一種帶有氣室的藥物篩選生物芯片的使用方法與流程

本發明涉及一種新型藥物篩選的生物微分析芯片的使用方法，從使用上講，是一種運用在活細胞培養系統中的，一種新型帶有氣室的藥物篩選生物芯片的使用方法。

背景技術：

高通量藥物篩選是指以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統執行試驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗結果數據，以計算機對實驗數據進行分析處理，同一時間對數以千萬樣品檢測，并以相應的數據庫支持整體系運轉的技術體系。高通量藥物篩選體系在創新藥物篩選中是新藥開發研究的一個重要領域，已經被廣泛應用于候選化合物生物活性的篩選。高通量藥物篩選模型不僅可以用于發現新藥，也可用于藥物研究。但是傳統藥物篩選芯片不能實時觀測藥物作用下的細胞形態變化。解決此問題，需將藥物的添加、實驗細胞的培養、藥物效果的檢測等多個步驟集成到一塊芯片，實現藥物篩選的自動化分析，減少即時觀測的實驗時間和誤差。

為此，本發明一種帶有氣室的藥物篩選的生物微分析芯片及其使用方法，以解決上述問題。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種利用氣室設計活細胞培養的藥物篩選生物微分析芯片的使用方法，在一塊芯片上實現藥物的給樣、細胞培養、藥物效果檢測等多個實驗功能。

本實驗的技術方案為：提供一種帶有氣室的藥物篩選生物芯片的使用方法。芯片由兩組進樣口、兩個培養區、一個共用氣室、一個廢液池和彎曲連接通道組成。在芯片的上片加工有從氣體入口開始的，連通氣室通道、氣室、到氣體出口結束的結構，這些結構呈一條連接直線排布；對應上片這條連接直線的兩側，在下片對稱加工有兩組“V”型進樣通道、兩個培養區，對應上片這條連接直線上，在下片加工有廢液池、排出通道、出口。沿一條連接直線排布，以及沿這條直線對稱排布，可以很好地集約化利用芯片的空間，并且可以用發明的一種帶有氣室的藥物篩選生物芯片作為功能單元，連接組成不同形狀的、擴充實驗數目或功能的生物芯片。在芯片體的下片上加工有兩組進樣口，每組進樣口具有包括細胞及其培養液進口、或者藥物進口的“V”型進樣口一和“V”型進樣口二，進樣口與連接直通道相連。當藥物注入后，藥物與細胞樣品在“V”型通道處充分混合并作用于細胞。兩個培養區同時與氣室相連，氣室通過氣室與培養區連接的通氣道輸送細胞培養所需氣體并保證供給量相同。兩個培養區內部各有一個“U”型結構，當培養液和藥物到達時，“U”型結構可以將細胞攔截，保證細胞在固定的區域生長，而培養液和藥物等液體可以自由流通。一種帶有氣室的藥物篩選生物芯片的使用方法，特征在于。

第一步，清洗：先堵住氣體出口，在氣體入口通入高純氮氣0.5h-1h，氣體經氣室通道到達氣室，再經通氣道到兩個“V”型進樣口一和“V”型進樣口二，以及出口排出；隨后打開氣體出口，封堵兩個“V”型進樣口一和“V”型進樣口二，以及出口，繼續通入高純氮氣0.5h-1h，氣體由氣體出口14排出；氣體通入全部結束后，關閉氣體，封堵氣體入口和氣體出口；再用注射泵在芯片的兩個“V”型進樣口一和“V”型進樣口二通入三級去離子水，去離子水在出口用泵吸出；連續通入三級去離子水2h-3h。

第二步，實驗進樣：用注射泵在芯片內通入細胞培養液0.5h-2h，然后，依據藥物篩選的藥物和藥物對象的病理癌癥細胞，將生長狀態良好的癌癥細胞從培養皿中吹打均勻，通過注射泵，從“V”型進樣口一或“V”型進樣口二導入芯片的各個培養區，進行等量癌癥細胞培養；或者，從“V”型進樣口一加入實驗癌癥細胞，從“V”型進樣口二加入實驗藥物，導入芯片的各個培養區，進行等量癌癥細胞培養。打開氣體入口和氣體出口，按細胞培養規定，實時連續通入所需氣體；每24h通過注射泵和吸液泵更換一次細胞培養液；實驗癌癥細胞培養48h后，關閉芯片的細胞培養液供給。

第三步，給藥及篩選檢測：從“V”型進樣口一或“V”型進樣口二，依次注入濃度呈梯度變化的抗癌藥物培養液，藥物作用癌癥細胞后立即、或者24h后，用顯微鏡觀察培養區內的癌癥細胞；開啟高清攝像機或DVD，記錄細胞形態變化和繁殖情況。

第四步，實驗結束清洗：藥物篩選檢測實驗結束后，重復第一步的清洗步驟，清洗生物芯片。

進一步的，所述培養區，兩個培養區尺寸一致，均為深1mm-2mm、直徑2mm-5mm的圓桶形。這樣設計保證細胞培養區域的大小一致。氣室俯視為菱形，高度0.5mm，邊長≥2mm。這樣設計便于各個連接管的連接剛好在菱形的四個角上，避免氣室因有邊角，產生氣體渦流，不利于廢氣的排除。廢液池為長方體形，深為1mm-2mm、短邊長≥5mm。設計保證了廢液池至少能夠容納兩個培養區的一次產生的廢液。上述技術方案中，所述芯片的上片、下片、和芯片基底均為透明材料。廢液池俯視呈長方體形，與廢液的排出通道和氣體出口相連，它是將兩個培養區內細胞的代謝產物或者是多余的注射物質暫時儲存的空間，保證細胞的正常培養環境。

進一步的，所述培養區，在兩個培養區與廢液池相連的弧形通道二一側，與圓柱形培養區內壁相距5μm處，各加工有一個“U”型結構，“U”型結構是寬為30μm -60μm，等高于培養區的半圓弧形墻；所述弧形通道一和弧形通道二均為1/4圓弧形，并兩兩成對，對稱分布在上片連接直線的兩側。培養區內部的“U”型結構的功能，使細胞在固定的區域生長，便于實時觀測在不同藥物（或不同濃度的藥物）作用下細胞形態的變化情況。

進一步的，所述渦輪結構為兩個半圓錯位相對形成“S”形通道；渦輪結構位于2條“V”型通道匯流相交為1條通道的“V”字的底尖處，兩個半圓間隔距離為“V”型通道寬度的1/2，利于液體的混合。“V”型通道內嵌有混合通道內液體的渦輪結構，當藥物注入后與細胞樣品在“V”型通道處充分混合，保證藥物與細胞充分接觸并發生作用；或者同時加入兩種藥物，在“V”型通道處充分混合，保證藥物混合均勻。

上述技術方案中，所述下片加工的通道，全部高為800μm-1000μm，寬為300μm-600μm。通道尺寸是根據實驗所需細胞大小和數量確定的，目的保持實驗的同一性，也有利于不同細胞實驗的要求。

上述技術方案中，所述生物芯片分為3層，最上一層是上片，為進樣裝置及氣體通道，包括、氣體入口、氣室通道、通氣道、氣室、氣體出口，和貫通上片和中片的“V”型進樣口一、“V”型進樣口二、出口；中間一層是下片，主要為液體流通管道，包括“V”型通道、渦輪結構、直通道、弧形通道一、培養區、弧形通道二、廢液池、 “U”型結構；底層為芯片基底。本發明利用生物芯片，具有良好的細胞培養的基礎，通過結構的改進，將微流控技術與細胞培養技術相結合將其應用于藥物篩選領域。在一種芯片上提供了相同的細胞生長環境，在其他變量都不改變的條件下，單一改變給藥物種類或給藥量，通過觀察在藥物作用下的細胞形態變化，達到藥物篩選的目的。

本發明的效果特點：本發明芯片將藥物的添加、實驗細胞培養、藥物效果檢測等多個步驟集成到一塊芯片體上，可在有限的面積內檢測多個指標，達到即時、有效、微量檢測。能夠在檢測的時間段內進行實時監測，控制營養物質的輸入速率，保證檢測的可靠性，使得結果更能反應真實的細胞生長環境，達到最終藥物篩選目的。

附圖說明

圖1為本發明的俯視結構示意圖。

圖2為本發明的俯視結構示意圖A-A剖視圖。

圖3為局部“V”型連接通道中的混合渦輪結構放大圖。

其中：1.“V”型進樣口一；2.“V”型通道；3.氣體入口；4.氣室通道；5.渦輪結構；6.弧形通道一；7.培養區；8.通氣道；9.氣室；10.廢液池；11.排出通道；12.出口；13.芯片基底；14.氣體出口；15.弧形通道二；16.“U”型結構；17.“V”型進樣口二；18.直通道；

19.上片；20.下片。

具體實施方式

下面結合附圖1-3和實施例進一步對本發明加以說明。

具體實施例一

參照圖1的芯片形狀結構，芯片下片20的流體的通道高為800μm，寬為300μm。每個培養區7直徑5mm，中間有一個寬為60μm半圓弧形墻的“U”型結構16，其與圓柱形培養區7內壁相距5μm處。

操作步驟如下：

第一步，清洗：先堵住氣體出口14，在氣體入口3通入高純氮氣1h，氣體經氣室通道4到達氣室9，再經通氣道8到兩個“V”型進樣口一1和“V”型進樣口二17，以及出口12排出。隨后打開氣體出口14，封堵兩個“V”型進樣口一1和“V”型進樣口二17，以及出口12，繼續通入高純氮氣1h，氣體由氣體出口14排出。以達到清除芯片內雜質氣體的目的。氣體通入全部結束后，封堵氣體入口3和氣體出口14。再用注射泵在芯片的兩個“V”型進樣口一1和“V”型進樣口二17通入三級去離子水，去離子水通過渦輪結構5、弧形通道一6進入培養區7，繞過“U”型結構16、通過弧形通道二15進入廢液池10，繼續流入排出通道11，在出口12用泵吸出。連續通入三級去離子水3h，以排除芯片內殘余的物質。

第二步，實驗進樣：再用注射泵在芯片內通入細胞培養液2h，以排除芯片內殘留的三級去離子水；然后，依據藥物篩選的藥物和藥物對象的病理癌癥細胞，將生長狀態良好的癌癥細胞從培養皿中吹打均勻，通過注射泵，從“V”型進樣口一1或“V”型進樣口二17導入芯片的各個細胞培養區7，進行等量癌癥細胞培養；每24h通過注射泵更換一次細胞培養液，以保證細胞培養時的營養更新和代謝物的排除；芯片細胞培養48h后，關閉芯片的細胞及其培養液。

第三步，給藥及篩選檢測：從“V”型進樣口一1或“V”型進樣口二17依次注入濃度呈梯度變化的抗癌藥物培養液，藥物作用癌癥細胞24h后，用顯微鏡觀察培養區7內的癌癥細胞；開啟高清攝像機或DVD，記錄細胞形態變化和繁殖情況。

第四步，實驗結束清洗：藥物篩選檢測實驗結束后，重復第一步的清洗步驟，清洗生物芯片。

具體實施例二

參照圖1-圖3的芯片形狀結構，芯片下片20的流體的通道高為800μm，寬為300μm。每個培養區7直徑5mm，中間有一個寬為60μm半圓弧形墻的“U”型結構16，其與圓柱形培養區7內壁相距5μm處。

操作同具體實施例一，區別在于：第一步通入高純氮氣總計1h，連續通入三級去離子水2h。第二步通入細胞培養液0.5h。