本發明涉及一種糙皮側耳原生質體的制備方法。
背景技術：
木質素是構成植物細胞壁的主要成分，是影響動物消化植物性飼料的關鍵所在。自腐真菌是迄今發現降解木質素最有效的微生物，也是經常用于木質素降解研究的模式菌株。但在自然狀態下，由于白腐真菌的定植緩慢，很難形成優勢種群，其要求的發酵條件較嚴格，目前大多數的研究還僅限于實驗室的小試階段。因此，白腐真菌單一菌株發酵飼料技術尚未成熟。白腐真菌通過分泌胞外氧化酶降解木質素，而白腐真菌的木質素降解酶系是一個多組分的酶系，它們分別由不同的基因控制。用目前的基因工程技術對木質素降解酶系進行轉移很難奏效。雖然自20世紀80年代初以來利用質粒作載體將某些酶的基因轉人大腸桿菌或酵母菌的工作逐漸增多。但是，由于現有轉移系統的特定性質限制了轉移外來片段的大小。因此，尚未見到采用基因轉移的分子生物學方法將整個酶系統成功轉入宿主的報道。
技術實現要素：
本發明提出一種糙皮側耳原生質體的制備方法。
一種糙皮側耳原生質體的制備方法，包括以下步驟：
（1）取糙皮側耳備用；
（2）取PDA培養基生長旺盛的菌絲體，接種于盛有50mL液體培養基的三角瓶中，27℃靜置培養7～13d菌絲體備用；
（3）挑取不同培養時間的菌絲體置于5 mL離心管中，用相應滲透壓穩定劑洗滌，6000 r／min離心10 min，棄去清液；在2 mL離心管中，加入菌絲體，并加入1 mL酶液，每管放入2粒無菌玻璃珠，將菌絲體打散以充分接觸酶液，分別在26、28、30和32℃水浴酶解一定時間，經濾網過濾，4000 r／min離心10 min，去除酶液，用相應滲穩劑洗滌后血球計數板計數，得出。
優選地，所述PDA培養基的制備方法為：
（1）取棉籽皮20％、馬鈴薯20％、葡萄糖2％、KH2P04 0.3％、MgS04·7H20 0.15％和維生素B．6 mg／L備用；
（2）液體培養基：葡萄糖20、酵母粉2、麥麩15、蔗糖15、KH2P04,1．5和MgS04·7H20，0.05g／L，維生素Bl，4mg／L；
（3）再生培養基：液體培養基加入0.8％瓊脂和0.6mol／L不同滲穩劑。
優選地，所述滲穩劑的制備方法為：分別用去離子水將硫酸鎂、氯化鉀、甘露醇和蔗糖配成0.6mol／L質量濃度溶液，滅菌后備用。
優選地，所述酶液的制備方法為：滲穩劑加入酶液，溶解經濾膜，所述濾膜直徑為0.22微米，過濾后備用。
本發明所述方法制備的糙皮側耳原生質體，能促進提高動物的抗病能力，刺激其生長發育，代謝產物對飼料還具有防腐作用，可延長飼料的保質期。
具體實施方式
實施例1
一種糙皮側耳原生質體的制備方法，包括以下步驟：
（1）取糙皮側耳備用；
（2）取PDA培養基生長旺盛的菌絲體，接種于盛有50mL液體培養基的三角瓶中，27℃靜置培養7～13d菌絲體備用；
（3）挑取不同培養時間的菌絲體置于5 mL離心管中，用相應滲透壓穩定劑洗滌，6000 r／min離心10 min，棄去清液；在2 mL離心管中，加入菌絲體，并加入1 mL酶液，每管放入2粒無菌玻璃珠，將菌絲體打散以充分接觸酶液，分別在26、28、30和32℃水浴酶解一定時間，經濾網過濾，4000 r／min離心10 min，去除酶液，用相應滲穩劑洗滌后血球計數板計數，得出。
實施例2
一種糙皮側耳原生質體的制備方法，包括以下步驟：
（1）取糙皮側耳備用；
（2）取PDA培養基生長旺盛的菌絲體，接種于盛有50mL液體培養基的三角瓶中，27℃靜置培養7～13d菌絲體備用；
（3）挑取不同培養時間的菌絲體置于5 mL離心管中，用相應滲透壓穩定劑洗滌，6000 r／min離心10 min，棄去清液；在2 mL離心管中，加入菌絲體，并加入1 mL酶液，每管放入2粒無菌玻璃珠，將菌絲體打散以充分接觸酶液，分別在26、28、30和32℃水浴酶解一定時間，經濾網過濾，4000 r／min離心10 min，去除酶液，用相應滲穩劑洗滌后血球計數板計數，得出。
（4）所述PDA培養基的制備方法為：取棉籽皮20％、馬鈴薯20％、葡萄糖2％、KH2P04 0.3％、MgS04·7H20 0.15％和維生素B．6 mg／L備用；
（5）液體培養基：葡萄糖20、酵母粉2、麥麩15、蔗糖15、KH2P04,1.5和MgS04·7H20，0.05g／L，維生素Bl，4mg／L；
（6）再生培養基：液體培養基加入0.8％瓊脂和0.6mol／L不同滲穩劑。
實施例3
一種糙皮側耳原生質體的制備方法，包括以下步驟：
（1）取糙皮側耳備用；
（2）取PDA培養基生長旺盛的菌絲體，接種于盛有50mL液體培養基的三角瓶中，27℃靜置培養7～13d菌絲體備用；
（3）挑取不同培養時間的菌絲體置于5 mL離心管中，用相應滲透壓穩定劑洗滌，6000 r／min離心10 min，棄去清液；在2 mL離心管中，加入菌絲體，并加入1 mL酶液，每管放入2粒無菌玻璃珠，將菌絲體打散以充分接觸酶液，分別在26、28、30和32℃水浴酶解一定時間，經濾網過濾，4000 r／min離心10 min，去除酶液，用相應滲穩劑洗滌后血球計數板計數，得出。
（4）所述滲穩劑的制備方法為：分別用去離子水將硫酸鎂、氯化鉀、甘露醇和蔗糖配成0.6mol／L質量濃度溶液，滅菌后備用。
（5）所述酶液的制備方法為：滲穩劑加入酶液，溶解經濾膜，所述濾膜直徑為0.22微米，過濾后備用。