本發明屬于納他霉素制備技術領域，具體涉及一種提高納他霉素產量的發酵方法。
背景技術：
納他霉素是一種具有活性的多烯烴大環內酯類的抗真菌類抗生素，可由納塔爾鏈霉菌經過發酵所得到的一種次級代謝產物，納他霉素分子式為C33H47NO13，可含3分子結晶水，相對分子量665.725；如式1所示，其化學結構上含有氨基和羧基，因此納他霉素屬于兩性物質，其分子構造上通常存在著兩種典型構型：酮式結構和烯醇式結構，其中烯醇式結構居多，這就決定了它在許多溶劑中的溶解性較低。納他霉素屬于多烯烴大環內酯類化合物，內酯環上C3～C9部位是半縮醛結構四烯系統是全順式的，含有由一個糖苷鍵連接的碳水化合物基團，這個基團即是氨基二脫氧甘露糖。納他霉素是一種高效廣譜的抗真菌類抗生素，抑菌機理主要是納他霉素依靠其內酯環結構與真菌細胞膜上的甾醇化合物作用，通過形成抗生素-甾醇化合物，破壞真菌的細胞質膜的結構，能夠有效抑制真菌生長，還能避免真菌毒素的產生。
納他霉素作為新型、安全高效的的生物防腐劑和醫用抗菌劑，滿足食品安全發展的要求，將會在食品、藥品等方面的到更加廣泛的應用和研究。雖然由于價格、規模化生產工藝等方面的限制，目前還不能完全取代化學防腐劑，但隨著科學技術的進步生和人們對食品安全意識的增強以及生活水平的逐步提高，納他霉素將會有巨大的潛力和良好的市場前景。
目前，納他霉素仍存在產量較低，產業化生產發展緩慢的問題，由此導致了其價格趨高不下，所以其主要應用于高端產品中，限制了納他霉素的發展。正因為其產量低，所以導致了其價格相對較高，這嚴重限制了納他霉素在我國的產業化應用。長期以來，大部分研究人員著手于從菌種選育和發酵工藝條件的優化等方面進行研究來提高納他霉素的產量，但是現在面臨的問題是仍未達到產業化的需求。因此，開拓出一條新的提高納他霉素的產量的方法，對實際應用具有很大意義。
技術實現要素：
為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種提高納他霉素產量的發酵方法，以納塔爾鏈霉菌為主要原料，依次經菌株活化、種子培養、發酵和納他霉素的提取，得到所述納他霉素；具體的，納塔爾鏈霉菌發酵開始前向發酵培養基中加入大孔吸附樹脂；納塔爾鏈霉菌發酵12-24h時在發酵液中添加大豆油，納塔爾鏈霉菌發酵24-48h時以流加方式向發酵液中加入纈氨酸和蘇氨酸；
其中，所述大孔吸附樹脂的添加量為每升發酵培養基中添加80-100g的大孔吸附樹脂，所述大豆油的添加量為每升發酵液中添加40-50mL的大豆油，所述纈氨酸的添加量為每升發酵液中添加0.5-0.7g的纈氨酸，所述蘇氨酸的添加量為每升發酵液中添加0.2-0.5g的蘇氨酸。
優選地，所述菌株活化的具體步驟為：以納塔爾鏈霉菌為原料，將納塔爾鏈霉菌培養于固體斜面培養基上，在26-30℃下培養3-9天，得到納塔爾鏈霉菌斜面菌株，4℃以下保藏；
所述固體斜面培養基的配方為：每100mL蒸餾水中含有葡萄糖1-2g，瓊脂1.5-2.0g，番茄漿1.5-2.5g，燕麥2-3g，瓊脂1.5-2.0g，pH自然。
更優選地，所述種子培養的具體步驟為：將所述納塔爾鏈霉菌斜面菌株接種于液體種子培養基中，26-30℃培養2-3天，得到納塔爾鏈霉菌種子液；
所述液體種子培養基的配方為：每100mL蒸餾水中含有葡萄糖0.8-1g，胰蛋白胨0.2-0.5g，麥芽浸粉0.3-0.5g，氯化鈉0.6-1g，pH為7.0-7.5。
更優選地，所述發酵的具體步驟為：將所述納塔爾鏈霉菌種子液以2-10％的接種量接到發酵培養基中，得到發酵液，培養條件為26-30℃，轉速160-200r/min，發酵3-7天，得到納塔爾鏈霉菌發酵液；
在納塔爾鏈霉菌發酵開始前，向發酵培養基中加入大孔吸附樹脂；在發酵過程中，在納塔爾鏈霉菌發酵12-24h時，往發酵液中添加大豆油；在納塔爾鏈霉菌發酵24-48h時，往發酵液中以流加的方式添加纈氨酸和蘇氨酸。
所述發酵培養基的配方為：每1000mL蒸餾水中含有葡萄糖30-45g，酵母浸出粉1-3g，牛肉膏5-15g，蒸餾水1L，pH為7.0-7.5。
更優選地，所述納他霉素的提取的具體步驟為：采用甲醇提取法，將甲醇與所述納塔爾鏈霉菌發酵液以體積比為9-10：1的比例混合后，充分混合后離心，離心轉速10000r/min，離心時間為10-20min，取上清液，將上清液用0.22um濾膜過濾，所得濾液即為所述納他霉素溶液。
優選地，所述大孔吸附樹脂為HPD450大孔樹脂。
優選地，所述的納塔爾鏈霉菌為納塔爾鏈霉菌屬中的任何菌株。
更優選地，所述納塔爾鏈霉菌為納塔爾鏈霉菌4.3526。
本發明提供的發酵方法通過對納塔爾鏈霉菌發酵期間按一定比例添加一些物質，一種是氨基酸，氨基酸可作為碳源使用，也可以充當氮源利用，并且氨基酸的代謝產物，例如乙酰CoA，丙酰CoA等物質是大環內酯類抗生素合成的前體；第二種物質大豆油，納塔爾鏈霉菌是好氧菌，大豆油作為氧載體，參與納塔爾鏈霉菌的發酵；最后一種物質是大孔樹脂，大孔樹脂作為一種吸附劑提高納他霉素的回收率，并可以降低發酵產物反饋抑制。該發酵方法使納他霉素產量可提高3-4倍，達到4g/L左右，顯著提高了納他霉素的產量。
具體實施方式
為了使本領域技術人員更好地理解本發明的技術方案能予以實施，下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但所舉實施例不作為對本發明的限定。
本發明以下實施例中所用到的相關試劑，若沒有特殊說明，皆為市售商品，所涉及的制備方法，若沒有特殊說明，皆為現有方法或制造廠商建議的條件。
一種提高納他霉素產量的發酵方法，以納塔爾鏈霉菌為主要原料，依次經菌株活化、種子培養、發酵和納他霉素的提取，得到所述納他霉素；具體的，發酵期間，納塔爾鏈霉菌發酵12-24h時在發酵液中添加大豆油，納塔爾鏈霉菌發酵24-48h時以流加方式向發酵液中加入纈氨酸和蘇氨酸，納塔爾鏈霉菌發酵開始前向發酵培養基中加入大孔吸附樹脂；其中，纈氨酸的添加量為每升發酵液中添加0.5-0.7g的纈氨酸，蘇氨酸的添加量為每升發酵液中添加0.2-0.5g的蘇氨酸，大豆油的添加量為每升發酵液中添加40-50mL的大豆油，大孔吸附樹脂的添加量為每升發酵液中添加80-100g的大孔吸附樹脂。
以下就本發明的技術方案進行具體的舉例說明，需要說明的是，以下實施例中所用的菌種納塔爾鏈霉菌4.3526，購自于中國普通微生物菌種保藏管理中心。
對比例1
一種納他霉素產量的發酵方法，具體步驟如下：
(1)菌體活化培養
將納塔爾鏈霉菌4.3526培養于固體斜面培養基上，在28℃下培養7天，可得到納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株，保藏于4℃下備用。此固體斜面培養基配方為：蒸餾水100mL，葡萄糖2g，瓊脂2g，番茄漿2g，燕麥2g，pH值自然。
(2)搖瓶種子培養
將步驟(1)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株用接種環取2環接種于液體種子培養基中，在28℃，搖床轉速為180r/min的條件下培養2天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526種子液，備用。以上納塔爾鏈霉菌的種子培養基配方為：葡萄糖10g，胰蛋白胨5g，氯化鈉10g，麥芽浸粉5g，蒸餾水1L，pH為7.2。
(3)發酵
將步驟(2)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526種子液以6％的接種量接種到發酵培養基中，培養條件為28℃，搖床轉速為180r/min，培養5天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526發酵液。以上納塔爾鏈霉菌4.3526的發酵培養基配方為：葡萄糖45g，酵母浸出粉2g，牛肉膏10g，蒸餾水1L，pH為7.2。
(4)納他霉素的提取
采用甲醇提取的方法，以及離心的方法提取納塔爾鏈霉菌發酵液中的納他霉素。具體是：甲醇與發酵液以體積比9:1的比例混合后，搖床搖瓶2h后離心，離心轉速10000r/min，10min，取上清液用0.22um濾膜過濾，得到濾液，最后用HPLC法測定濾液中的納他霉素含量，產量為0.98g/L。
實施例1
一種提高納他霉素產量的發酵方法，具體步驟如下：
(1)菌體活化培養
將納塔爾鏈霉菌4.3526培養于固體斜面培養基上，在28℃下培養7天，可得到納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株，保藏于4℃下備用。此固體斜面培養基配方為：蒸餾水100mL，葡萄糖2g，瓊脂2g，番茄漿2g，燕麥2g，pH值自然。
(2)搖瓶種子培養
將步驟(1)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株用接種環取2環接種于液體種子培養基中，在28℃，搖床轉速為180r/min的條件下培養2天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526種子液，備用。以上納塔爾鏈霉菌的種子培養基配方為：葡萄糖10g，胰蛋白胨5g，氯化鈉10g，麥芽浸粉5g，蒸餾水1L，pH為7.2。
(3)發酵
將步驟(2)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526種子液以6％的接種量接種到發酵培養基中，培養條件為28℃，搖床轉速為180r/min，培養5天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526發酵液。
在發酵開始前，每升發酵培養基中加入80g HPD450大孔樹脂，之后進行發酵；在納塔爾鏈霉菌4.3526發酵過程中，在發酵20h時，往發酵液中添加大豆油，大豆油的添加量為40mL/L(指的是每升發酵液中添加40mL的大豆油)；在發酵24h時，以流加的方式加入纈氨酸和蘇氨酸，纈氨酸和蘇氨酸的添加量均為0.5g/L(指的是每升發酵液中添加0.5g/L的纈氨酸和0.5g/L蘇氨酸)。
以上納塔爾鏈霉菌的發酵培養基配方為：葡萄糖45g，酵母浸出粉2g，牛肉膏10g，蒸餾水1L，pH為7.2。
(4)納他霉素的提取
采用甲醇提取的方法，以及離心的方法提取納塔爾鏈霉菌發酵液中的納他霉素。具體是：甲醇與發酵液以體積比9:1的比例混合后，搖床搖瓶2h后離心，離心轉速10000r/min，10min，取上清液用0.22um濾膜過濾，得到濾液，最后用HPLC法測定濾液中的納他霉素含量，產量為3.32g/L，與對比例1相比，納他霉素的產量提高了338.8％。
實施例2
一種提高納他霉素產量的發酵方法，具體步驟如下：
(1)菌體活化培養
將納塔爾鏈霉菌4.3526培養于固體斜面培養基上，在30℃下培養3天，可得到納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株，保藏于4℃以下備用。此固體斜面培養基配方為：蒸餾水100mL，葡萄糖1g，瓊脂1.5g，番茄漿1.5g，燕麥2.5g，pH值自然。
(2)搖瓶種子培養
將步驟(1)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株用接種環取2環接種于液體種子培養基中，在30℃，搖床轉速為180r/min的條件下培養2.5天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526種子液，備用。以上納塔爾鏈霉菌4.3526的液體種子培養基配方為：葡萄糖8g，胰蛋白胨2g，氯化鈉6g，麥芽浸粉3g，蒸餾水1L，pH為7.5。
(3)發酵
將步驟(2)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526種子液以8％的接種量接種到發酵培養基中，培養條件為30℃，搖床轉速為160r/min，培養3天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526發酵液。
在發酵開始前，每升發酵培養基中加入85g HPD450大孔吸附樹脂，之后進行發酵；在納塔爾鏈霉菌4.3526發酵過程中，在發酵12h時，往發酵液中添加大豆油，大豆油的添加量為45mL/L(指的是每升發酵液中添加45mL的大豆油)；在發酵24h時，以流加的方式加入纈氨酸和蘇氨酸，纈氨酸和蘇氨酸的添加量分別為0.6g/L和0.4g/L(指的是每升發酵液中添加0.6g/L的纈氨酸和0.4g/L蘇氨酸)。
以上納塔爾鏈霉菌的發酵培養基配方為：葡萄糖30g，酵母浸出粉1g，牛肉膏5g，蒸餾水1L，pH為7.5。
(4)納他霉素的提取
采用甲醇提取的方法，以及離心的方法提取納塔爾鏈霉菌發酵液中的納他霉素。具體是：甲醇與發酵液以體積比10:1的比例混合后，搖床搖瓶2h后離心，離心轉速10000r/min，15min，取上清液用0.22um濾膜過濾，得到濾液，最后用HPLC法測定濾液中的納他霉素含量，產量為3.2g/L，與對比例1相比，納他霉素的產量提高了326.5％。
實施例3
一種提高納他霉素產量的發酵方法，具體步驟如下：
(1)菌體活化培養
將納塔爾鏈霉菌4.3526培養于固體斜面培養基上，在26℃下培養9天，可得到納塔爾鏈霉菌4.35264.3526斜面菌株，保藏于4℃下備用。此固體斜面培養基配方為：蒸餾水100mL，葡萄糖1.5g，瓊脂1.5g，番茄漿2.5g，燕麥3g，pH值自然。
(2)搖瓶種子培養
將步驟(1)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株用接種環取2環接種于液體種子培養基中，在26℃，搖床轉速為180r/min的條件下培養3天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526種子液，備用。以上納塔爾鏈霉菌的種子培養基配方為：葡萄糖9g，胰蛋白胨4g，氯化鈉8g，麥芽浸粉4g，蒸餾水1L，pH為7.0。
(3)發酵
將步驟(2)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526種子液以10％的接種量接種到發酵培養基中，培養條件為26℃，搖床轉速為200r/min，培養7天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526發酵液。
在發酵開始前，每升發酵培養基中加入100g HPD450大孔樹脂，之后進行發酵；在納塔爾鏈霉菌4.3526發酵過程中，在發酵24h時，往發酵液中添加大豆油，大豆油的添加量為50mL/L(指的是每升發酵液中添加50mL的大豆油)；在發酵48h時，以流加的方式加入纈氨酸和蘇氨酸，纈氨酸和蘇氨酸的添加量分別為0.7g/L和0.2g/L(指的是每升發酵液中添加0.7g/L的纈氨酸和0.2g/L蘇氨酸)。
以上納塔爾鏈霉菌的發酵培養基配方為：葡萄糖40g，酵母浸出粉3g，牛肉膏15g，蒸餾水1L，pH為7.0。
(4)納他霉素的提取
采用甲醇提取的方法，以及離心的方法提取納塔爾鏈霉菌發酵液中的納他霉素。具體是：甲醇與發酵液以體積比9：1的比例混合后，搖床搖瓶2h后離心，離心轉速10000r/min，20min，取上清液用0.22um濾膜過濾，得到濾液，最后用HPLC法測定濾液中的納他霉素含量，產量為3.95g/L，與對比例1相比，納他霉素的產量提高了403.1％。
以上所述實施例僅是為充分說明本發明而所舉的較佳的實施例，其保護范圍不限于此。本技術領域的技術人員在本發明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發明的保護范圍之內，本發明的保護范圍以權利要求書為準。