本發明屬于煙草制品生物學效應評價技術領域，特別涉及一種檢測卷煙煙氣總粒相物對細胞活性氧分泌影響的方法。
背景技術：
隨著人們對健康的關注越來越高，對煙草產品提出了更高的要求，不但要有較好的口感，而且要盡可能的減少人體的不良感受。卷煙產品研發人員在煙油產品配方設計初期將不同組份按照不同比例組合調配，形成具有不同風格的初選配方，再結合化學評價和感官評價對配方進行不斷篩選調整形成最終的產品配方。然而初選配方數量眾多，全部進行感官評價耗時耗力，且感官評價側重于對產品的風格口感進行篩選，如何利用生物學測試指標對產品初選配方進篩選，以獲得降低人體不良感受的產品配方，目前尚屬探索階段，無統一的標準方法。
機體在遭受各種不利刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)產生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷。這種現象被稱為氧化性損傷，氧化性損傷是一種廣譜性損傷機制，活性氧是氧化性損傷的一種重要效應生物標志物，對其進行測定，可用于產品初選配方的進一步篩選，以獲得降低人體不良感受的產品配方。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種檢測卷煙煙氣總粒相物對細胞活性氧分泌影響的方法，為電子煙制品的安全性評估提供參考。
一種檢測卷煙煙氣總粒相物對細胞活性氧分泌影響的方法，包括以下步驟：
(1)受試物的前處理；
(2)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的制備；
(3)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算；
(4)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞接種；
(5)受試物的分組；
(6)受試物檢測劑量的設定；
(7)受試物培養品的制備；
(8)受試物的孵育；
(9)加入陽性對照物；
(10)裝載探針；
(11)樣品測定；
(12)活性氧水平計算。
本發明優選的實施方案中，上述的方法，包括以下具體步驟：
(1)受試物的前處理：參照中華人民共和國國家標準GB/T 19609-2004《卷煙用常規分析用吸煙機測定總粒相物和焦油》制備卷煙煙氣總粒相物樣品，樣品濃度為10mg/mL；
(2)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的制備：人肺成纖維細胞復蘇后，接種到細胞培養瓶中，置于37℃、5vt％CO2培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察培養細胞的匯合和形態情況，待細胞長至90％的匯合率時，移除培養瓶中的培養基，用磷酸緩沖液洗兩次，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約1-2min，用成纖維成纖維細胞培養基懸起，形成單細胞懸浮液；
(3)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的細胞濃度的計算：用血球計數板計數法對步驟(2)得到人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的活細胞數；
(4)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的細胞接種：將步驟(3)計數后的人肺成纖維細胞單細胞懸浮液加入成纖維細胞培養基稀釋至2.0×105個/mL，再按接種量為200μL/孔，接種到96孔細胞培養板中，將96孔細胞培養板置于37℃、5vt％CO2培養箱內培養24h；
(5)受試物的分組：將受試物分為四組：空白組、細胞對照組、陽性對照組和檢測樣品組；各組的構成為：空白組只加成纖維細胞培養基；細胞對照組為成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞；陽性對照組為在成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞并添加活性氧陽性對照物檢測樣品組為在成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞并添加受試物；每個檢測計量設4孔平行；
(6)受試物檢測劑量的設定：將受試物，即電子煙原液分為5個非零劑量：25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL；
(7)受試物培養品的制備：移除步驟(4)中96孔細胞培養板內的成纖維細胞培養基，再按步驟(5)進行分組，各組的構成為：空白組只加成纖維細胞培養基；細胞對照組加入成纖維細胞培養基；陽性對照組加入纖維細胞培養基+活性氧陽性對照物；檢測樣品組加入纖維細胞培養基+受試物，并使檢測樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設定的劑量；并且4組培養品用成纖維細胞培養基將每孔中的液體體積補足到200μl/孔；
(8)受試物的孵育：將步驟(7)加樣后的96孔細胞培養板置于37℃、5vt％CO2培養箱中孵育24h；
(9)加入陽性對照物：取4孔正常細胞，去除培養基，加入100μL濃度為50mg/mL的陽性對照物，將96孔細胞培養板置于37℃、5vt％CO2培養箱中孵育1h；
(10)裝載探針：除去步驟(8)和(9)細胞培養板中的細胞培養基，每孔加入終濃度為10μmol/L的2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽熒光探針100μL，37℃、5vt％CO2培養箱中孵育1h；
(11)樣品測定：除去步驟(10)細胞培養板中的液體，用磷酸鹽溶液緩沖液洗3次，去除未進入細胞內的2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽熒光探針，用熒光酶標儀于488nm激發波長下測定光度值；
(12)活性氧水平計算：根據(11)獲得的光度值，按照下列公式計算活性氧水平，以相對熒光強度表征：
X＝(Ftest-Fblank)/(Fcontrol-Fblank)
式中：
X——相對熒光強度；
Ftest——步驟(11)所得檢測樣品組多孔平均的光度值；
Fblank——步驟(11)所得空白組多孔平均的光度值；
Fcontrol——步驟(11)所得細胞對照組多孔平均的光度值。
本發明優選的實施方案中，步驟(9)中所述的陽性對照物為活性氧ROS上調的物質，本發明中的陽性對照物為Rosup陽性對照物，購買于市場。
本發明有益效果：
本發明對卷煙煙氣總粒相物對細胞活性氧分泌影響進行了綜合研究，確定了卷煙煙氣總粒相物的檢測劑量，檢測用細胞，制定了一種適用于檢測卷煙煙氣總粒相物對細胞活性氧分泌影響的方法。本發明對樣品的有效處理、檢測劑量的優化設定以及靶細胞的正確選擇，使得本方法能夠準確有效的檢測卷煙煙氣總粒相物對細胞活性氧水平影響的方法。
具體實施方式
下面將結合具體實例對本發明做詳細描述，但并不限制本發明。
本實施例針對2種國內市售卷煙的煙氣總粒相物對人肺成纖維細胞活性氧水平的影響測試。
(1)受試物的前處理：參照中華人民共和國國家標準GB/T 19609-2004《卷煙用常規分析用吸煙機測定總粒相物和焦油》制備卷煙煙氣總粒相物樣品，樣品濃度為10mg/mL；
(2)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的制備：人肺成纖維細胞復蘇后，接種到細胞培養瓶中，置于37℃、5vt％CO2培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察培養細胞的匯合和形態情況，待細胞長至90％的匯合率時，移除培養瓶中的培養基，用磷酸緩沖液洗兩次，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約2min，用成纖維成纖維細胞培養基懸起，形成單細胞懸浮液；
(3)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算：用血球計數板計數法對步驟(2)得到人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的活細胞數；
(4)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞接種：將步驟(3)計數后的人肺成纖維細胞單細胞懸浮液加入成纖維細胞培養基稀釋至2.0×105個/mL，再按接種量為200μL/孔，接種到96孔細胞培養板中，將96孔細胞培養板置于37℃、5vt％CO2培養箱內培養24h；
(5)受試物的分組：將受試物分為四組：空白組、細胞對照組、陽性對照組和檢測樣品組；各組的構成為：空白組只加成纖維細胞培養基；細胞對照組為成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞；陽性對照組為在成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞并添加活性氧陽性對照物檢測樣品組為在成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞并添加受試物；每個檢測計量設4孔平行；
(6)受試物檢測劑量的設定：將受試物，即電子煙原液分為5個非零劑量：25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL；
(7)受試物培養品的制備：移除步驟(4)中96孔細胞培養板內的成纖維細胞培養基，再按步驟(5)進行分組，各組的構成為：空白組只加成纖維細胞培養基；細胞對照組加入成纖維細胞培養基；陽性對照組加入纖維細胞培養基+活性氧陽性對照物；檢測樣品組加入纖維細胞培養基+受試物，并使檢測樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設定的劑量；并且4組培養品用成纖維細胞培養基將每孔中的液體體積補足到200μl/孔；
(8)受試物的孵育：將步驟(7)加樣后的96孔細胞培養板置于37℃、5vt％CO2培養箱中孵育24h；
(9)加入陽性對照物：取4孔正常細胞，去除培養基，加入100μL濃度為50mg/mL的陽性對照物，將96孔細胞培養板置于37℃、5vt％CO2培養箱中孵育1h；
(10)裝載探針：除去步驟(8)和(9)細胞培養板中的細胞培養基，每孔加入終濃度為10μmol/L的2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽熒光探針100μL，37℃、5vt％CO2培養箱中孵育1h；
(11)樣品測定：除去步驟(10)細胞培養板中的液體，用磷酸鹽溶液緩沖液洗3次，去除未進入細胞內的2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽熒光探針，用熒光酶標儀于488nm激發波長下測定光度值；
(12)活性氧水平計算：根據(11)獲得的光度值，按照下列公式計算活性氧水平，以相對熒光強度表征：
X＝(Ftest-Fblank)/(Fcontrol-Fblank)
式中：
X——相對熒光強度；
Ftest——步驟(11)所得檢測樣品組多孔平均的光度值；
Fblank——步驟(11)所得空白組多孔平均的光度值；
Fcontrol——步驟(11)所得細胞對照組多孔平均的光度值。
表1 2種卷煙的煙氣總粒相物對人肺成纖維細胞HPF活性氧水平的影響
由試驗結果可以看出，在本發明方法給出的樣品處理方法、檢測劑量條件下，樣品1#、2#在檢測劑量范圍內對HPF細胞活性氧水平存在影響，且有劑量效應關系，與0劑量組相比存在顯著差異(p<0.05)；樣品1#在檢測劑量范圍內與2#樣品相比存在顯著差異(p<0.05)；以上結果顯示，該方法能夠有效檢測不同卷煙產品的煙氣總粒相物對HPF細胞活性氧水平影響的差異。