圖1為cpy基因的的電泳圖；M，標準Marker；1，CPY基因全長。

圖2為重組酵母菌的分泌表達的羧肽酶的純化結果；M，標準蛋白；0，攜帶pPIC9K的P.pastoris GS115發酵上清；1，重組菌發酵上清；2，純化的proCPY；3，純化的CPY。

圖3為L-Tyr標樣的HPLC圖，出峰時間為3.4min。

圖4 CPY催化反應過程中底物N-CBZ-Phe-Tyr的HPLC圖。

圖5 CPY催化反應過程中產物的HPLC圖，出峰時間為3.4min。

具體實施方式

HPLC測定酶的活性：

取5μl激活純化的CPY加入到1ml 2mmol/L N-CBZ-Phe-Tyr中，在37℃與pH6.0下反應10min，反應所得產物L-Tyr用HPLC進行檢測。色譜柱為DIKMAC18(5μm，4.6×250mm)；流動相A為含55mmol/L醋酸鈉的水，流動相B為含55mmol/L醋酸鈉體積比1:2:2的水、甲醇與乙腈的混合物，pH都為7.2，線性洗脫梯度B的體積百分比為40％-70％，洗脫15min。紫外檢測波長338nm，柱溫40℃。所測得的產物峰面積換算為標準產物濃度，從而計算酶活。酶活定義：在25℃、pH 6.0磷酸鈉緩沖液下，每分鐘轉化N-CBZ-Phe-Tyr生成1μmol L-Tyr所需的酶量為1U。

實施例1 cpy基因的獲得

提取雅致放射毛霉總RNA，以RNA為模版制備RACE-Ready cDNA，以5'–RACE-Ready cDNA為模板，以簡并引物進行PCR擴增，對目的產物進行膠回收后測序，獲得約500bp的基因信息，通過NCBI庫信息比對發現其為CPY部分序列。由獲得的CPY部分序列設計RACE的特異性引物，進一步PCR獲得cpy的序列。

A.elegans PEP001來源的羧肽酶Y的基因全長1557bp，如SEQ ID NO.1所示，編碼518aa。

實施例2 cpy基因的表達

SingnalP預測結構表明AeCPY蛋白N端含有23個氨基酸的N端信號肽序列，最優剪切位點位于第23和第24位氨基酸之間。Expasy中的ProtParam預測proCPY的理論分子量與等電點分別為58.8kD與5.5。根據信號肽預測結果，設計引物擴增編碼proCPY的基因。

上游引物：pPproCPY-F(5'–GGAATTCGAACCAGCCATGTTTCAGCAGCA–3')

下游引物：pPproCPY-R(5'–TAAACTATGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGTTGAGTTCACCACGAACCC ATT–3')。

將PCR擴增得到的procpy基因用EcoR I和Not I限制性內切酶雙酶切后連接到用同樣限制性內切酶酶切的質粒載體pPIC9K上，構建的質粒pPIC9K-procpy轉化到Escherichia coli JM109中，在含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養基平板上挑選陽性重組子，測序驗證。

將質粒pPIC9K-procpy用Sac I線性化，設置電轉參數：1500v，400Ω，4-6ms，電轉畢赤酵母。將轉化子在MD平板上篩選，挑選陽性重組子并用MD與MM平板鑒定轉化子是否為Mut+基因型。用G418濃度分別為0.25,0.5,0.75,2.0,3.0,4.0mg/mL的YPD平板篩選高拷貝轉化子。

將重組質粒pET-22b(+)-procpy轉化到Escherichia coli Rosetta(DE3)中，挑選單菌落至5mL含50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃、200r/min培養10h后，取1mL培養物至100mL含50mg/L氨芐青霉素的2×YT培養基中，在37℃、200r/min培養至菌體的OD600為0.8時加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L，20℃誘導12h后離心收集菌體。重組菌株經誘導表達后，表達產物幾乎全部都是包涵體。這與之前報導的利用大腸桿菌表達釀酒酵母proCPY的結果相類似。

將畢赤酵母轉化子單菌落至100ml BMGY中，30℃、200r/min培養至OD600約20左右，6,000×g離心5min收集菌體轉入100ml BMMY中。30℃、200r/min下每隔24h加入1％的甲醇進行誘導，誘導144h，離心收集發酵上清。將收集的發酵上清，用30ku孔徑的超濾管將發酵上清蛋白濃縮溶于100mM Tris/HCl(pH 7.5)中。用適量trypsin在37℃下處理1h后，加入胰蛋白酶抑制劑，可以獲得較高活性的重組蛋白CPY。激活后的蛋白溶液，用30ku孔徑的超濾管將緩沖液更換為結合緩沖液(20mM磷酸鈉，500mM氯化鈉，20mM咪唑，pH 7.4)，濃縮并除去部分雜蛋白。用His Trap FF crude,1mL鎳柱對粗酶液進行純化，用含150mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，進行SDS-PAGE鑒定(圖2)。

取5μl激活純化的CPY加入到1ml 2mmol/L N-CBZ-Phe-Tyr中，在37℃與pH6.0下反應10min，反應所得產物L-Tyr用HPLC進行檢測。色譜柱為DIKMAC18(5μm，4.6×250mm)；流動相A為含55mmol/L醋酸鈉的水，流動相B為含55mmol/L醋酸鈉體積比1:2:2的水、甲醇與乙腈的混合物，pH都為7.2，線性洗脫梯度B的體積百分比為40％-70％，洗脫15min。紫外檢測波長338nm，柱溫40℃。所測得的產物峰面積換算為標準產物濃度，從而計算酶活。L-Tyr標樣、底物N-CBZ-Phe-Tyr與反應產物HPLC圖如圖3-5所示，酶活為157.20±1.80U/mg(p<0.01)。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學

<120> 一種雅致放射毛霉羧肽酶Y基因及其應用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1557

<212> DNA

<213> 雅致放射毛霉PEP001

<400> 1

atgcccactt tattttcact tgccaaggtg gctgtagtag catcttgtgt atttggctta 60

ggctatgccg aaccagccat gtttcagcag caaggagcta ttgcagattt tggcgaaaag 120

gcctgggaca acgtgcagca cgtagtccat gatgctgctg ataaggtcca cagcgctacg 180

gataaattca agcaaatttt aagccatggc gctgatactt taaccacctt tacccaccct 240

gctttctctc aatacgcttt gagatacaag agacctactc tttgtgatcc tgatgtgaaa 300

caaatttccg gttacttgga cgttggaaaa gataagcatt tcttcttttg gttctttgaa 360

tcaagagata agcccaagga agatcccgtt gttttatggt tgaacggtgg cccaggctgt 420

tcttctttga ccggtctttt tatggaactt ggtccttgta cagtcaataa ggaaggcaat 480

gataccatca tcaacaagta ctcttggaac gataaagcca atattatctt cttggatcag 540

ccattgaatg tcggttattc tcatggtagc ggtggtgcct ccaataccga tgctgctgct 600

caagatgtat atgctttcct tcaactcttc ttcaaggaat tccctcaata tgccgatctt 660

gatttccata tttctggtga atcttatgca ggtcattaca ttcctgccat tggtggagtc 720

attaacaata ataataaggg caagttccag tcaatggaac tcttgaagaa gaagcatacc 780

ctctctgata tcaagctaaa gagtttgttg atcggtaatg gtttgactga tcctttggtt 840

caatacaagt actatgctga aatggcctgt aataattctt atggtcctgt cttggataaa 900

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atccaacctt accaacaaac cggcatgaat ccttatgatg tccgcgaaaa gtgtaaaggt 1080

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aagaaagaag ttggtgccga gactgataaa tatgaaagct gtaacatgca aatcaacttt 1200

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caacctgaaa gcggtcttga tatgttgcag caatgggttc gtggtgaact caactaa 1557

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 60

<212> DNA

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