本發明涉及一種牛支原體培養基及其制備方法，確切講是一種其組分中包括有：PPLO肉湯、丙酮酸鈉、葡萄糖、新鮮酵母浸出液、馬血清、青霉素、酚紅、去離子水的牛支原體培養基及其制備方法。
背景技術：
牛支原體（Mycoplasma bovis,M.bovis）能夠引起牛肺炎、關節炎、乳房炎、角膜結膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產與不孕等多種疾病。該病原引起的疾病在全世界范圍流行并造成嚴重經濟損失。牛支原體是牛呼吸疾病綜合征的主要病因。我國自2008年首次從湖北省爆發壞死性肺炎肉牛身上分離到牛支原體以來，隨后在全國多個省市地區不斷有牛支原體病例的報道，現今牛支原體在我國已成普遍感染狀態，牛支原體也已經成為威脅我國養牛業的重要病原之一。
牛支原體病的防控需要綜合防控措施，疫苗免疫是預防控制牛支原體病發生的一個重要手段，而優質高效疫苗需要優質培養基作為支撐。目前牛支原體的培養基主要有牛心湯培養基、改良KM2培養基、改良Thiaucourt’s培養基等。現有技術培養基培養牛支原體存在培養時間較長、活菌滴度較低、繁殖能力較差等問題。此外，現有技術培養基中血清含量普遍在10%～20%之間，不僅增加了制苗成本，過量的血清制備的疫苗無疑增加了異源體對牛體的過敏應激反應，最終影響疫苗的免疫效果。單純降低現有技術培養基中血清含量會導致培養牛支原體抗原滴度低10～100倍左右，既達不到免疫所需抗原劑量，又需提高濃縮倍數，實際上增加了生產成本。
中國發明專利2011100012310公開一種豬肺炎支原體培養基及其制備方法，該專利的基礎培養基組成成分為：腦心浸液、乳清蛋白水解物、PPLO肉湯、酵母浸粉、示蛋白胨、硫代硫酸鈉、Hank’s液、丙酮酸鈉、0.1％酚紅溶液、青霉素和去離子水，以使用前加入140～200ml的健康馬血清，并需要再加入瓊脂。根據其公開的內容，用該專利的培養基培養的豬肺炎支原體培養基活菌滴度可達1×109CCU/ml～1×1010CCU/ml,并且具有支原體生長速度快、分離的敏感性強,制備方法工藝簡單，可操作性強，適合工業化大生產的特點。
中國發明專利申請2015100244778公開的一種山羊支原體山羊肺炎亞種體外培養基由：PPLO肉湯21g/L，葡萄糖2g/L，丙酮酸鈉2g/L，質量體積比25%的酵母浸液100ml/L，0.4%的酚紅0.18ml/L，滅活馬血清100mL/L，及水溶解的青霉素200IU/ml構成，其pH值為7.4～7.6。采用該培養基培養山羊支原體山羊肺炎亞種，56小時生長滴度可達到4×109ccu，在達到原有培養基生長滴度的同時，培養時間縮短10小時，同時可以降低培養基的成本。
但由于上述專利用于培養豬肺炎支原體和山羊支原體山羊肺炎亞種，培養牛支原體滴度均不高于109 CCU/ml；此外，上述專利所需用的馬血清量較大，馬血清含量均在10%及以上；因此，開發高效的牛支原體低血清培養基已成為牛支原體疫苗研究和生產中急需解決的重要問題。
技術實現要素：
本發明提供一種可克服現有技術不足的牛支原體低血清高效培養基，本發明另一目的是提供該培養基的制備方法。
本發明的這種牛支原體培養基由基礎培養基和輔助培養基混合構成，其中每升的培養基內的基礎培養基的組成為：
（1）PPLO肉湯 22.0～24.0g
（2）丙酮酸鈉 5.0～6.0g
（3）葡萄糖 6.0～8.0g
（4）質量濃度為1%的酚紅 2.0～2.5ml
（5）去離子水750 ml；
輔助培養基的組成為：
（6）質量濃度為25%的新鮮酵母浸出液 110～120ml
（7）質量濃度為3%的L-谷氨酰胺16～17 ml
（8）質量濃度為10%的L-半胱氨酸4.0～6.0 ml
（9）質量濃度為15%的水解乳蛋白 32.0～35.0 ml
（10）青霉素 (20萬IU/ml) 0.25 ml
（11）無菌馬血清50 ml
培養基的pH值為7.2～7.4。
本發明的牛支原體培養基制備方法為：將基礎培養基的組分逐一溶入750ml去離子水中，115℃高壓滅菌20min后晾至室溫備用；將輔助培養基的各組分分別經0.22 微米濾膜濾過除菌后充分混合；無菌條件下，將基礎培養基和輔助培養基混合，用滅菌水補齊定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去離子水）調pH值到7.2-7.4，充分搖勻，分裝，置4℃保存備用。
本發明的牛支原體低血清高效培養基培養牛支原體可在牛支原體疫苗抗原制備中的應用。
本發明的有益效果為：
本發明的牛支原體低血清高效培養基根據牛支原體的生長特性，通過對不同的碳源、氮源、蛋白質、無機鹽、膽固醇等諸多營養組分的組合進行篩選，同時對培養基的pH值、滲透壓、離子強度等進行了比較分析，研究出了適合培養牛支原體的低血清高效培養基。該培養基中PPLO肉湯是支原體生長基礎液；丙酮酸鈉可作為支原體培養中的替代碳源；培養基中的葡萄糖為牛支原體生長提供能量；通過添加新鮮酵母浸出液，為牛支原體生長提供所需的氮源、維生素及微量元素等營養成分；添加L-谷氨酰胺可促進微生物代謝、促進蛋白質合成；添加L-半胱氨酸和水解乳蛋白為牛支原體生長提供合適的氨基酸；通過添加少量馬血清，向牛支原體提供生長所需的膽固醇和必需的飽和或不飽和脂肪酸；通過添加青霉素可抑制雜菌生長，對支原體無抑制效果，可避免培養基污染和延長培養基保存時間；添加酚紅作為pH值指示劑，可判斷支原體的生長狀況。該培養基的配方中除基本成份外，在培養基中還添加了新鮮酵母浸出液、L-谷氨酰胺、L-半胱氨酸和水解乳蛋白，上述成分的添加既能減少血清用量，還明顯提高了牛支原體的活菌滴度；經反復實驗證實，未添加之前活菌滴度為108-109 CCU/ml，添加之后活菌滴度可達1010 CCU/ml。而本發明另一個優勢在于培養基中低血清含量，培養基中血清用量僅為5%，是現有技術培養基血清含量的1/2～1/4；用本發明方法制備的牛支原體半成品菌液滴度達1010 CCU/ml，活菌滴度明顯高于改良KM2培養基（107 CCU/ml）、牛心湯培養基（108 CCU/ml）和改良Thiaucourt’s培養基（108～109CCU/ml）。牛支原體低血清高效培養基大大減輕了疫苗中異源體血清對牛體的過敏應激反應，提高了生物安全，也提高了活菌菌液滴度，降低了生產成本，為牛支原體優質疫苗的研制奠定了基礎。
具體實施方式
實施例1：
1、本發明培養基的制備：
基礎培養基：
（1）PPLO肉湯22.0 g
（2）丙酮酸鈉5.0 g
（3）葡萄糖6.0 g
（4）質量濃度為1%的酚紅2.0 ml
（5）去離子水750ml。
115℃滅菌20min，待冷卻后，在無菌條件下加入下列輔助培養基成分，制成本發明培養基。
輔助培養基：
（6）質量濃度為25%的新鮮酵母浸出液110 ml
（7）質量濃度為3%的L-谷氨酰胺17.0 ml
（8）質量濃度為10%的L-半胱氨酸5.0 ml
（9）質量濃度為15%的水解乳蛋白 33.0 ml
（10）青霉素 (20萬IU/ml) 0.25ml
（11）無菌馬血清50 ml
將基礎培養基中（1）～（4）成分逐一溶入750ml去離子水（5）中，115℃高壓滅菌20min后晾至室溫備用。將輔助培養基的（6）～（11）成分分別經0.22 微米濾膜濾過除菌后充分混合；無菌條件下，將基礎培養基和輔助培養基混合，用滅菌水補齊定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去離子水）調pH值到7.2-7.4，充分搖勻，分裝，置4℃保存備用。
2、質量濃度為25%的新鮮酵母浸出液的制備方法為：
取鮮酵母500 g，加入去離子水2000 ml中，攪拌溶解，用濃鹽酸：去離子水以=1:1（體積比）調pH值至4.5-5.0，80℃水浴（瓶內溫度）30分鐘，3000 轉/分離心20分鐘，取上清液。將上清液用1 M NaOH（4 g溶于100 ml去離子水）調pH值至7.8-8.0，煮沸，置室溫放涼后用雙層濾紙過濾，再補去離子水至2000 ml，-20℃保存備用。
3、質量濃度為1%的酚紅溶液的配制：
稱取酚紅1.0 g，置玻璃研缽中，逐滴加入0.1M NaOH（0.4 g溶于10 ml去離子水），研磨至完全溶解。將溶解的酚紅吸入100 ml量瓶中，用去離子水小心洗下研缽中殘留酚紅液至量瓶中，最后補加去離子水至100 ml。
實施例2：
本發明培養基的制備：
基礎培養基：
（1）PPLO肉湯22.0 g
（2）丙酮酸鈉5.0 g
（3）葡萄糖8.0 g
（4）1%酚紅2.0 ml
（5）去離子水750ml。
115℃滅菌20min，待冷卻后，在無菌條件下加入下列輔助培養基成分，制成本發明培養基。
輔助培養基：
（6）25%新鮮酵母浸出液120 ml
（7）質量濃度為3%的L-谷氨酰胺17.0 ml
（8）質量濃度為10%的L-半胱氨酸5.0 ml
（9）質量濃度為15%水解乳蛋白33.0 ml
（10）青霉素 (20萬IU/ml) 0.25ml
（11）無菌馬血清50 ml
將基礎培養基中（1）～（4）成分逐一溶入750ml去離子水（5）中，115℃高壓滅菌20min后晾至室溫備用。將輔助培養基的（6）～（11）成分分別經0.22 微米濾膜濾過除菌后充分混合；無菌條件下，將基礎培養基和輔助培養基混合，用滅菌水補齊定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去離子水）調pH值到7.2-7.4，充分搖勻，分裝，置4℃保存備用。
對比試驗
應用本發明培養基、改良Thiaucourt’s培養基、牛心湯培養基和改良KM2培養基對牛支原體PG45株進行了比較試驗，試驗及結果如下。
一、培養基制備
1、本發明培養基的制備
基礎培養基：
（1）PPLO肉湯22.0 g
（2）丙酮酸鈉5.0 g
（3）葡萄糖6.0 g
（4）質量濃度為1%的酚紅2.5 ml
（5）去離子水750ml。
115℃滅菌20min，待冷卻后，在無菌條件下加入下列輔助培養基成分，制成本發明培養基。
輔助培養基：
（6）質量濃度為25%的新鮮酵母浸出液110 ml
（7）質量濃度為3%的L-谷氨酰胺16.7 ml
（8）質量濃度為10%的L-半胱氨酸5.0ml
（9）質量濃度為15%的水解乳蛋白 33.0 ml
（10）青霉素 (20萬IU/ml) 0.25ml
（11）無菌馬血清50 ml
將基礎培養基中（1）～（4）成分逐一溶入750ml去離子水（5）中，115℃高壓滅菌20min后晾至室溫備用。將輔助培養基的（6）～（11）成分分別經0.22 微米濾膜濾過除菌后充分混合；無菌條件下，將基礎培養基和輔助培養基混合，用滅菌水補齊定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去離子水）調pH值到7.2-7.4，充分搖勻，分裝，置4℃保存備用。
2、改良Thiaucourt’s培養基的配制
基礎液：
PPLO肉湯21.0 g
丙酮酸鈉2.0 g
葡萄糖1.0 g
0.4%酚紅4.5 ml
去離子水700ml。
115℃高壓滅菌20min。
培養基：
基礎液 700ml
25%新鮮酵母浸出液100 ml
青霉素（20萬IU/ml）1ml
10%醋酸鉈1 ml
無菌馬血清200 ml
混合后用滅菌的1M NaOH調pH值到7.4，經0.22 微米濾膜濾過除菌后分裝備用。
3、牛心湯培養基的配制
1％水解乳蛋白Hank’s液562.5 ml
牛心湯337.5 ml
25%新鮮酵母浸出液20 ml
青霉素（20萬IU/ml）1ml
1%酚紅2.5 ml
10%醋酸鉈1 ml
無菌馬血清100 ml
混合后用滅菌的1M NaOH調pH值到7.4，經0.22 微米濾膜濾過除菌后分裝備用。
4、改良KM2培養基的配制
MEM 5 g
葡萄糖0.4 g
丙酮酸鈉0.2 g
水解乳蛋白5.1 g
1%酚紅2.5 ml
25%新鮮酵母浸出液20 ml
青霉素（20萬IU/ml）1ml
10%醋酸鉈1 ml
無菌馬血清200 ml
混合，用去離子水定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH調pH值到7.4，經0.22 微米濾膜濾過除菌后分裝備用。
二、牛支原體的培養
將牛支原體PG45株（購自美國菌種保藏中心ATCC，編號ATCC 25523）分別接種本發明培養基（血清含量為5%）、牛心湯培養基（血清含量為10%）、改良Thiaucourt’s培養基（血清含量為20%）和改良KM2培養基（血清含量為20%），種子繼代復壯后，分別按10% (V/V) 的比例接種對應培養基，37℃恒溫培養，當培養基的顏色變黃、pH值由7.4 降至6.8～6.9 時，無菌取出培養物。
三、檢測
活菌滴度（CCU）測定。方法如下：取12支試管，每管加對應培養基4.5 ml，在第1管中加入0.5 ml生長良好的牛支原體培養物，用振蕩器充分混勻，換新的移液管，從第1管吸取0.5 ml加入到第2管中，依次進行10倍稀釋至第11管，第11管中棄去0.5 ml培養液；得到培養液的稀釋度分別為10-1-10-11，第12管為對應培養基對照。試驗管設3個重復。將試管置37℃恒溫培養箱中靜置培養，每天觀察顏色變化，連續觀察10天，發生顏色變化的最高稀釋度即為該培養物的活菌滴度，用顏色變化單位（CCU）表示。試驗重復3次。
四、試驗結果：
牛支原體接種4種培養基3次生長試驗CCU測定結果見表1。
經3次試驗結果顯示，在同樣條件下，使用本發明培養基培養牛支原體的生長時間為1天，改良Thiaucourt’s培養基培養牛支原體的生長時間為1天，牛心湯培養基和改良KM2培養基培養牛支原體的生長時間為2天；改良Thiaucourt’s培養基3次CCU測定結果為108～109CCU/ml，牛心湯培養基3次CCU測定結果均為108 CCU/ml，改良KM2培養基3次CCU測定結果均為107 CCU/ml。使用本發明培養基培養牛支原體，3次CCU測定結果均為1010 CCU/ml（表1），明顯高于現有技術培養基培養牛支原體的活菌滴度。結果說明，本發明的牛支原體培養基具有血清含量低、生長迅速和活菌滴度高的特點。