細胞培養基和方法與流程

技術領域

本文提供了與新類型的細胞培養基、進料和補充物有關的組合物、方法和用途。所述培養基、進料和補充物具有幾種期望的性能，所述性能包括、但不限于：具有超過它們的正常溶解度限度的某些組分、增加的輻射耐受性、延長的釋放性能、高溶解度、增加的貯存期限和熱穩定性。在某些實施方案中，這樣的特征將改善用戶工作流和生物反應器生產力。

附圖說明

下文描述的且并入本說明書中和構成本說明書的一部分的以下附圖解釋了示例性實施方案，它們不應當視為限制本公開內容的范圍。

圖1顯示了為制備細胞培養基、進料和/或補充物組分的微米/納米混懸液而開發的新方法。

圖2顯示了微米混懸液和液體進料的細胞生長、蛋白生產和遞送的性能對比。微米混懸液在試驗的條件下的性能與液體進料相當，并表現出比液體進料更高的遞送效力。

圖3是包囊的微米混懸液珠子的示意圖，所述珠子被另外包被以延長釋放。

圖4顯示了PLGA包衣對延遲組分從微囊化的微米混懸液制品內的釋放的影響。a)上圖：無包衣；b)下圖：使用PLGA A和PLGA B的包衣的對比。A和B具有不同的丙交酯:乙交酯比率。具有85:15比率的PLGA B表現出良好的延長釋放性能，并維持它的形狀，具有在溶液中釋放組分>15天的能力。

圖5顯示了輻照對本公開內容的制品的影響。用以下物質培養的細胞中的蛋白生產效率的對比：i)輻照的微米混懸液；ii)干燥的、包囊的微米混懸液，其與iii)中的那些類似；iii)未輻照的對照液體進料，其通過過濾來滅菌。

圖6表明，當在輻照的試驗進料中培養細胞時，大約30kGy的輻照不會負面地影響(a)細胞生長(上圖)；或者，(b)蛋白生產(下圖)。還試驗了另外的補充物68和86，并且表現出類似的結果(數據未顯示)。

圖7表明，γ輻照對微米混懸液和對干燥的、包囊的微米混懸液存在可忽略的影響。該圖顯示了與未輻照的液體對照相比，在微膠囊(“珠子”)中或作為微米混懸液(MS)，30kGy的γ如何影響包囊的化合物(參見最右側)。NG＝沒有γ輻照,和G＝γ-輻照。

圖8顯示了包含不穩定組分的微囊化珠子的示意圖，所述不穩定組分被包埋和/或包裹在抗氧化劑中以通過減少在輻照過程中產生的氧化物質的影響來保護不穩定的分子。

圖9顯示了反應性物質的螯合作用以及痕量元素中的金屬離子與氨基酸的示例性配位絡合物的形成。

圖10顯示了制備微米混懸液和包囊的微米混懸液的方法的示意圖。

圖11顯示了輻照的、微囊化的珠子向生物反應器中的直接添加的2種選擇。左圖顯示了在可高壓滅菌的多孔金屬過濾器內添加的珠子；或者，右圖表明，可以將珠子直接加入培養物中。

圖12：在以下情況下，使用多孔金屬過濾器裝置引入培養物中的補充物的延長釋放的對比：(a)具有PLGA包衣的微米混懸液珠子：上圖，和(b)沒有珠子，僅AGT進料。

發明概述

在本公開內容中描述的培養基、進料和補充物組合物具有幾種期望的性能，所述性能包括、但不限于：(i)以“超濃縮”水平遞送某些組分的能力，所述“超濃縮”水平遠遠超過它們在培養系統中的正常溶解度限度，(ii)即使在輻射滅菌以后，增加的維持培養基/進料功能性的能力，(iii)增加的延長釋放內部組分的能力，(iv)高溶解度且快速的溶解，(v)干燥形式下的較長的貯存期限，(vi)增加的熱穩定性，(vii)多達8個log的減小的病毒污染風險，(viii)與其它滅菌技術(諸如UV、過濾和/或HTST巴氏消毒)相組合的能力，(ix)應用于多種培養基形式(諸如AGT、DPM、APM)以及具有較高濃度的不穩定組分的制劑的能力，(x)應用于多種產品類型(諸如培養基、進料、補充物、功能性添加劑等)的能力。由于這些特征，所述組合物可以直接加入生物反應器中或加入已經在進行中的培養物中，并由此可以改善用戶工作流和生物反應器生產力。

因此，在本公開內容中描述的組合物、方法和用途部分地涉及包含微米混懸液的細胞培養基、濃縮進料、功能性添加劑、補充物；還可以涉及包含一種或多種包囊的微米和/或納米混懸液的新細胞培養基、進料和/或補充物組合物；還可以涉及使用輻射將以上組合物滅菌，使得所述培養基/進料的功能性即使在暴露于輻射以后也得到維持。本公開內容也提供了制備這樣的培養基的方法，包括此類培養基的特征及其用途。貫穿本公開內容，有時可能僅提及細胞培養基，但是它在適用的情況下也包括進料和/或補充物。

在一個實施方案中，本公開內容涉及一種制備培養基、進料或補充物組合物的方法，所述方法包括：將最小體積的水溶液加入到培養基、進料或補充物的干粉中以制備糊狀物；和劇烈混合所述糊狀物以制備微米混懸液。

在另一個實施方案中，本公開內容涉及一種制備包含不穩定組分的組合物的方法，所述方法任選地包括：將有效量的抗氧化劑與所述不穩定組分的微米混懸液混合以形成混合物；將所述微米混懸液或步驟2中的混合物包囊在合適的囊材料中，使得形成微膠囊或珠子；和干燥所述微膠囊或珠子。在一個實施方案中，所述不穩定物質附著于樹枝狀聚合物。在這些實施方案的任一個中，所述囊材料可以選自，例如，海藻酸鹽、聚-L-乳酸、殼聚糖、瓊脂糖、明膠、透明質酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸類肝素、結冷膠、黃原膠、瓜爾膠、水溶性的纖維素衍生物和角叉菜膠。

在所述方法的另一個實施方案中，用延長所述不穩定組分從珠子的釋放的材料進一步包被珠子。在另一個方面，所述包衣選自，例如，聚乙醇酸、PLGA(聚乳酸-共-乙醇酸)、膠原、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚-ε-己內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚氨基酸、聚二甲基硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。

在一個實施方案中，輻照所述珠子，且在另一個實施方案中，用γ-射線輻照所述珠子。在某些實施方案中，另外用紫外射線輻照所述珠子，此后，所述珠子可以不具有PPV和MMV病毒。

在幾個實施方案中，所述培養基是干燥形式培養基，且要保護的不穩定組分選自：多胺、生長因子、細胞因子和維生素。

在某些實施方案中，所述囊材料在用水性溶劑重構后是可溶的。在其它實施方案中，所述包囊基質包裹樹枝狀聚合物-不穩定組分復合物。在某些實施方案中，所述樹枝狀聚合物是聚酰胺胺樹枝狀聚合物、聚丙烯亞胺樹枝狀聚合物或聚丙胺(POPAM)樹枝狀聚合物。

在以上實施方案中的任一個中，描述的方法可以例如實現關于培養基、進料、補充物或功能性添加劑的以下一項或多項：1)使它們更耐受輻照(例如，基于效力或功能性的保留而測量的)；2)增加在環境溫度下的穩定性；3)允許一些組分的延長釋放；4)增加在環境溫度下的運輸穩定性；5)增加對溫度波動的穩定性。

在以上方法中使用的組合物可以包含粉末狀細胞培養基，所述粉末狀細胞培養基還包含不穩定的化合物，和/或至少一種濃縮的組分。

本公開內容也涉及下述組合物：包含培養基/進料組分的微米混懸液的培養基、進料或補充物組合物。在一個實施方案中，所述培養基、進料或補充物組合物包含不穩定組分和抗氧化劑的混合物，所述混合物被微囊化在囊基質內成為珠子。在另一個實施方案中，所述囊材料選自，例如，海藻酸鹽、聚-L-乳酸、殼聚糖、瓊脂糖、明膠、透明質酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸類肝素、結冷膠、黃原膠、瓜爾膠、水溶性的纖維素衍生物和角叉菜膠。在另一個實施方案中，用包衣溶液包被所述珠子。在另一個實施方案中，所述包衣溶液選自：聚乙醇酸、PLGA(聚乳酸-共-乙醇酸)、膠原、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚-ε-己內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚氨基酸、聚二甲基硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-L-賴氨酸和聚鳥氨酸。

在另一個實施方案中，所述組合物還包含螯合的反應性物質。在該實施方案的另一個方面，所述反應性物質是陽離子、金屬離子或痕量元素。在另一個方面，所述螯合部分選自EDTA、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、環糊精、籠形化合物、樹枝狀聚合物和氨基酸。

在上述組合物中的任一種中，可以輻照所述組合物。在另一個方面，可以用γ-射線進行輻照；在一個具體的方面，所述γ-射線可以是約25-100kGy。在一個優選的方面，使用30-50kGy的γ-射線。在一個具體實施方案中，所述γ-射線是30kGy。本領域技術人員能夠確定這樣的輻照水平：其使目的(例如活病毒的減少或其它滅菌)最大化，同時使對例如培養基的功能性或培養基的特定組分的功能性的影響最小化(例如，通過對輻照或采用的任意滅菌技術特別敏感的組分而測量的)。

在本發明的一個方面，本文所述的方法可以與另外的步驟組合，所述另外的步驟的目的是測量所述培養基或組合物在滅菌以后(或在任意最終的加工或完工步驟以后)的功能參數。例如，在輻照以后，可以對樣品進行用于測量輻照對特定組分或組分集合的影響的功能測定。該步驟可以用于證實，例如，所述組合物適當地不含有病毒，并且所述培養基的組分保持在對于預期用途而言令人滿意的條件下。

在一個實施方案中，將上述的培養基、進料或補充物微米混懸液和/或包囊的微米混懸液組合物中的任一種無菌地直接加入到生物反應器中。在另一個實施方案中，將上述的培養基、進料或補充物微米混懸液和/或包囊的微米混懸液組合物中的任一種置于生物反應器內的、可高壓滅菌的多孔金屬圓筒中。

上述的培養基、進料或補充物中的任一種可以是無血清的、無蛋白的、或無血清和蛋白的。上述的培養基、進料或補充物中的任一種可以專門設計用于懸浮細胞培養、用于哺乳動物細胞培養、用于昆蟲細胞培養、用于雜交瘤細胞培養、用于干細胞培養、用于誘導的多能細胞培養、用于多能細胞培養、用于組織外植體和/或器官培養、用于在人工細胞基質上的三維細胞培養、以及本領域技術人員可以應用本公開內容中的教導的其它細胞和組織培養應用。

上述的培養基、進料或補充物中的任一種可以包含粉末狀細胞培養基，且在一個優選的實施方案中，所述粉末狀細胞培養基是AGT(高級造粒技術細胞培養基)。

上述的培養基、進料或補充物中的任一種可以用于生產干燥形式細胞培養基。

上述的培養基、進料或補充物中的任一種可以增加細胞培養基的貯存期限。

上述的培養基、進料或補充物中的任一種可以用于生產重組蛋白，用于生產疫苗，用于生產細胞(包括干細胞)，用于生產生物燃料，或用于生產營養物。

上述的培養基、進料或補充物中的任一種可以在環境溫度下儲存和操作，可以耐受溫度波動，可以耐受HTST和/或UHT巴氏消毒，可以耐受對滅菌輻射波長(諸如γ、紫外線和本領域已知的其它波長)的暴露。

發明詳述

現在將詳細參考不同的示例性實施方案。應當理解，提供下述詳細描述以給讀者提供本公開內容的一些方面的某些實施方案、特征和細節的更完整理解，并且所述詳細描述不應解釋為對本公開內容的范圍的限制。

定義

為了可以更容易地理解本公開內容，首先定義某些術語。其它定義在詳細描述中進行了闡述。

本申請中使用的術語“高級造粒技術”或AGT表示一種制備細胞培養基的方法，所述方法包括：將一種或多種水溶液噴灑在空氣懸浮的粉末狀培養基組分上，在敏感組分不會損失其效力的條件下溫和地快速蒸發水，從而產生附聚的顆粒和噴灑的成分在附聚的顆粒中的同質分布。在以下文獻中討論了造粒的粉末(AGT)：Fike等人,Cytotechnology,2006,36:33-39，和申請人的專利和/或專利申請：2002年5月7日授權的美國專利號6,383,810；2009年8月11日授權的美國專利號7,572,632；和2007年1月31日提交的美國專利申請號11/669,827，它們的公開內容特此通過引用整體并入。簡而言之，AGT培養基是干燥的粉末狀培養基，其由于諸如以下性能而在工業中是非常期望的：大顆粒尺寸、在處理時減小的細粉塵量、高可潤濕能力、在溶劑中的低溶解時間、自動pH和自動滲透壓維持等.

另一種類型的干粉形式是作為“高級粉末培養基”的APM粉末，其具有不像DPM粉末一樣細、且不像AGT顆粒一樣大的顆粒尺寸的有利性能。

本申請中使用的術語“敏感的化合物”或“敏感化合物”或“不穩定化合物”表示，要被保護免于降解或與存在于干燥形式培養基中的“反應性物質”反應的物質、化學試劑或化合物。在細胞培養基中的這樣的化合物的例子包括、但不限于：乙醇胺、維生素、細胞因子、生長因子、激素等。

術語“包囊劑”在本申請中有時可以被稱作“掩蔽劑”，且表示將細胞培養基或進料中的敏感的化學物質或組分包囊、保護、分離或隔離，遠離增強降解的條件或與其它反應性化學物質諸如氨基酸、痕量金屬元素(諸如錳、銅等)、無機緩沖劑(諸如碳酸氫鈉和其它磷酸鈉)和有機緩沖劑(諸如MOPS、HEPES、PIPES等)(它們可以與敏感化合物緩慢地反應，由此使得不穩定組分隨時間過去喪失其期望的性能)的反應性。可替代地，可以進行包囊、保護、分離或隔離，以保護敏感的化學試劑或組分免于物理損傷(例如，輻射損傷或熱損傷)或物理應激，免于暴露于水分/凝結，或免于脫水等。術語“保護”或“分離”或“隔離”或“包囊”在本公開內容中可以互換使用，并表達保護敏感的化學試劑或化合物免于降解條件或化學物質的概念。“可溶的掩蔽劑”本身在用水性介質重構以后可以是可溶的，由此它釋放出“敏感的”被包囊的材料。或者，“不溶性的掩蔽劑”在用水性介質重構以后可以是不溶性的，由此在釋放出“敏感的”被包囊的材料以后，它可以通過諸如過濾、傾析等方式從重構的終產物中回收。

可以用于微囊化的基質的例子包括、但不限于：海藻酸鹽、聚-L-乳酸(PLL)、殼聚糖、瓊脂糖、明膠、透明質酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸類肝素、結冷膠、黃原膠、瓜爾膠、水溶性的纖維素衍生物、角叉菜膠諸如此類。

任選地，由于以下幾個原因之一，可以包被微膠囊：延長和緩慢地釋放微膠囊組分；保護不穩定組分免于任何類型的損傷，即輻射、熱、脫水等。包衣可以包括、但不限于：聚乙醇酸、PLGA(聚乳酸-共-乙醇酸)、膠原、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚-ε-己內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚氨基酸、聚二甲基硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮等。

不穩定的培養基或進料組分包括、但不限于：化合物諸如維生素，例如，硫胺素、B12；氨基酸如谷氨酰胺；多胺如乙醇胺；細胞因子；生長因子，等。

用于將培養基內的反應性分子螯合、滅活或封閉的試劑包括、但不限于：化合物諸如EDTA、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、環糊精、籠形化合物、樹枝狀聚合物、氨基酸等。

所述細胞培養基優選地是粉末狀細胞培養基。在一個實施方案中，所述粉末狀細胞培養基是高級造粒技術(AGT)細胞培養基。所述細胞培養基也表示進料、濃縮的補充物、濃縮的培養基，和在某些情況下，液體培養基(如果適用的話)。

本申請中使用的術語“細胞培養”或“培養”表示，將細胞維持在人工(例如，體外)環境中。但是，應當理解，術語“細胞培養”是通用詞，且可以用于不僅包括單一原核(例如，細菌)或真核(例如，動物、植物和真菌)細胞的培養，而且包括組織、器官、器官系統或整個生物體的培養，對于此，術語“組織培養”、“器官培養”、“器官系統培養”或“器官型培養”有時可以與術語“細胞培養”互換使用。

在本申請中使用的術語“培養”表示，在有利于細胞的生長、分化或連續生存力(處于活躍或休眠狀態)的條件下，將細胞維持在人工環境中。因而，“培養”可以與“細胞培養”或上述的它的同義詞中的任一個互換使用。

在本申請中使用的術語“細胞培養基”、“培養介質”或“培養基”(和在每種情況下的復數形式)表示支持細胞的培養和/或生長的有營養的組合物。所述細胞培養基可以是完全制劑(即，無需補充即可培養細胞的細胞培養基)，可以是不完全制劑(即，需要補充的細胞培養基)，或可以是可補充不完全制劑的培養基，或者在完全制劑的情況下，可以改善培養或培養結果。除非上下文中另外指出，否則術語“細胞培養基”、“培養介質”或“培養基”(和在每種情況下的復數形式)表示尚未與細胞一起溫育的未調節的細胞培養基。這樣，術語“細胞培養基”、“培養介質”或“培養基”(和在每種情況下的復數形式)區別于“用完的”或“經調節的”培養基，后者可以含有培養基的許多原始組分、以及多種細胞代謝物和分泌的蛋白。

在本申請中使用的術語“粉末”或“粉末狀”表示以顆粒形式存在的組合物，其可以與或未與溶劑(諸如水或血清)形成復合物或附聚物。術語“干粉”可以與術語“粉末”互換使用；但是，本文中使用的“干粉”僅表示造粒材料的總外觀，無意表示所述材料完全不含有復合的或附聚的溶劑，除非另外指出。

“1X制劑”表示，含有在細胞培養基中發現的一些或所有處于工作濃度的成分的任意水溶液。“1X制劑”可以表示，例如，細胞培養基或該培養基的任意成分亞組。1X溶液中的成分的濃度與在用于體外維持或培養細胞的細胞培養制劑中發現的成分的濃度大約相同。用于體外培養細胞的細胞培養基被定義為1X制劑。當存在許多成分時，1X制劑中的每種成分的濃度大約等于細胞培養基中的那些成分的濃度。這些氨基酸的“1X制劑”大約含有相同濃度的溶液中的這些成分。因而，當提及“1X制劑”時，其意指溶液中的每種成分具有與在描述的細胞培養基中發現的相同或大約相同的濃度。細胞培養基的1X制劑中的成分的濃度是本領域普通技術人員眾所周知的。參見Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,42-50(Sadettin Ozturk和Wei-Shou Hu編,Taylor and Francis Group 2006)，其通過引用整體并入本文。但是，1X制劑中的滲透壓和/或pH可以不同于培養基，特別是當1X制劑中含有更少的成分時。

本公開內容涉及微米混懸液和干燥的微膠囊珠子，其中在微米/納米混懸液中濃縮相同成分的濃度，并且以干燥的包囊的珠子形式甚至進一步濃縮。因此，“7X制劑”意在表示這樣的濃度：其中在該微米/納米混懸液或包囊的珠子中的每種成分比對應的液體細胞培養基/進料或補充物中的相同成分濃縮了約7倍。“10X制劑”意在表示這樣的濃度：其中在該微米/納米混懸液或包囊的珠子中的每種成分比液體細胞培養基/進料或補充物中的相同成分濃縮了約10倍。易于理解，“5X制劑”、“25X制劑”、“50X制劑”、“100X制劑”、“500X制劑”和“1000X制劑”是指這樣的制劑：與1X細胞液體培養基、進料或補充物相比，其分別含有約5-25、25-50、50-70、70-100、100-500、500-1000倍濃度的成分。培養基制劑和濃縮溶液的滲透壓和pH也可以變化。制劑可以含有就特定細胞培養方案而言為1X的組分或成分，但是就不同的培養方案或不同的基礎培養基而言為例如2、2.5、5、6.7、9、12等倍(X)的濃度。

微米混懸液

通常將營養物進料、功能性添加劑或補充物提供為透明液體濃縮物或粉劑，所述粉劑被重構進透明液體濃縮物中用于直接遞送進生物反應器中。這意味著，其中的組分沒有超過它們的溶解度限度。如果將它們制成超過它們的溶解度限度，眾所周知，將形成沉淀物，作為絮片或細沉淀物，通常是在瓶子中的白色混濁。這些組分的沉降會在幾小時內發生，這意味著，濃縮的溶液不能用于遞送準確量的進料。

本公開內容提供了以濃縮的組分不會沉淀出來的方式制備培養基、進料和/或補充物組分的技術。這通過從具有一種或多種濃縮組分的干粉細胞培養基或進料制備微米混懸液和/或納米混懸液(也被稱作微米/納米混懸液)來實現。

微米/納米混懸液是在水性溶劑基質中的微米/納米尺寸的固體，在一個實施方案中，其不會隨時間分離。微米/納米混懸液例如提供了濃縮一種或多種培養基/進料組分超過該組分的溶解度限度的方式。微米/納米混懸液的一些期望的性能包括、但不限于：在最小體積中實現增加的營養物補充物濃度(例如，氨基酸)；微米/納米混懸液組分在水溶液中非常快速的溶解(與在沒有這樣的制品存在下的培養基溶解相比更快)；包囊能力(即用于包囊形式的組分的滅菌和保護)；將無菌的微米/納米混懸液珠子直接加入生物反應器中的現存培養物中的能力；增加在生物反應器中的效率和制備進程的能力。

已經在其它工業中(例如，在制藥或化妝品工業中)制備微米混懸液，通常使用2個方案：i)自頂向下方案，和ii)自底向上方案。在自頂向下方案中，通過研磨過程諸如碾磨機(用于精確顆粒尺寸減小的工業標準)，粉碎干粉的顆粒，直到得到微米混懸液，或通過濕磨法或通過使用微流態化儀來得到納米混懸液。在自底向上方案中，通過溫和操作參數如pH或聚合參數，使溶液內的組分逐漸沉淀出來，直到得到微米/或納米混懸液。這些方法不能用于制備本文所述的微米/或納米混懸液。鑒于在本文中使用的培養基和補充物的敏感性質，申請人認識到對用于制備培養基、進料的這些微米/或混懸液的新方法的需求。如在實施例1中和在圖1中所述，申請人從干燥的培養基、進料或補充物粉末開始，并通過向干粉中添加最小量的注射用水，將所述漿料劇烈混合成同質糊狀物，使得所有顆粒都被水相包被，形成微米/納米混懸液。本領域技術人員考慮到本文公開內容會知道，除了水以外的任意水性基質，例如，緩沖液、平衡鹽溶液、液體培養基或包含一種或多種培養基組分(包括氨基酸、脂質等)的任意溶液，可以加入到任意粉末狀制劑中以制備本公開內容中描述的微米/納米混懸液。技術人員還可以改進在建議的方案中使用的任意步驟或材料：例如，加入步驟的次序、混合步驟的次序和數目、液體的體積、混合時間、用于混合漿料至同質性的設備或裝置、培養基或進料制劑等，并且他們知道如何操作條件以適應期望的微米/納米混懸液的稠度和性質。

在一個實施方案中，使用本文描述的技術或所述技術的變體，可以將培養的細胞所需的任意結構或信息分子、任意營養物制備進微米/納米混懸液中。除了培養基和進料以外，結構和/或信息分子的例子可以包括、但不限于：維生素、氨基酸、肽、大分子、抗氧化劑、激素、生長因子、諸如此類。在某些實施方案中，可以制備與細胞營養物復合的細胞支架基質的微米/納米混懸液，以便使細胞在混懸液內三維地生長。

如上所述制備的微米/納米混懸液組合物可以用在許多應用中，例如，用在營養物補充中，以顯著增加組分濃度超過目標組分的溶解度水平，使得向反應器的添加體積是最小的；或者，如下所述，用于包囊微米混懸液，和制備干燥形式的包囊的珠子，其產生可以直接加入生物反應器中的“超濃縮的”補充物，這在以前尚未實現。

在一個實施方案中，微米混懸液可以從需要以濃縮形式提供于培養物中的任意組分的任意形式的干粉來制備，并且提供比在溶液中具有相同組分的等同液體濃縮物或進料高至少2-5倍、5-10倍、10-15倍、15-20倍、20-25倍、25-30倍、30-50倍、50-70倍、70-100倍濃度的微米混懸液組分。

微囊化

本公開內容提供了一種微囊化上述的微米/納米混懸液的方法，所述混懸液從干粉狀細胞培養基、進料、補充物或濃縮物制成。得到的包囊的產物在本公開內容中可以被稱作‘微膠囊’、‘包囊的珠子’、‘珠子’、‘膠囊劑’或‘微珠’。當將包囊的微米/納米混懸液干燥成珠子時，干燥步驟提供更大的包囊的微米/納米混懸液濃縮程度。微囊化可以如下完成：例如，將在復雜混合物諸如細胞培養基/進料中的敏感的或不穩定的組分“分隔”或隔離。因而，包囊可以產生更高濃度的某些進料組分(例如，氨基酸)，使得這些進料可以作為濃縮的高營養補充物而直接加入任意培養系統中，例如，加入補料分批培養物中。膠囊的進一步包被可以影響營養物向細胞培養物中的延遲釋放(在下面討論)。包囊可以通過以下方法實現：(a)用于在幾小時內“溫和釋放”一些或所有組分的微米混懸液和納米混懸液的標準微囊化過程；(b)替代性的珠子膠凝過程，以顯著延緩內部組分釋放。在實施例中和在圖3、4和8中可以找到延遲釋放的示例性論證。

在一個具體實施方案中，用于包囊或包埋不穩定組分的試劑是海藻酸鹽。海藻酸鹽微膠囊已經被用于許多目的，包括藥物遞送和在細胞培養物中生長的細胞的固定化(以增強細胞生長和生存力)。參見例如，Serp等人,Biotechnology and Bioengineering,2000,70(1):41-53；Breguet等人,Cytotechnology,2007,53:81-93；Chayosumrit等人,Biomaterials,2010,31:505-14；美國專利號7,482,152；和美國專利號7,740,861，它們都通過引用整體并入。

在申請人的共同未決的申請PCT/US2012/024194中也描述了包囊技術，該申請描述了將某些不穩定的、敏感的或易受影響的化合物(諸如乙醇胺、維生素、生長因子如胰島素等)捕集在囊材料(包括、但不限于，海藻酸鹽)中。

不希望受任何理論的約束，將敏感組分包囊或包埋在另一種分子內似乎會減少不穩定化合物與促進其降解或降低其穩定性的其它組分或條件的直接接觸。在申請人的共同未決的申請PCT/US2012/024194中描述了通過微囊化來制備用于減少乙醇胺降解的微膠囊的方法，該申請于2012年2月7日提交，其公開內容通過引用整體并入本文。盡管那些方法主要在乙醇胺穩定的背景下來舉例說明，但是可以使用/改進它們來穩定培養基、進料或補充物中的任何敏感的或不穩定的化學試劑或化合物。應當理解，其中描述的微囊化方法可以用于穩定細胞培養所需的任何敏感的化合物，包括、但不限于，維生素如硫胺素、B12等，不穩定的氨基酸諸如谷氨酰胺，細胞因子，生長因子，敏感的和有價值的蛋白或肽等，和用于增強被穩定的化合物的遞送，且可以應用于細胞培養基開發以外的領域。在本公開內容中，使包囊技術適用于微米/納米混懸液珠子，這需要改進幾個步驟和技術。例如，在PCT/US2012/024194申請中的敏感化合物的捕集步驟缺少幾個步驟。為了包囊微米混懸液，將囊材料(諸如海藻酸鹽)與微米混懸液混合和摻合。然后將該混合物抽吸進分配裝置(諸如移液器或滴管)中，并通過將所述混合物輕輕滴在不粘表面上(例如，石蠟膜上)來逐漸產生包囊的微米混懸液的微滴。然后，將交聯劑加入到滴中以形成珠子。將這些珠子干燥并真空干燥以除去水分，通常稱作“包囊的微米混懸液珠子”或僅稱作“珠子”。

本領域技術人員基于本發明的公開內容將知道，可以改進在建議的方案(參見實施例2)中使用的任意步驟或材料。例如，可以使用多種囊材料，或者可以使用多種滴遞送裝置，包括移液器、滴管、注射器或其任意改進，或者可以使用任意交聯劑，或者可以通過多種方式將珠子干燥或脫水至不同干度和/或硬度程度。本領域技術人員能夠確定用于即將到來的目的的適當的包囊劑，例如，海藻酸鹽、聚-L-乳酸(PLL)、殼聚糖、瓊脂糖、明膠、透明質酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸類肝素、結冷膠、黃原膠、瓜爾膠、水溶性的纖維素衍生物、角叉菜膠諸如此類。

微膠囊通常是具有2mm或更小直徑的球形顆粒，經常在0.05-1.5mm的直徑范圍內。通常，海藻酸鹽微膠囊通過聚陰離子海藻酸鹽與二價或三價多價陽離子(諸如氯化鈣)之間的交聯而形成。用于交聯的其它鹽可以是二價或三價陽離子，諸如氯化鎂、氯化鋇和硫酸鋁。

包囊具有幾個優點，其中的一些包括、但不限于：保護不穩定組分免于降解或免于不希望的反應；或者，延遲和/或延長包囊的組分在細胞培養物中的釋放時間，在一個實施方案中，保護是由于培養基的微囊化；或者，增加包含不穩定化合物的細胞培養基、進料和補充物在環境溫度下的穩定性和貯存期。可以將包囊的化合物干燥成珠子，然后可以將所述珠子與其它培養基組分摻合和/或混合。因此，微米/納米混懸液可以導致培養基/不穩定組分功能性的任何損失的1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或90-100％的減少，所述功能性可以使用本領域已知的技術(包括在本申請中公開的方法)通過包囊的不穩定組分或培養基組分的合適功能測定來測量。功能測定的例子可以是，包含微膠囊的培養基/進料組合物的隨天數增加細胞生存力的能力，或培養系統中的細胞數目，或重組蛋白生產，或表達的重組蛋白的量和/或功能的增加(例如，酶或受體功能測定，或可以在培養過程中評價包囊的不穩定組分如谷氨酰胺的穩定性等，如本領域技術人員已知的)。

在一個實施方案中，使用掩蔽劑(如海藻酸鹽)來包囊或包埋乙醇胺-樹枝狀聚合物復合物。樹枝狀聚合物是多分支的合成大分子，其可以使用受控連續過程來制備，以給它們提供確定的結構和分子量特征；綜述見：Astruc等人,Chem.Rev.2010,110:1857-1959，其特此通過引用整體并入。樹枝狀聚合物也可以用于制備本發明的包囊的微米混懸液。在另一個實施方案中，在PCT/US2012/024194描述的方法中使用的樹枝狀聚合物是聚酰胺胺，且它可以經改進用在包囊的微米/納米混懸液中。可以在本申請描述的方法中使用的其它樹枝狀聚合物包括、但不限于：聚丙烯亞胺(PPI)樹枝狀聚合物、磷樹枝狀聚合物、聚賴氨酸樹枝狀聚合物、聚丙胺(POPAM)樹枝狀聚合物、聚乙烯亞胺樹枝狀聚合物、蝶烯樹枝狀聚合物、脂族聚(醚)樹枝狀聚合物或芳族聚醚樹枝狀聚合物。

在一個實施方案中，微囊化的微米/納米混懸液可以制備用于需要以濃縮形式提供于培養物中的任意組分，并且提供比在溶液中具有相同組分的等同液體濃縮物或進料高至少2-5倍、5-10倍、10-15倍、15-20倍、20-25倍、25-30倍、30-50倍、50-70倍、70-100倍濃度的包囊的微米/納米混懸液的組分。在一個示例性實施方案中，如在圖中所見的，濃縮的進料制品的微米混懸液制品比它的對應液體進料濃縮了約7倍，而干燥的包囊形式的相同微米混懸液比它的對應液體進料濃縮了約10倍。

抗氧化劑

本公開內容還描述了，在包囊過程之前，可以將膠囊內的不穩定化合物進一步與一種或多種保護物質(諸如抗氧化劑)組合。因此，在某些實施方案中，在包囊之前，可以將抗氧化劑和粉末狀培養基、進料或補充物中的不穩定組分的混合物用作起始原料來制備微米混懸液制品。示例性的抗氧化劑包括、但不限于：維生素如抗壞血酸、β-胡蘿卜素、維生素A、E、番茄紅素、黃酮類化合物、硒等。在圖8中描繪了抗氧化劑對歸因于輻照的保護的影響。

在一個實施方案中，在微囊化之前由抗氧化劑引起的保護可以導致培養基/不穩定組分功能性的損失的1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或90-100％的減少，所述功能性可以通過不穩定組分或培養基組分的合適功能測定來測量。然后可以將干燥的微膠囊珠子摻合進其它培養基組分中和/或與其它培養基組分混合。

螯合作用

本公開內容還描述了螯合劑，其為將存在于培養基內的反應性分子螯合、滅活或封閉的試劑，所述反應性分子包括陽離子、金屬離子、痕量元素等。反應性分子會不利地與培養基中的不穩定化合物相互作用并降低它們的效力。通過螯合/絡合反應性化合物，化合物諸如EDTA、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、環糊精、籠形化合物、樹枝狀聚合物、氨基酸等將降低它們的反應性。另外，可以設計螯合物以保持分隔在包含不穩定化合物的微膠囊/珠子之外。在圖9中描述了螯合作用對不穩定化合物的保護的影響。

在一個實施方案中，在微膠囊外面由反應性組分和/或產生活性氧(ROS)的培養基/進料組分的螯合作用而引起的保護可以導致培養基/不穩定組分功能性的損失的1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或90-100％的減少，所述功能性可以通過不穩定組分或培養基組分的合適功能測定來測量。功能測定的例子可以是，包含微膠囊和螯合組分的培養基/進料組合物的隨天數增加細胞生存力的能力，或培養系統中的細胞數目，或重組蛋白生產，或表達的重組蛋白的量和/或功能的增加(例如，酶或受體功能測定，或可以在培養過程中評價包囊的不穩定組分如谷氨酰胺的穩定性等，如本領域技術人員已知的)。

延遲釋放

在一個實施方案中，任選地，可以用保護性包衣如PLGA進一步包被微膠囊，用于延遲釋放或延長釋放微膠囊內的組分。用于延遲釋放的典型培養基組分可以包括、但不限于：維生素、葡萄糖、氨基酸、生長因子或細胞因子。組分可以以相同速率從相同微膠囊內釋放，或以不同速率和在不同時間從不同微膠囊釋放，取決于延遲釋放制劑。這樣的雙形式延遲釋放培養基的一種示例性用途是，在培養早期釋放生長組分(例如，葡萄糖、氨基酸等)，隨后在進入培養的后對數期(post-log phase)以后釋放生產組分(例如，重組蛋白表達誘導物諸如半乳糖等)。這樣的培養基不需要用戶操作，因為雙形式培養基會照料必要組分的適時釋放。另一個實例是，維持2種或更多種組分分離直到指定的時間，此時由于特定目的而需要它們一起在培養物中反應。

可以施加可在微囊化以后用于包被的包衣溶液以提供另外的層，且其包括、但不限于：聚乙醇酸、PLGA(聚乳酸-共-乙醇酸)、膠原、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚-ε-己內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚氨基酸、聚二甲基硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-L-賴氨酸或聚鳥氨酸。可以進一步包囊形成珠子且在外面包被的包囊組分本身，使得可得到寬范圍的釋放選擇，這取決于周圍包衣和各個珠子包衣的包被特征。

所述額外的外包衣可以選自海藻酸鹽、聚-L-乳酸、殼聚糖、瓊脂糖、明膠、透明質酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸類肝素、結冷膠、黃原膠、瓜爾膠、水溶性的纖維素衍生物和角叉菜膠。在實施例中和在圖3、4和8中證實和討論了包衣的影響。在一個實施方案中，內部組分從微膠囊的延遲釋放可以導致包囊的組分在細胞培養系統中維持經歷6-24小時、24-48小時、48-72小時，經歷1天、2天、3-5天、5-10天、10-15天、15-20天、20-25天、25-30天、30-40天、40-50天，經歷培養持續時間。通過膠囊內的不穩定組分或培養基組分的合適限時釋放測定可以測量延遲釋放，并且還可以任選地包被以延長釋放。下面討論了一個示例性的限時釋放測定。功能測定的其它例子可以是，包含包被的微膠囊的培養基/進料組合物的隨天數增加細胞生存力的能力，或培養系統中的細胞數目，或重組蛋白生產，或表達的重組蛋白的量和/或功能的增加(例如，酶或受體功能測定，或可以在培養過程中評價包囊的不穩定組分如谷氨酰胺的穩定性等，如本領域技術人員已知的)。

除了典型培養基組分如維生素、葡萄糖、氨基酸、生長因子或細胞因子以外，還可以靶向以下細胞培養營養物/試劑以延遲釋放。它們包括、但不限于，用于促進細胞代謝(不論是為了生長還是產物合成和分泌)的所有化學物質或組合物，諸如葡萄糖和其它形式的己糖、氨基酸、鹽、肽、蛋白諸如膠原和蛋白級分、脂質、激素、維生素、核苷酸/核苷、痕量元素、核糖核苷酸/核糖核苷、血清、血清級分諸如牛白蛋白和血漿銅藍蛋白、以及不會直接代謝而是給培養物中的細胞提供細胞培養相關優點的其它組分，諸如不同類型的普流尼克(pluronic)諸如阻止細胞聚集的F68，纖連蛋白和肽序列諸如支持細胞附著的RGD和消泡劑。除了單一或多種單獨組分以外，可以在該延遲釋放方法中包括組分的混合物。粉末本身可以是細磨的或造粒的(AGT)形式。

用于檢測延遲釋放的示例性測定

釋放延遲的檢測包括：在一段時間內測定目標組分，和觀察隨時間的增加。典型CHO細胞營養補充物的一個實例是，測量葡萄糖。將含有葡萄糖的補充物加入水中，并抽取和保留T＝0樣品。然后，在以后的時間段(諸如在24、48、72小時)，可以抽取另外的樣品。如果在補充物中存在延遲釋放組分，那么將觀察到葡萄糖隨時間升高。一種用于測量葡萄糖的測定是測量葡萄糖氧化酶，其以試劑盒形式商購可得。這里的原理是，葡萄糖氧化酶與葡萄糖反應以產生葡糖酸和過氧化氫。過氧化氫與鄰-二茴香胺反應以產生氧化的鄰-二茴香胺，后者在暴露于硫酸后形成粉紅色顏色。這可以通過分光光度計法來讀出。用于葡萄糖測量或用于其它補充物組分(諸如氨基酸)的另一種測定是通過HPLC。該方法測量釋放組分隨時間的連續增加，這是延遲釋放的標志。

滅菌

在本公開內容中，不穩定的、敏感的或易受影響的化合物包括但不限于對物理、化學、輻射降解/破壞敏感的物質。典型的敏感的培養基物質可以是對與活性氧的化學相互作用敏感的，對金屬(包括痕量金屬)敏感的，對高溫、對輻照(γ、X-射線、紫外線、電離等)、對冷凍溫度、對凍融、對壓力、攪拌等敏感的。在該實施方案的另一個方面，可以將痕量元素或產生活性氧(ROS)的物質等螯合和/或保持在包含不穩定組分的微膠囊的外面。

本公開內容提供了一種在保護輻照不穩定組分(例如，通過抗氧化劑包被和/或隨后的包囊)的同時使用輻照將包含包囊組分的培養基滅菌的方法。滅菌性輻照包括諸如γ射線、紫外射線和其它電離輻射等光波長。使用的滅菌性γ輻照可以是5kGy至100kGy。在一個實施方案中，可以通過高達約50kGy的γ輻照將包含包囊組分的培養基滅菌，而不損失培養基或進料功能性，和/或具有病毒的約8-log的減少。這滿足>10e-⁸的豬細小病毒(PPV)和/或鼠細小病毒(MMV)的SAL(無菌度確保水平)。在某些實施方案中，可以通過大于50kGy直至100kGy的γ輻照的組合將包含包囊組分的培養基滅菌，而不損失培養基或進料功能性。

在某些實施方案中，觀察到約6-8log的SAL或病毒(如MMV和PPV)的減少。與其它滅菌技術(諸如紫外輻照)相組合，SAL的進一步減小是可能的，高達約8log的SAL，而不損失培養基或進料功能性。另外，可以如下將重構的培養基巴氏消毒：通過諸如HTST(高溫短時)或UHT(超高溫)等技術，和/或通過穿過0.1-0.2μm孔徑的抗病毒過濾器過濾，這可以提供病毒(諸如囊病毒、豬環狀構象病毒和在生物技術工業中造成問題的其它小的有包膜病毒)的進一步減少，而不損失培養基或進料的功能性。

由于它們的被滅菌的能力，且因為不存在培養基或進料功能性損失，因此，本公開內容的組合物適合于增強的細胞培養工作流，并提高了生物反應器生產力，因為它們可以在現存的細胞培養過程中直接加入生物反應器中。在某些實施方案中，添加物可以作為包囊的珠子，或在其它實施方案中，添加物可以作為微米/納米混懸液。另一個實例是，將無菌微膠囊直接加入生物反應器中，加入過濾水，混合，然后加入細胞。

可以以至少2種方式將微膠囊用于生物反應器中的營養補充：1)可以將無菌微膠囊直接加入生物反應器中，它們在其中以限時釋放方式釋放組分(右)，或2)可以將它們加入具有約0.22μ孔徑的多孔金屬圓筒、籠或任意類似的設備中，保持珠子免于接觸培養物中的細胞。對于選項1，珠子可能干擾過濾，或可能降低細胞計數或生產力。對于選項2，僅僅生物反應器攪拌足以使營養補充物從多孔金屬籠內部溶解和傳入生物反應器中。

細胞培養基

細胞培養基由許多成分組成，并且這些成分在各培養基之間不同。細胞培養基可以是完全制劑(即，無需補充即可培養細胞的細胞培養基)，可以是不完全制劑(即，需要補充的細胞培養基)，或可以是用于補充不完全制劑的培養基，或者在完全制劑的情況下，可以改善培養或培養結果。

通常，在重構后，細胞培養基具有溶解在溶劑中的溶質。所述溶質提供滲透力以平衡跨細胞膜(或細胞壁)的滲透壓。此外，所述溶質為細胞提供營養物。一些營養物是細胞工作的化學燃料；一些營養物可以是細胞用于合成代謝的原料；一些營養物可以是機器，例如促進細胞代謝的酶或載體；一些營養物可以是結合和緩沖細胞使用的成分的結合劑或是結合或鰲合有毒細胞產品的結合劑。

取決于細胞和細胞的預期用途，細胞培養基的成分最佳地以經過平衡從而優化細胞培養性能的濃度存在。根據一種或多種期望的特征，例如細胞數目、細胞質量、細胞密度、O₂消耗、培養成分(例如葡萄糖或核苷酸)的消耗、生物分子的生產、生物分子的分泌、廢物或副產物(例如代謝物)的形成、對指示劑或信號分子的活性等，測量性能。因此，優選地將每種成分或一些成分優化至用于預期目的的工作濃度。

通常使用基礎培養基來維持細胞培養，且基礎培養基可以含有許多成分，包括氨基酸、維生素、有機和無機鹽、糖和其它組分，每種成分以支持細胞體外培養的量存在。

本文描述的包含微米混懸液和/或包囊的微米混懸液的培養基可以是1X制劑，或者可以被濃縮為例如5X,10X,20X,50X,500X，或1000X培養基制劑。如果將各種培養基成分制備成單獨的濃縮溶液，則將適當(充足)量的每種濃縮物與稀釋劑組合以產生1X培養基制劑。通常，使用的稀釋劑是水，但可以使用其它溶液，包括水性緩沖液、鹽水溶液、或其它水性溶液。培養基可以是需要向其中添加另外的組分的基礎培養基，或可以是完全培養基，其不需要另外的添加劑并且能夠在重構后使細胞生長。

在一個實施方案中，從干粉重構的含有微米混懸液和/或包囊的微米混懸液的培養基產生自動-pH和/或自動-滲透壓的培養基/進料，因為，它已經平衡了緩沖劑濃度和/或鹽濃度，其有助于自動實現適合于培養某種細胞類型的期望的pH和滲透壓，而無需另外的pH或鹽濃度調節。

在另一個實施方案中，或在進一步的實施方案中，從干粉重構的含有微米混懸液和/或包囊的微米混懸液的培養基產生化學成分確定的細胞培養基。培養基蛋白的存在使得重組蛋白的純化是困難的、費時的、并且是昂貴的，并且還可以導致降低的產品收率和/或純度。因而，在一個實施方案中，所述細胞培養基是無血清的和無蛋白的，卻是完整的，使得它可以支持特定細胞類型的生長。可替代地，從干粉重構的培養基可以是無血清的，但是仍然含有源自一種或多種非動物衍生來源(無動物來源-AOF)如源自植物、酵母、藻類、真菌的蛋白，或源自重組來源例如細菌、真菌、植物、酵母、藻類等的蛋白，所述蛋白呈水解物的形式，或呈純化的蛋白或水解物級分的形式。在其它情況下，無血清培養基仍然可以含有一種或多種各種動物衍生的組分，包括白蛋白、胎球蛋白、各種激素和其它蛋白。在另一個實施方案中，所述培養基或培養基補充物不含蛋白，并且進一步，不含有脂質、水解物或生長因子。

本公開內容的培養基或補充物可以用于補料分批培養。細胞的補料分批培養通常被用于生物分子(例如蛋白)的工業生產，以增加細胞濃度和延長培養壽命，實現高產品濃度和體積生產力。補料分批培養涉及一種或多種營養物(例如葡萄糖)向基礎培養基中的受控添加。營養物如下幫助控制細胞培養物的生長：防止營養物耗盡或積累和副產物積累，由此將重要參數(例如滲透壓和CO₂濃度)維持在促進細胞生長或使細胞死亡最小化從而實現最佳產物表達的水平內。

細胞和病毒

如本文中所述的，含有微米混懸液和/或包囊的微米混懸液的培養基/進料還可以用于培養多種細胞。在一個實施方案中，所述培養基被用于培養真核細胞，包括植物或動物細胞，例如哺乳動物細胞、魚細胞、昆蟲細胞、藻細胞、兩棲動物細胞或鳥類細胞，或者用于生產病毒、病毒樣顆粒。

可以用本文描述的培養基/進料培養的哺乳動物細胞包括：原代上皮細胞(例如，角質形成細胞、宮頸上皮細胞、支氣管上皮細胞、氣管上皮細胞、腎上皮細胞和視網膜上皮細胞)和建立的細胞系及其品系(例如，293胚胎腎細胞、BHK細胞、HeLa宮頸上皮細胞和PER-C6視網膜細胞、MDBK(NBL-1)細胞、911細胞、CRFK細胞、MDCK細胞、CHO細胞、BeWo細胞、Chang細胞、Detroit 562細胞、HeLa 229細胞、HeLa S3細胞、Hep-2細胞、KB細胞、LS180細胞、LS174T細胞、NCI-H-548細胞、RPMI 2650細胞、SW-13細胞、T24細胞、WI-28VA13、2RA細胞、WISH細胞、BS-C-I細胞、LLC-MK2細胞、克隆M-3細胞、1-10細胞、RAG細胞、TCMK-1細胞、Y-1細胞、LLC-PK1細胞、PK(15)細胞、GH1細胞、GH3細胞、L2細胞、LLC-RC 256細胞、MH1C1細胞、XC細胞、MDOK細胞、VSW細胞和TH-I、B1細胞或其衍生物)、得自任意組織或器官(包括、但不限于心臟、肝、腎、結腸、腸、食管、胃、神經組織(腦、脊髓)、肺、血管組織(動脈、靜脈、毛細管)、淋巴組織(淋巴腺、腺樣體、扁桃體、骨髓和血液)、脾)的成纖維細胞，和成纖維細胞和成纖維細胞樣細胞系(例如，CHO細胞、TRG-2細胞、IMR-33細胞、Don細胞、GHK-21細胞、瓜氨酸血癥細胞、Dempsey細胞、Detroit 551細胞、Detroit 510細胞、Detroit 525細胞、Detroit 529細胞、Detroit 532細胞、Detroit 539細胞、Detroit 548細胞、Detroit 573細胞、HEL 299細胞、IMR-90細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、WI-26細胞、MiCl1細胞、CHO細胞、CV-1細胞、COS-1細胞、COS-3細胞、COS-7細胞、Vero細胞、DBS-FrhL-2細胞、BALB/3T3細胞、F9細胞、SV-T2細胞、M-MSV-BALB/3T3細胞、K-BALB細胞、BLO-11細胞、NOR-10細胞、C3H/IOTI/2細胞、HSDM1C3細胞、KLN2O5細胞、McCoy細胞、小鼠L細胞、2071品系(小鼠L)細胞、L-M品系(小鼠L)細胞、L-MTK-(小鼠L)細胞、NCTC克隆2472和2555、SCC-PSA1細胞、Swiss/3T3細胞、印度黃麂細胞、SIRC細胞、CII細胞和Jensen細胞或其衍生物)。

還可以在適合于生長和生物燃料生產的條件下在本公開內容的包含微米混懸液和/或包囊的微米混懸液的培養基組合物中培養真核細胞(包括藻細胞)以生產生物燃料。

由本文所述的培養基支持的細胞還可以衍生自任何動物，優選哺乳動物，并且更優選小鼠或人。根據本文中公開的方法培養的細胞可以是正常細胞、病變細胞、轉化細胞、突變細胞、體細胞、生殖細胞、干細胞、前體細胞或胚胎細胞，其中任一種可以是建立的細胞系或轉化的細胞系，或得自天然來源。可以將細胞用于實驗目的或用于生產有用的組分。

在一個實施方案中，將本文描述的培養基用于培養中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括重組CHO細胞或CHO-衍生的細胞系如CHOS、CHOK1、DG44、RevO等。術語CHO細胞包括描述的重組CHO細胞和所有CHO-衍生的細胞系。CHO細胞已經被歸類為衍生自中國倉鼠卵巢的上皮細胞和成纖維細胞。起始于中國倉鼠卵巢的細胞系(CHO-K1)(Kao,F.-T.和Puck,T.T.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 60:1275-1281(1968))已經被培養很多年，但是始終沒有證實其本質。由于細胞系具有許多優點諸如人樣糖基化模式、精確的翻譯后修飾和人類病毒傳播的低風險性，大部分生物制藥廠目前在CHO細胞中生產蛋白。

細胞的培養

根據研究人員確定的實驗條件，可以培養由本文描述的培養基支持的細胞。應當理解，本領域普通技術人員僅使用例行實驗就可以確定給定的動物細胞類型的最佳鋪展和培養條件。對于常規的單層培養條件而言，通過使用本文描述的細胞培養基，可以在沒有附著因子的情況下將細胞鋪展在培養容器的表面上。可替換地，所述容器可以用天然的、重組的或合成的附著因子或肽片段(例如，膠原、纖連蛋白、玻璃體結合蛋白、層粘連蛋白等，或其天然或合成片段)預涂布，它們可商業得自例如Life Technologies,Corp.(Carlsbad,CA R&D Systems,Inc.(Rochester,Minnesota),Genzyme(Cambridge,Massachusetts)和Sigma(St.Louis,Missouri)。還可以將細胞接種進天然或合成的三維支持基質(例如預制的膠原凝膠或合成的生物聚合材料)的內部或表面上。對于懸浮培養而言，通常將細胞懸浮于本文描述的培養基中，并引入促進細胞懸浮培養的培養容器中，例如旋轉燒瓶、灌注裝置或生物反應器。理想地，將培養基和懸浮的細胞的攪拌最小化，以避免在培養過程中培養基組分的變性和細胞的剪切。

可以針對使用的具體培養條件優化每個實驗條件的細胞接種密度。對于在塑料培養容器中的常規單層培養而言，1-5x 10⁵個細胞/cm²的初始接種密度是優選的，而對于懸浮培養而言，可以使用更高的接種密度(例如，5-20x 10⁵個細胞/cm²)。

通常在細胞培養箱中在約37℃下培養哺乳動物細胞。培養箱氣氛應當是濕潤的，并且應當含有在空氣中的約3-10％的二氧化碳，更優選在空氣中的約8-10％的二氧化碳，并且最優選在空氣中的約8％的二氧化碳，盡管某些細胞系的培養可能需要在空氣中高達20％的二氧化碳才能獲得最佳結果。培養基pH通常應該在約6.2-7.8的范圍內，優選約7.1-7.4，最優選約7.1-7.3。可以在不同條件(pH、溫度和/或二氧化碳)下培養細胞以增加蛋白生產。

當細胞達到約1.5-2.0x 106個細胞/ml的密度時，封閉培養物或分批培養物中的細胞應當經歷完全培養基交換(即，用新鮮培養基替換耗盡的培養基)。在灌注培養中(例如，在生物反應器或發酵罐中)的細胞將在連續再循環基礎上接受新鮮培養基。

病毒和疫苗生產

除了以懸浮培養或單層培養來培養細胞以外，本發明的培養基還可以用在從哺乳動物細胞生產病毒的方法中。這樣的方法包括：(a)在適合于促進病毒感染細胞的條件下，使細胞(例如哺乳動物細胞)與病毒接觸；和(b)在適合于促進細胞生產病毒的條件下，在本文描述的培養基中培養細胞。在培養基中培養細胞之前、期間或之后，可以使細胞與病毒接觸。用病毒感染哺乳動物細胞的最佳方法是本領域眾所周知的，并且是普通技術人員熟知的。可以預見到，與在本文描述的細胞培養基以外的細胞培養基中培養的細胞相比，在本文描述的培養基中培養的病毒感染的哺乳動物細胞生產更高的病毒滴度(例如，2、3、5、10、20、25、50、100、250、500或1000倍的更高滴度)。

這些方法可以用于生產多種哺乳動物病毒和病毒載體，包括、但不限于腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒等，并且最優選地用于生產腺病毒或腺伴隨病毒。在本文所述的培養基中培養受感染的細胞以后，可以將使用的含有病毒、病毒載體、病毒顆粒或其組分(蛋白和/或核酸(DNA和/或RNA))的培養基用于多種目的，包括疫苗生產、用于細胞轉染或基因治療的病毒載體的生產、動物或細胞培養物的感染、病毒蛋白和/或核酸的研究等。可替換地，根據本領域普通技術人員熟知的蛋白和/或核酸分離技術，可以任選地從使用的培養基中分離出病毒、病毒載體、病毒顆粒或其組分。

重組蛋白生產

本發明的培養基還可以用在從細胞(包括懸浮培養的真核細胞，但是優選哺乳動物細胞)和特別是從懸浮培養的哺乳動物細胞生產重組蛋白的方法中。根據本公開內容生產多肽的方法包括：在適合于細胞表達多肽的條件下，在本文描述的培養基中培養已經被遺傳工程改造以生產多肽的細胞(例如，哺乳動物細胞)。在遺傳上工程改造哺乳動物細胞以表達目標多肽的最佳方法是本領域眾所周知的，并且因此是普通技術人員熟知的。在本公開內容的培養基中培養之前，可以對細胞進行遺傳工程改造，或者在將細胞置于培養基中進行培養之后，可以用一種或多種外源核酸分子轉染細胞。根據上述的方法，可以在本發明的培養基中培養遺傳工程改造的細胞，作為單層培養物，或者更優選地作為懸浮培養物。培養細胞之后，根據本領域普通技術人員熟知的蛋白分離技術，可以任選地從細胞和/或使用的培養基中純化目標多肽。

實施例

實施例1：用于制備微米混懸液和/或納米混懸液的方法

本文提供了一種制備包含培養基組分的微米或納米混懸液的方法。該方法可以例如如下允許濃縮培養基和/或補充物超過溶解度：通過某些組分的微米混懸液(ms)和/或納米混懸液(ns)，和進一步，通過包囊微米混懸液(ms)和/或納米混懸液(ns)以形成珠子，隨后干燥包囊的珠子，進一步增加組分的濃度。

制備微米混懸液(參見圖1)

為了制備約7X濃度的培養基組分的微米混懸液(沒有磷酸鈉)：

1)將30g干燥形式的粉末狀培養基、補充物或進料(沒有磷酸鈉)稱量進研缽中。

2)加入7.5ml WFI(注射用水)。

3)使用綠色塑料柔軟刮勺，混合直到粉末被潤濕并開始“吸收”水和形成糊狀物。將糊狀物快速地徹底混合達到同質性，其為微米混懸液。

4)將1ml另外的WFI加入微米混懸液中并徹底混合。

5)將微米混懸液收集進容器中，并使用刮勺將最后量的微米混懸液“刮”入容器中用于遞送。體積為約29ml。

6)為了遞送，使用活塞-遞送裝置(例如；注射器型裝置)。

實施例2：在海藻酸鹽微膠囊中的微米混懸液和納米混懸液

微囊化可以提供在物理上分離或隔離不穩定組分(特別是與粉末狀細胞培養基中的反應性成分分離或隔離)的機制。作為例子，海藻酸鹽或任意其它包囊基質或囊材料可以用于微囊化。

制備包囊的微米混懸液的方法

為了制備包囊的微米混懸液(這是進一步濃縮培養基、補充物或進料的方式)：

1)制備沒有磷酸鈉的培養基、補充物或進料的微米混懸液(例如，如上所述)。

2)將13.5ml的6％海藻酸鹽加入微米混懸液中，并用刮勺徹底混合以摻合進海藻酸鹽中。體積等于約40.5ml。

3)切割石蠟膜圓以覆蓋4-側(培養基)聚丙烯一次性的稱量皿的底部。將石蠟膜放入稱量皿底部。

4)如下制備Eppendorf Repeater-Plus尖頭：用剪刀剪掉末端的約1/64”，確保切口不會遠至當充分壓縮時柱塞的末端的位置。

5)使用Eppendorf Repeater-Plus與設定在位置1(25μl)的2.5ml注射器，緩慢地將微米混懸液吸入注射器中。確保不會將空氣抽吸進注射器中，因為這會保留在粘稠的微米混懸液中和改變遞送的體積。

6)壓迫Eppendorf桿幾次以啟動(prime)注射器。在微米混懸液流出注射器末端以后，擦掉注射器的末端。然后將注射器末端保持垂直離石蠟膜表面幾mm，壓迫桿并保持在相同斑點約5秒，以允許所有25μl滴被遞送至石蠟膜表面。然后移動至鄰近位置并重復。繼續將微滴放在石蠟膜的整個表面上。在石蠟膜上靜置幾秒以后，海藻酸鹽-微米混懸液微滴將形成凸出的、球形的形狀。

7)為了交聯海藻酸鹽和形成水凝膠，將25ml的133g/L的氯化鈣(無水)溶液遞送進稱量皿中。可能必須使用鑷子將石蠟膜(和海藻酸鹽-微米混懸液微滴)保持在氯化鈣溶液表面下面，因為微滴會發生漂浮(如果Ca溶液在下面的話)。

8)將石蠟膜和海藻酸鹽-微米混懸液微滴在氯化鈣下面保持30秒。形成珠子。

9)30秒以后，使用鑷子抓住石蠟膜的一端，并抖動以松動和取下所有珠子。它幫助將石蠟膜倒置在稱量皿中并在氯化鈣中來回揮動。珠子將容易地脫離石蠟膜。

10)立即進行步驟11-18，因為在置于吸收面巾紙上(步驟16)之前，微米混懸液將在加工過程中緩慢地溶解。

11)立即將稱量皿對折并倒出氯化鈣溶液，小心地用狹窄末端將珠子保持在稱量皿內。

12)松握稱量皿，并立即加入(倒入)足夠的WFI以半填滿。

13)立即如之前對折稱量皿并倒出WFI。

14)松握稱量皿，并立即倒入足夠的WFI以半填滿。

15)立即如之前對折稱量皿并倒出WFI。

16)將每個稱量皿翻轉和倒在雙重面巾紙上以從珠子吸收盡可能多的水。

17)將面巾紙保持在稱量皿上面，并使用塑料白色柔性刮勺舀珠子。

18)使用2個白色塑料刮勺分離珠子，使得它們不會彼此接觸。

19)在通風櫥下面放置過夜。

20)次日早晨，將珠子放入真空干燥室中在CaSO₄上面。

21)干燥3天，然后取出，并從稱量皿表面取下珠子(它們輕微附著于此處)。將干凈的稱量盤倒置，并用于將珠子覆蓋在它們的稱量盤中。使一端輕微翹起，將白色柔性刮勺伸到稱量盤的表面上以取下珠子。取下全部珠子以后，放入新稱量盤中并放回到真空干燥室中在CaSO₄上面，保持另外4天以確保干度。

實施例3：微量培養基組分諸如維生素的包囊

如果包囊靶標是微量培養基組分諸如維生素，步驟I包括：將要包囊的組分的濃縮溶液直接混合進2％海藻酸鹽溶液中。所述溶液足夠濃，使得需要1％或更小體積的2％海藻酸鹽。不需要形成微米混懸液。然后將該海藻酸鹽-組分溶液作為25μl滴添加，直接落入133g/LCaCl₂溶液中，并保持30秒。

a)排出CaCl₂溶液的珠子，并迅速地沖洗2次。

b)分離珠子，并在平坦表面上干燥幾天，以確保<1％的含水量。

c)然后放在真空干燥器中在CaSO₄上面，保持幾天，直到珠子變脆和硬。

d)干燥的珠子即可用于進一步使用。

像將幾乎100％的營養補充物化學試劑加入生物反應器中一樣使用干燥的珠子。

實施例4：將延長釋放包衣施加于海藻酸鹽包囊的微米混懸液上的方法

由于無法獲得珠子包被設備，開發了一種替代方法。已發現，必須確保在珠子的延長釋放包衣層中絕對不存在孔或薄弱區域。由于手工添加的有機相的性質，不可能均勻地重復包被完整珠子。因此，開發了載玻片替代包被和試驗測定。

1)如上所述制備海藻酸鹽-微米混懸液。

2)使用Eppendorf移液器，將5μl海藻酸鹽-微米混懸液點在紅色環形玻片的透明玻璃圓形區域內。

3)立即使用塑料刮勺或其它柔性工具“平整”或弄平5μl海藻酸鹽-微米混懸液，以填充盡可能多的圓形玻璃透明區域(目的是盡可能地降低海藻酸鹽-微米混懸液的表面，以輔助隨后的PLGA包被：高的珠子不會起作用，因為它們在載玻片上向上凸起過高)。

4)將載玻片放入133g/L氯化鈣溶液中，保持約20-30秒。

5)通過浸入WFI中進行沖洗。

6)排出載玻片的WFI(使紙巾(tissue)觸及每個孔，以吸收多余的水)，并在通風櫥中干燥過夜。

7)然后放在真空中在CaSO₄上面干燥。

8)以25mg/0.6ml氯仿儲備PLGA。加入50μL在氯仿中的PLGA，以覆蓋紅色環形玻片中的孔。50μL體積將“填充”圓形孔區域和上面的珠子，以在孔上面產生凹陷的突起。該體積的PLGA-氯仿將容易地蒸發以在干燥的海藻酸鹽-微米混懸液上面形成扁平的接觸鏡樣覆蓋物。延遲：3層包衣>2層包衣>1層包衣。

9)在PLGA已經干燥以后，用于與不同的濃度和乙醇酸:乳酸比進行延長釋放對比。

在干燥的珠子上得到溶液(如PLGA)的均勻包衣是一項挑戰。使用多種方法進行了幾次嘗試。上面提供了起作用的方法，其從得到期望的包被水平的方法改進而成。例如，弄平珠子將提供對于延長釋放應用而言最佳的包被結果。為了達到最佳結果，必須優化幾個參數如包衣組分濃度、珠子大小、海藻酸鹽百分比、包被方法、干燥條件和干度水平、用于預包被的溶劑等。

實施例5：不同的PLGA濃度和乙醇酸:乳酸比的延長釋放對比：測定

1.將55ml PBS置于50ml離心管中。

2.添加相同PLGA組合物的一個載玻片，其覆蓋所有14個孔。在室溫水平地溫育。

3.針對葡萄糖測定了一個示例性的包囊的葡萄糖珠子，以研究不同比率的包衣材料組分(乙醇酸:乳酸比)的延長釋放性能。

4.對于在不同時間的取樣，我們進行了針對葡萄糖的Sigma葡萄糖氧化酶測定(Sigma Glucose Oxidase Assay，GAGO)：

a)將0.10ml樣品從50ml離心管移入10x75mm玻璃試管或1.5ml帶有橡膠塞的Wheaton玻璃化學分析瓶中。

b)將0.20ml試劑加入相同試管中，混合。

c)在37℃下溫育15min。

d)加入0.20ml 12N硫酸，混合。

e)對照：1:10稀釋1g/L葡萄糖溶液(0.1ml+0.9ml WFI，等于100ug/ml)；系列2倍稀釋(0.5ml葡萄糖+0.5ml WFI)至12.5ug/ml。對照是100、50、25和12.5ug/ml葡萄糖。也包括WFI空白。

f)作為指導，當來自所有14個孔的所有微米混懸液溶解時，需要將樣品1:4稀釋至在對照標準品的范圍內[施加的總葡萄糖應當是0.022g/載玻片，在14個孔中，pg 69NB 1138]。

為了讀取輸出結果，使用SpectraMax 384：在96孔托盤中的350μl樣品。透明壁或深色壁起相同作用，沒有差異。讀取540nm處的吸光度。

計算：[來自Sigma葡萄糖(GO)測定試劑盒，產品代碼GAGO-20]

mg葡萄糖＝(試驗的ΔA@540)(標準品中的mg葡萄糖*)

*4種稀釋度的最接近的標準品的濃度。

Δ是指試驗或標準品的OD讀數減去空白的讀數之間的差。

**將上面確定的mg葡萄糖乘以在樣品制備時使用的稀釋因子。

實施例6：多孔金屬圓筒

給多孔金屬圓筒填充海藻酸鹽包囊的微米混懸液的干燥珠子，并放在含有攪拌棒的1L燒杯內，以模擬在生物反應器內的條件。不存在用于延遲釋放的珠子的PLGA包衣。圖11中的圖表明，僅僅在生物反應器內攪拌就足以從珠子獲得營養補充物，并將其溶解和傳遞進“生物反應器”中。多孔金屬圓筒不需要泵送、管道等即可將補充物傳遞入細胞培養物中。事實上，其非常快速，在一個試驗實驗中，在單獨海藻酸鹽珠子(沒有PLGA包衣)中的補充物在約20小時內完全釋放出它的負載。即使當珠子是在多孔金屬內時，延長釋放也需要PLGA包衣。圖11的下圖表明，單獨的AGT粉末可以相對快速地穿過多孔金屬圓筒，但是單獨的AGT不會起延遲釋放的作用。要指出的一點是，可以將與生物反應器連接的多孔金屬圓筒高壓滅菌，可以在培養過程中的任意時間添加補充物珠子。

圖11顯示，可以以至少2種方式將延遲釋放的微膠囊用于生物反應器的營養補充：1)可以將無菌微膠囊直接加入生物反應器中，它們在其中以限時釋放方式釋放組分(右)，或2)可以將它們加入具有約0.22μ孔徑的多孔金屬圓筒中，保持珠子免于接觸培養物中的細胞。對于選項1，珠子可能干擾過濾，或可能降低細胞計數或生產力。對于選項2，僅僅生物反應器的攪拌就足以使營養補充物從多孔金屬籠內部溶解和傳入生物反應器中。

一些示例性實施方案

一種制備培養基、進料或補充物組合物的方法，所述方法包括：

將最小體積的水溶液加入到培養基、進料或補充物的干粉中以制備糊狀物；

劇烈混合所述糊狀物以制備微米混懸液。

一種制備培養基組合物的方法，其包括：

根據權利要求1制備培養基的微米混懸液；

任選地，將有效量的抗氧化劑與微米混懸液混合以形成混合物；

將所述微米混懸液或步驟2的混合物包囊在合適的囊材料中，使得形成微膠囊或珠子；

干燥所述微膠囊或珠子，

其中所述培養基包含不穩定物質。

根據權利要求2所述的方法，其中所述不穩定物質附著于樹枝狀聚合物。

根據權利要求2所述的方法，其中針對一種或多種選自以下的性能制備培養基：至少一種組分處于超濃度，增加的穩定性，增加的對輻射暴露的抗性，熱穩定性，延長的貯存期限，和不穩定組分的延長釋放。

根據權利要求2所述的方法，其中通過選自以下的測定，測定所述培養基組合物：測定包囊組分的延長釋放，測定熱穩定性，測定病毒數目的減少，測定輻照以后的功能性，測定延長的貯存期限，測定在運輸過程中的穩定性，和測定在環境溫度下的貯存。

根據權利要求2所述的方法，其中所述囊材料選自：海藻酸鹽、聚-L-乳酸、殼聚糖、瓊脂糖、明膠、透明質酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸類肝素、結冷膠、黃原膠、瓜爾膠、水溶性的纖維素衍生物和角叉菜膠。

根據權利要求2所述的方法，其中所述珠子用包衣進一步包被，所述包衣延長所述不穩定組分從所述珠子的釋放。

根據權利要求5所述的方法，其中所述包衣選自：聚乙醇酸、PLGA(聚乳酸-共-乙醇酸)、膠原、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚-ε-己內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚氨基酸、聚二甲基硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。

根據權利要求2所述的方法，其中輻照所述珠子。

根據權利要求8所述的方法，其中針對無菌度測定所述珠子。

根據權利要求4所述的方法，其中用γ-輻照來輻照所述珠子。

根據權利要求5所述的方法，其中另外用紫外射線輻照所述珠子。

根據權利要求5所述的方法，其中所述珠子不具有PPV和MMV病毒。

根據權利要求1或2所述的方法，其中所述組合物是干燥形式的培養基。

根據權利要求1或2所述的方法，其中所述不穩定組分選自：多胺、生長因子、細胞因子和維生素。

根據權利要求2所述的方法，其中所述囊材料在用水性溶劑重構后是可溶的。

根據權利要求3所述的方法，其中所述包囊基質包囊樹枝狀聚合物-不穩定組分復合物。

根據權利要求14所述的方法，其中所述樹枝狀聚合物是聚酰胺胺樹枝狀聚合物、聚丙烯亞胺樹枝狀聚合物或聚丙胺(POPAM)樹枝狀聚合物。

根據權利要求1-15中的任一項所述的方法，其中所述組合物包含含有一種或多種氨基酸的粉末狀細胞培養基。

一種培養基、進料或補充物組合物，其包含含有組分的微米混懸液。

一種培養基、進料或補充物組合物，其包含不穩定組分和抗氧化劑的混合物，所述混合物被囊基質微囊化為珠子。

根據權利要求18所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述囊材料選自：海藻酸鹽、聚-L-乳酸、殼聚糖、瓊脂糖、明膠、透明質酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸類肝素、結冷膠、黃原膠、瓜爾膠、水溶性的纖維素衍生物和角叉菜膠。

根據權利要求18所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述珠子被包衣溶液包被。

根據權利要求20所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述包衣溶液選自：聚乙醇酸、PLGA(聚乳酸-共-乙醇酸)、膠原、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚-ε-己內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚氨基酸、聚二甲基硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-L-賴氨酸和聚鳥氨酸。

根據權利要求18所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述組合物還包含螯合的反應性物質。

根據權利要求21所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述反應性物質是陽離子、金屬離子或痕量元素。

根據權利要求21所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述螯合部分選自：EDTA、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、環糊精、籠形化合物、樹枝狀聚合物和氨基酸。

根據權利要求17-23中的任一項所述的培養基、進料或補充物組合物，其中輻照所述組合物。

根據權利要求24所述的培養基、進料或補充物組合物，其中輻照是用γ-射線。

根據權利要求25所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述γ-射線為25-100kGy。

根據權利要求26所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述γ-射線為30-50kGy。

根據權利要求26所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述γ-射線為30kGy。

根據權利要求17-28中的任一項所述的培養基、進料或補充物組合物，其無菌地加入到生物反應器中。

根據權利要求17-29中的任一項所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述細胞培養基、進料或補充物是無蛋白的。

根據權利要求17-30中的任一項所述的培養基、進料或補充物組合物，其中用于所述微米混懸液的粉末狀細胞培養基是AGT(高級造粒技術細胞培養基)。

上述任一種組合物用于生產干燥形式的細胞培養基的用途。

上述任一種組合物用于增加細胞培養基的貯存期限的用途。

上述任一種組合物用于在環境溫度下儲存和操作的用途。

除非另有定義，在本文中使用的所有技術和科學術語具有本領域普通技術人員通常理解的相同含義。如果出現矛盾，以本說明書及其中的定義為準。相關領域的普通技術人員將容易明白，對本文描述的方法和應用的其它合適的修飾和修改是顯而易見的，并且可以做出這些修飾和修改而不偏離本公開內容或其任何實施方案的范圍。另外，所述的材料、方法和實施例僅僅是示例性的，無意成為限制性的。在本文中引用的所有專利、專利申請和公開的參考文獻特此通過引用整體并入。

本說明書還包括下列內容：

1.一種制備培養基、進料或補充物組合物的方法，所述方法包括：

將最小體積的水溶液加入到所述培養基、進料或補充物的干粉中以制備糊狀物；

劇烈混合所述糊狀物以制備微米混懸液。

2.一種制備培養基組合物的方法，所述方法包括：

根據實施方式1制備所述培養基的微米混懸液；

任選地，將有效量的抗氧化劑與所述微米混懸液混合以形成混合物；

將所述微米混懸液或步驟2的混合物包囊在合適的囊材料中，使得形成微膠囊或珠子；

干燥所述微膠囊或珠子，

其中所述培養基包含不穩定物質。

3.一種培養基、進料或補充物組合物，其包含含有組分的微米混懸液。

4.一種培養基、進料或補充物組合物，其包含不穩定組分和抗氧化劑的混合物，所述混合物被囊基質微囊化為珠子。

5.根據實施方式3所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述囊材料選自：海藻酸鹽、聚-L-乳酸、殼聚糖、瓊脂糖、明膠、透明質酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸類肝素、結冷膠、黃原膠、瓜爾膠、水溶性的纖維素衍生物和角叉菜膠。

6.根據實施方式5所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述珠子被包衣溶液包被。

7.根據實施方式6所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述包衣溶液選自：聚乙醇酸、PLGA(聚乳酸-共-乙醇酸)、膠原、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚-ε-己內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚氨基酸、聚二甲基硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-L-賴氨酸和聚鳥氨酸。

8.根據實施方式6所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述組合物還包含螯合的反應性物質。

9.根據實施方式8所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述反應性物質是陽離子、金屬離子或痕量元素。

10.根據實施方式8所述的培養基、進料或補充物組合物，其中螯合部分選自：EDTA、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、環糊精、籠形化合物、樹枝狀聚合物和氨基酸。

11.根據實施方式1-10中的任一項所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述組合物是被輻照的。

12.根據實施方式11所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述輻照是用γ-射線。

13.根據實施方式12所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述γ-射線為25-100kGy。

14.根據實施方式12所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述γ-射線為30-50kGy。

15.根據實施方式14所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述γ-射線為30kGy。

16.根據以上實施方式中的任一項所述的培養基、進料或補充物組合物，其無菌地加入到生物反應器中。

17.根據以上實施方式中的任一項所述的培養基、進料或補充物組合物，其中所述細胞培養基、進料或補充物是無蛋白的。

18.根據以上實施方式中的任一項所述的培養基、進料或補充物組合物，其中用于所述微米混懸液的粉末狀細胞培養基是AGT(高級造粒技術細胞培養基)。

19.上述任一種組合物用于生產干燥形式的細胞培養基的用途。

20.上述任一種組合物用于增加細胞培養基的貯存期限的用途。

21.上述任一種組合物用于在環境溫度下儲存和操作的用途。