實時熒光PCR特異性檢測肉蓯蓉的引物及檢測方法與流程

本發明屬于生物
技術領域：
，特別涉及一種特異性好、靈敏度高的實時熒光PCR特異性檢測肉蓯蓉的引物及檢測方法。
背景技術：
：中藥鑒定的主要內容為中藥材及其基元的鑒定，也包括飲片、提取物和中成藥的中藥成分鑒定，中藥的準確鑒定是中藥事業運行和發展的基本環節。以往對于中藥的檢測是根據形態和顯微鏡下特征進行分類與鑒定，鑒定周期長、時效性差。隨著各種先進儀器以及分子生物學的發展，新的鑒別方法亦紛紛推出，如光譜鑒別、色譜鑒別、實時熒光PCR及DNA分子標記鑒別和蛋白質檢測等等。實時熒光PCR檢測是將傳統PCR檢測模式中的PCR擴增和檢測相結合（即在同一個密閉容器中將PCR擴增反應與熒光染料檢測結合在一起），即在每一個PCR循環后檢測擴增產物，當PCR擴增反應結束后，可以得到每個樣品的PCR擴增產物變化曲線。通過分析這些反應曲線，可以得出待測物的定性、定量檢測結果，不僅具有普通PCR的高靈敏性，還具有高特異性和高精確性。然而，對于實時熒光PCR檢測其PCR擴增引物及具體檢測方法尤為重要，不同的引物及檢測方法所得到的檢測結果截然不同。迄今為止，還沒有關于特異性好、靈敏度高的實時熒光PCR特異性檢測肉蓯蓉的引物及檢測方法的相關報道。技術實現要素：本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種特異性好、靈敏度高的實時熒光PCR特異性檢測肉蓯蓉的引物及檢測方法。本發明的技術解決方案是：一種實時熒光PCR特異性檢測肉蓯蓉的引物，其特征在于所述引物的DNA序列如下：上游引物：5’-ACCTCCCCTGTCCCGTTCG-3’；下游引物：5’-ACACCAAGTATCGCATTTCGCTAC-3’。一種上述實時熒光PCR特異性檢測肉蓯蓉的引物的檢測方法，其特征在于：反應體系為：2X濃度的SYBR?PremixExTaq12.5μL濃度為10μmol/L的上游引物0.25μL濃度為10μmol/L的下游引物0.25μL濃度<50ng的待檢樣品的DNA模板1μL雙蒸水11μL；反應參數為：變性，95℃，30s；擴增，95℃，5s、60℃，30s；循環次數30；30個循環以下產生特異性擴增曲線即為肉蓯蓉。本發明PCR引物設計合理，用于實時熒光PCR檢測，可以檢測出來自肉蓯蓉的微量DNA，完全將肉蓯蓉與其它中藥材的ITS2基因進行區分，檢測特異性好、靈敏度高，方法快速，易操作。附圖說明圖1為本發明實施例的引物PCR擴增電泳檢測結果圖。圖2為本發明實施例實時熒光PCR特異性檢測結果圖。圖3為本發明實施例實時熒光PCR的溶解曲線檢測結果圖。圖4為本發明實施例實時熒光PCR特異性檢測肉蓯蓉與其它中草藥的結果圖。圖5為本發明實施例靈敏度分析結果圖。具體實施方式一.實時熒光PCR特異性檢測肉蓯蓉引物序列的設計1.肉蓯蓉相近物種ITS2序列分析登錄NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），以Cistanchedeserticola及ITS2為關鍵詞在nr數據庫中進行搜索，將搜索結果的序列下載存盤后，進行BlastN程序在nr數據庫中進行相似性序列的搜索，并將所有相似性序列下載存盤。2.肉蓯蓉物種特異性檢測引物的設計將下載的序列進行序列的相似性分析和序列性分析，在序列的差異處設計特異性引物：上游引物：5’-ACCTCCCCTGTCCCGTTCG-3’；下游引物：5’-ACACCAAGTATCGCATTTCGCTAC-3’。二.肉蓯蓉ITS2序列的克隆及測序驗證1.肉蓯蓉物種特異性檢測引物合成在上海生工生物工程有限公司合成肉蓯蓉物種特異性檢測引物1對，其DNA序列為：上游引物：5’-ACCTCCCCTGTCCCGTTCG-3’；下游引物：5’-ACACCAAGTATCGCATTTCGCTAC-3’。2.肉蓯蓉DNA的提取采用DNA提取試劑盒（購于寶生物公司）提取肉蓯蓉（徐州醫藥股份有限公司中藥飲片廠商品）模板DNA，用微量分光光度計檢測提取肉蓯蓉模板DNA的濃度為100ng左右；瓊脂糖凝膠電泳檢測：以合成的特異性引物PCR擴增肉蓯蓉模板DNA的后，以2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果如圖1所示。圖1中：M.DL2000marker；1~5.引物擴增結果；6.水對照。表明經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，分別產生128bp的特異性電泳條帶，電泳效果最好，PCR擴增效率高。片段的切膠回收：采用寶生物公司的DNA片段回收試劑盒將目的條帶回收及純化，操作過程按試劑盒附帶的說明書進行。回收片段的連接、克隆及測序：回收片段與克隆載體pMD-19T連接，轉化，經菌液PCR檢測，陽性菌株送上海生物工程有限公司進行序列測定，測序結果采用NCBI的BlastN程序通過序列比對。比對結果確定所克隆的目的片段的序列為肉蓯蓉ITS2序列。三.實時熒光PCR特異性檢測肉蓯蓉的方法25μL反應體系為：2X濃度的SYBR?PremixExTaq12.5μL濃度為10μmol/L的上游引物（SEQIDNO.1）0.25μL濃度為10μmol/L的下游引物（SEQIDNO.2）0.25μL濃度<50ng的待檢樣品的DNA模板1μL雙蒸水11μL反應參數為：變性，95℃，30s；擴增，95℃，5s、60℃，30s；循環次數30；30個循環以下產生特異性擴增曲線即為肉蓯蓉。本發明實施例與水對照、空白對照的特異性擴增曲線檢測結果如圖2所示。圖2中：1.肉蓯蓉、2.水對照、3.空白對照。將本發明實施例與水對照、空白對照的溶解曲線檢測結果如圖3所示。圖3中：1.肉蓯蓉、2.水對照、3.空白對照。結果證明了本發明所設計引物進行PCR擴增具有有效性及特異性。四.本發明實施例檢測方法的特異性檢測：采用DNA提取試劑盒提取表1所示各待測樣品的模板DNA，用微量分光光度計分別檢測所提取的模板DNA的濃度為50ng，除模板DNA外，其它按照本發明實施例所述實時熒光PCR特異性檢測肉蓯蓉的方法實時熒光PCR特異性檢測梔子等其它中藥材，結果如圖4所示。圖4中圖中：1、2、3分別代表ZY1、ZY2、ZY3，4代表ZY4-ZY30的擴增曲線，5為及水對照，6為空白對照。表1樣品編號樣品名稱來源/產地ZY1肉蓯蓉徐州醫藥股份有限公司中藥飲片廠ZY2肉蓯蓉石家莊市誠信中藥材有限公司ZY3肉蓯蓉毫州市永剛飲片廠有限公司ZY4梔子毫州市大西北藥業有限責任公司·安徽省毫州市ZY5龍膽草安國市藥源中藥材有限公司·吉林ZY6知母安國市藥源中藥材有限公司·河北ZY7黃芩安國市藥源中藥材有限公司·河北ZY8黃連安國市藥源中藥材有限公司·四川ZY9甘草吉林ZY10甘草內蒙古ZY11甘草進口ZY12管花肉蓯蓉山東嘉泰中藥飲片有限公司ZY13仙茅安國市藥源中藥材有限公司·廣西ZY14鎖陽安國市藥源中藥材有限公司·內蒙古ZY15枸杞子寧夏中寧縣枸杞開發有限公司ZY16菟絲子安國市藥源中藥材有限公司·內蒙古ZY17地黃安國市藥源中藥材有限公司·河南ZY18黃柏安國市ZY19黃柏吉林省北藥藥材加工有限公司ZY20關黃柏黑龍江ZY21纈草毫州市永剛飲片廠有限公司ZY22金銀花安國市藥源中藥材有限公司·廣西ZY23枇杷安國市藥源中藥材有限公司·內蒙古ZY24桔梗寧夏中寧縣枸杞開發有限公司ZY25鐵皮石斛杭州然電子商務有限公司·云南ZY26石斛廣州ZY27草決明北京同仁堂飲片有限責任公司·安徽ZY28天花粉安國市藥源中藥材有限公司·河南ZY29遠志安國市藥源中藥材有限公司·四川ZY30遠志安國市藥源中藥材有限公司·甘肅結果表明：產生的30個循環以下的特異性擴增曲線即為肉蓯蓉，其他樣品在30個循環以后出現擴增曲線或沒有擴增曲線，說明本發明的檢測方法可以準確的對肉蓯蓉的成分進行鑒定，具有很好的特異性。五.本發明實施例檢測方法的靈敏度檢測采用DNA提取試劑盒提取肉蓯蓉樣品（徐州醫藥股份有限公司中藥飲片廠商品）的模板DNA，用微量分光光度計分別檢測所提取的模板DNA梯度稀釋，制備成25ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.04ng/μL5個濃度梯度樣品，分別按照上述反應體系及反應參數進行實時熒光PCR擴增，以確定本標準方法的檢測靈敏度，結果如圖5所示。圖5中：1、25ng/μL擴增結果；2、5ng/μL擴增結果；3、1ng/μL擴增結果；4、0.2ng/μL擴增結果；5、0.04ng/μL擴增結果；6、空白對照。結果表明：所產生特異性擴增曲線即為肉蓯蓉，當DNA濃度≥0.04ng/μL時均可以特異擴增，即該標準方法的檢測靈敏度為0.04ng/μL。說明本發明實施例檢測方法可以準確的對肉蓯蓉的成分進行鑒定，具有很好的靈敏度。序列表<110>遼寧師范大學<120>實時熒光PCR特異性檢測肉蓯蓉的引物及檢測方法<130>2016<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>上游引物<400>1acctcccctgtcccgttcg19<210>2<211>19<212>DNA<213>下游引物<400>2acaccaagtatcgcatttcgctac24當前第1頁1 2 3