引物組合物、其用途、構建文庫和確定核酸序列的方法與流程

本發明涉及生物醫學領域，具體的，本發明涉及引物組合物及其用途、構建待測樣品目標區域核酸測序文庫的方法、確定待測樣品目標區域核酸序列的方法、同時確定多個待測樣品的目標區域核酸序列的方法。
背景技術：
：免疫球蛋白、T細胞受體和HLA等是人類基因組中最活躍的分子，免疫大分子的多樣性使得機體能識別并清除無數的外來物質、清除體內產生的部分代謝物甚至凋亡或者衰老的細胞，且保持著機體免疫系統的平衡。免疫系統是機體抵御病原菌入侵與免疫調節的重要系統，對其研究具有很重要的意義。由于免疫大分子巨大的多樣性，使得對免疫大分子的研究充滿挑戰和困難。最近發展起來并持續受歡迎的免疫組庫技術被用于研究免疫組庫。免疫組庫即是指多樣性的免疫細胞在一個個體內某一時刻的總和，而這些總和反應了個體遺傳因素、抗原接觸史、周圍環境和個體的免疫調控。目前對免疫組庫的研究集中于B細胞受體可變區的序列和T細胞受體可變區的序列，主要通過在V基因骨架區和C區或J區的保守區區域設計引物富集目的序列，采用的方法包括多重PCR、arm-PCR和5’RACE，然后采用生物信息學的方法對目的序列進行序列長度，序列多樣性、序列異同性等多維度的分析。目前來說，若要研究這些巨大多樣性的區域，必須將這些區域從基因組或者totalRNA水平富集并分離出來。多重PCR方法是在上下游保守的位置設計多重引物富集目的片段，使用的循環數常常較高，而該富集過程中無法回避的一個問題就是多重引物在PCR過程由于每對引物擴增效率不一致而帶來的偏好性，使得富集的產物部分失真，與真實情況存在一定的差異，并且很難從生物信息學水平來矯正這部分的失真，因此需要采取方法降低多重引物PCR的循環數。目前的PCR擴增富集目標區域一方面需要在正反向引物之間增加一段外源序列來實現退火互補，循環次數多，后續測序時數據量增加，增加了測序成本，另外一方面還需借助高通量芯片等輔助設備進行PCR擴增。此外，現有技術只能在PCR富集時才能將文庫標簽加入樣品中，一旦實驗過程中出現樣品間相互污染，即無法識別被污染的樣品。技術實現要素：本發明的目的在于，通過不斷優化引物設計，PCR反應體系和PCR熱循環程序等，提出一種與現有引物及方法相比，能有效降低多重引物的偏好性，使得測序數據更精準，無需特定設備輔助即可進行PCR擴增富集目標區域的引物組，及使用所述引物組一步完成構建待測樣品目標區域核酸測序文庫的方法。因此，本發明一方面提供一種引物組合物，包含：第一引物組，所述第一引物組包含第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物包括目標區域特異性正向引物和第一接頭；所述第一反向引物包括目標區域特異性反向引物、反向文庫標簽和第二接頭，所述反向文庫標簽位于目標區域特異性反向引物5’端和第二接頭之間；第二引物組，所述第二引物組包含第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物包含第一退火，所述第二反向引物包含第二退火；所述第一接頭與所述第二正向引物中的第一退火相互退火互補，所述第一接頭與所述第二正向引物經PCR擴增后的產物包含第一完整測序接頭；所述第二接頭與所述第二反向引物中的第二退火相互退火互補，所述第二接頭與所述第二反向引物經PCR擴增后的產物包含第二完整測序接頭。本發明另一方面提供上述引物組合物，在免疫組庫研究中的用途。本發明另一方面還提供一種構建待測樣品目標區域核酸測序文庫的方法，包括采用上述引物組，對待測樣品包含目標區域的核酸樣本進行PCR擴增，以便獲得擴增產物，所述擴增產物構成所述待測樣品目標區域核酸測序文庫。本發明另一方面還提供一種確定待測樣品目標區域核酸序列的方法，包括以下步驟：采用上述構建待測樣品目標區域核酸測序文庫的方法，構建待測樣品的目標區域核酸測序文庫；對所述待測樣品的目標區域核酸測序文庫進行測序，以便獲得測序結果；以及基于所述測序結果，確定待測樣品目標區域核酸的序列。本發明另一方面還提供一種同時確定多個待測樣品的目標區域核酸序列的方法，包括以下步驟：針對所述多個待測樣品中的每一個，分別獨立地采用上述構建待測樣品目標區域核酸測序文庫的方法，構建待測樣品的目標區域核酸測序文庫，其中，所述多個待測樣品的正/反文庫標簽互不相同，所述多個為至少2個；將所述多個待測樣品的目標區域核酸測序文庫混合，以獲得混合文庫；對所述混合文庫進行測序，以獲得測序結果，所述測序結果包括所述多個待測樣品的目標區域核酸文庫序列和所述正/反文庫標簽；以及基于所述正/反文庫標簽對所述多個待測樣品的目標區域核酸測序文庫序列進行區分，并確定所述多個待測樣品的每一個的目標區域核酸序列。利用本發明設計的引物組合物無需添加任何外源序列作為PCR結合位置，而是直接使用測序平臺的接頭的全部或部分作為引物的退火互補區，提高了測序數據的有效率，使得測序結果更加精準，減少了測序成本，降低了數據分析的難度。并且通過第二正/反向引物對產物起到主要富集作用，第二正/反向引物為單一引物，不會引入擴增偏好，能夠有效降低多重引物的偏好性。此外本發明的構建文庫的方法與現有方法相比，在反轉錄時即給每個樣品加了樣品文庫標簽，避免了后續實驗過程中樣品間的相互污染。并且無需單管或高通量芯片等特定設備輔助PCR反應，使用普通的PCR設備即可完成產物的富集過程，操作簡單，成本低、減低樣品損失，效率高，循環次數少，耗時短，減少人為操作誤差，測序結果準確、可靠，可重復性好。附圖說明本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖1是本發明一實施例中第一反向引物對mRNA進行反轉錄的示意圖。圖2是本發明一實施例中第一正向引物和第二引物組對cDNA1st進行PCR的示意圖。圖3是本發明另一實施例中第一正向引物和第二引物組對cDNA1st進行PCR的示意圖。圖4是本發明一實施例中確定待測樣品目標區域核酸序列的方法的流程示意圖。圖5是本發明一實施例中同時確定多個待測樣品的目標區域核酸序列的方法的流程示意圖。具體實施方式下面詳細描述本發明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。需要說明的是，術語“第一”、“第二”、“第三”、“第四”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特征的數量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”、“第四”的特征可以明示或者隱含地包括一個或更多個該特征。進一步地，在本發明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。根據本發明的一個方面，本發明提供一種引物組合物，該引物組合物包含：第一引物組，所述第一引物組包含第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物包含目標區域特異性正向引物和第一接頭；所述第一反向引物包括目標區域特異性反向引物、反向文庫標簽和第二接頭，所述反向文庫標簽位于目標區域特異性反向引物5’端和第二接頭之間；第二引物組，所述第二引物組包含第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物包含第一退火，所述第二反向引物包含第二退火；所述第一接頭與所述第二正向引物中的第一退火相互退火互補，所述第一接頭與所述第二正向引物經PCR擴增后的產物包含第一完整測序接頭；所述第二接頭與所述第二反向引物中的第二退火相互退火互補，所述第二接頭與所述第二反向引物經PCR擴增后的產物包含第二完整測序接頭。根據本發明的實施例，利用本發明設計的引物組合物無需添加任何外源序列作為PCR結合位置，而是直接使用接頭中的全部或部分作為引物的退火互補區，提高了測序數據的有效率，使得測序結果更加精準，減少了測序成本，降低了數據分析的難度。并且通過第二正/反向引物對產物起到主要富集作用，第二正/反向引物為單一引物，不會引入擴增偏好，能夠有效降低多重引物的偏好性。根據本發明的實施例，所述第一正向引物還包括正向文庫標簽，所述正向文庫標簽位于目標區域特異性正向引物5’端和第一接頭之間。所述文庫標簽用于區分不同樣品文庫，能夠在進行PCR擴增后，將多個樣本的PCR產物進行混合測序，進而基于文庫標簽的不同，對各序列的樣本來源進行區分。例如index/barcode標簽，所述文庫標簽的長度為6～12bp。根據本發明的實施例，所述正/反文庫標簽可以相同也可以不同。優選的，正/反文庫標簽相同。根據本發明的實施例，所述第一接頭與所述第一退火可以相同也可以不同，優選的，所述第一接頭與第一退火相同。根據本發明的實施例，所述第二接頭與所述第二退火可以相同也可以不同，優選的，所述第二接頭與第二退火相同。根據本發明的實施例，所述第一退火和第二退火的長度均為16-25bp。根據本發明的實施例，所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含第一完整測序接頭。優選的，所述第二正向引物即為第一完整的測序接頭。根據本發明的實施例，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含第二完整測序接頭。優選的，所述第二反向引物即為第二完整的測序接頭。根據本發明的一個具體示例，所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含illumina測序平臺的P5測序接頭，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含illumina測序平臺的P7測序接頭。優選的，所述第一完整測序接頭為illumina測序平臺的P5測序接頭。所述第二完整測序接頭為illumina測序平臺的P7測序接頭。或者所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含illumina測序平臺的P7測序接頭，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含illumina測序平臺的P5測序接頭。優選的，所述第一完整測序接頭為illumina測序平臺的P7測序接頭，所述第二完整測序接頭為illumina測序平臺的P5測序接頭。根據本發明的一個具體示例，所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含IonTorrent/Proton測序平臺的P1測序接頭，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含IonTorrent/Proton測序平臺的A測序接頭。優選的，所述第一完整測序接頭為IonTorrent/Proton測序平臺的P1測序接頭，所述第二完整測序接頭為IonTorrent/Proton測序平臺的A測序接頭。根據本發明的一個具體示例，所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含454測序平臺的A測序接頭，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含454測序平臺的B測序接頭。優選的，所述第一完整測序接頭為454測序平臺的A測序接頭，所述第二完整測序接頭為454測序平臺的B測序接頭。根據本發明的一個具體示例，當所述第一正向引物不包含正向文庫標簽時，用于IonTorrentt/Proton測序平臺。根據本發明的一個具體示例，當所述第一正向引物包含正向文庫標簽時，用于illumina測序平臺或454測序平臺。根據本發明的實施例，所述目標區域特異性正向引物和所述目標區域特異性反向引物的長度為18-25bp。根據本發明的實施例，所述目標區域特異性正向引物包括B細胞受體或T細胞受體的V基因保守區的特異性引物，所述目標區域特異性反向引物包括B細胞受體或T細胞受體的C基因保守區的特異性引物。根據本發明的一個方面，本發明提供上述引物組合物在免疫組庫研究中的用途。根據本發明的另一方面，本發明提供一種構建待測樣品目標區域核酸測序文庫的方法，包括利用上述引物組，對待測樣品包含目標區域的核酸進行PCR擴增，以獲得擴增產物，所述擴增產物構成所述待測樣品目標區域核酸測序文庫。根據本發明的實施例，所述第一正向引物和第二正向引物的摩爾比為1:1～1:10，所述第一正向引物與第二正向引物之和與第二反向引物的摩爾比為1:1。根據本發明的實施例，所述PCR反應體系為：根據本發明的實施例，所述PCR反應程序為：采用本發明的引物組進行PCR擴增反應，僅需10～25個循環即可完成核酸樣本的富集，循環少，反應時間短，效率高。根據本發明的實施例，構建待測樣品目標區域核酸測序文庫的方法進一步包括以下步驟：(1)針對每一個目標區域，均設計適用于擴增所述目標區域核酸擴增的目標區域特異性正/反向引物，第一接頭和第二接頭、第二正向引物、第二反向引物和正/反文庫標簽，將目標區域特異性正/反向引物、第一接頭和第二接頭以及正/反文庫標簽，進行合成，得到第一正向引物和第一反向引物；本發明采用完整測序接頭的全部或部分作為第一正向引物和第二正向引物、第一反向引物和第二反向引物的退火互補區，無需引入外源序列，得到測序結果更加精準，減少了測序成本，降低了后續數據分析的難度。(2)將待測樣品的RNA、第一反向引物和cDNA合成試劑混合進行cDNA1st合成；現有技術需要在PCR時才能將文庫標簽加入樣品中，若實驗過程出現樣品間相互污染，即無法識別。而本發明在反轉錄時將樣本文庫標簽通過反轉錄引入cDNA1st，同時把第二反向引物的結合位點引入了cDNA1st中，后續PCR反應中只要使用第二反向引物就可以進行擴增反應。也即本發明在反轉錄時即將每個樣品加了樣本文庫標簽，避免了在后續實驗過程樣品間的相互污染。優選的，所述混合后在PCR管中進行PCR反應。優選的，所述待測樣品RNA為信使RNA(mRNA)。優選的，所述cDNA合成試劑包括脫氧核糖核苷三磷酸混合液(dNTPmi)、5x1鏈緩沖液(5×1ststrandbuffer)、二硫蘇糖醇(DTT)、RNA酶抑制劑(RNAseOUT)、反轉錄酶III(SuperScriptTMIII)、RNA酶混合物(RNasemix)。優選的，所述合成步驟包括：先將待測基因組RNA、第一反向引物以及dNTPmix混合，進行RNA變性；變性結束后，再加入5×1ststrandbuffer、DTT、RNAseOUT、SuperScriptTMIII，進行PCR反應，反應程序為50℃50min，70℃15min；PCR反應結束后，加入RNasemix，37℃孵育30min，得到cDNA1st。(3)將合成得到的cDNA1st與第一正向引物、第二引物組以及PCR反應試劑混合進行PCR擴增，所述第一正向引物和第二正向引物的摩爾比為1:1～1:10，所述第一正向引物與第二正向引物之和與第二反向引物的摩爾數為1:1。優選的，所述混合后在PCR管中進行PCR反應。優選的，所述PCR反應程序為：(4)PCR反應結束后，回收PCR產物，進行磁珠純化，按照PCR產物體積的0.8～1倍體積加入磁珠，純化產物即為核酸文庫。優選的，所述磁珠純化采用AMPureXPDNA純化試劑盒進行純化。本發明提供的構建待測樣品目標區域核酸測序文庫的方法，無需額外的測序接頭連接、連接產物純化的步驟，也無需單管或高通量芯片等特定設備輔助PCR反應，使用普通的PCR設備即可完成產物的富集過程，操作簡單，成本低、減低樣品損失，效率高，循環次數少，耗時短，減少人為操作誤差，測序結果準確、可靠，可重復性好。根據本發明的一些具體示例，本發明的構建待測樣品目標區域核酸測序文庫的方法還可以包括以下步驟：將合成得到的第一引物組進行預PCR擴增以及凝膠電泳檢測，以驗證第一引物組是否符合要求，其中以是否能擴增出符合設計大小的單一條帶為判定標準。根據本發明的一些具體示例，構建待測樣品目標區域核酸測序文庫的方法進一步包括以下步驟：將構建好的核酸文庫進行文庫質量檢測，可以使用例如Agilent2100Bioanalyzer或CaliperBioanalyzer，或ABIStepOnerPlusReal-TimePCRSystem進行質量濃度、片段大小分布和摩爾濃度的檢測。經檢測合格后，即可上機測序。根據本發明的另一方面，本發明還提供一種確定待測樣品目標區域核酸序列的方法。根據本發明的實施例，參照圖4，該方法包括以下步驟：S101：構建待測樣品的目標區域核酸測序文庫根據上述構建待測樣品目標區域核酸測序文庫的方法，構建待測樣品的目標區域核酸測序文庫。S102：對目標區域核酸測序文庫進行測序對所述待測樣品的目標區域核酸測序文庫進行測序，以便獲得測序結果。根據本發明的一些實施例，當所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含illumina測序平臺的P5測序接頭，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含illumina測序平臺的P7測序接頭時，利用Illumina測序平臺進行所述測序。或者當所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含illumina測序平臺的P7測序接頭，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含illumina測序平臺的P5測序接頭時，利用Illumina測序平臺進行所述測序。根據本發明的另一些實施例，當所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含IonTorrent/Proton測序平臺的P1測序接頭，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含IonTorrent/Proton測序平臺的A測序接頭時，利用IonTorrent/Proton測序平臺進行所述測序。根據本發明的另一些實施例，當所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含454測序平臺的A測序接頭，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含454測序平臺的B測序接頭時，利用454測序平臺進行所述測序。S103：確定待測樣品目標區域核酸序列基于所述測序結果，確定待測樣品目標區域核酸的序列。根據本發明的再一方面，本發明還提供一種同時確定多個待測樣品的目標區域核酸序列的方法。根據本發明的實施例，參照圖5，該方法包括以下步驟：S201：分別獨立地構建多個待測樣品中的每一個目標區域核酸測序文庫針對所述多個待測樣品中的每一個，分別獨立地根據上述構建待測樣品目標區域核酸測序文庫的方法，構建待測樣品的目標區域核酸測序文庫，其中，所述多個待測樣品的正/反文庫標簽相互不同，所述多個為至少2個。S202：將多個待測樣品的目標區域核酸測序文庫混合將多個待測樣品的目標區域核酸測序文庫混合，以便獲得混合文庫。S203：對混合文庫進行測序對所述混合文庫進行測序，以便獲得測序結果，所述測序結果包括所述多個待測樣品的目標區域核酸文庫序列和所述正/反文庫標簽。根據本發明的一些實施例，當所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含illumina測序平臺的P5測序接頭，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含illumina測序平臺的P7測序接頭時，利用Illumina測序平臺進行所述測序。或者當所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含illumina測序平臺的P7測序接頭，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含illumina測序平臺的P5測序接頭時，利用Illumina測序平臺進行所述測序。根據本發明的另一些實施例，當所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含IonTorrent/Proton測序平臺的P1測序接頭，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含IonTorrent/Proton測序平臺的A測序接頭時，利用IonTorrent/Proton測序平臺進行所述測序。根據本發明的另一些實施例，當所述第一接頭與所述第二正向引物PCR擴增后的產物包含454測序平臺的A測序接頭，所述第二接頭與所述第二反向引物PCR擴增后的產物包含454測序平臺的B測序接頭，利用454測序平臺進行所述測序。S204：確定多個待測樣品中每一個的目標區域核酸序列基于所述正/反文庫標簽對所述多個待測樣品的目標區域核酸測序文庫的序列進行區分，并確定所述多個待測樣品的每一個的目標區域核酸序列。下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面示例僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。除另有交待，以下實施例中涉及的未特別交待的試劑、序列(接頭、標簽和引物)、軟件及儀器，都是常規市售產品或者開源的。在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。實施例一設計引物以IMGT數據庫的參考序列為依據，設計BCR、TCR的特異性引物。第一反向引物在C基因的保守區設計，同時所述第一反向引物在C基因特異引物的5'端連接反向文庫標簽，反向文庫標簽的5'端連接第二接頭，見圖1中第一反向引物。第一正向引物包括V基因保守區的特異性引物和第一接頭，見圖2中第一正向引物，或者包括V基因保守區的特異性引物、正向文庫標簽和第一接頭，見圖3中第一正向引物。正/反文庫標簽均用于區分不同的樣本。第二正向引物包含第一退火，見圖2所示，第二反向引物包含第二退火，見圖3所示。在進行PCR反應時，主要起作用的是上下游兩端的接頭，也就是第二正向引物和第二反向引物。本發明并沒有引入外源的一段序列作為PCR結合位置，而是使用了測序接頭的部分序列，即完整測序接頭的3'端16-25bp作為第一正向引物和第二正向引物、第一反向引物和第二反向引物退火互補區，正是由于這個特殊的設計使得本方法不需要進行末端修復，加‘A’和加接頭等過程，直接進行目的產物富集同時完成文庫構建。舉例如下，設計2個樣本引物組序列。表12組引物組序列樣本文庫制備1、密度梯度分離人外周血單個核細胞使用含抗凝劑的無菌采血管進行采血(抗凝劑一般有乙二胺四乙酸EDTA)，利用淋巴細胞分離液，比如Ficoll-PaquePLUS淋巴細胞分離液或Percoll淋巴細胞分離液進行密度梯度分離PBMC。2、RNA提取采用Trizolregeant方法或者提取試劑盒等提取總RNA。3、DNA消化使用DNA消化酶將殘留在RNA樣本中的DNA去除。4、cDNA1st合成使用反轉錄酶和反轉錄引物對RNA進行反轉錄，得到cDNA1鏈，并加入RNA消化酶，消化RNA。如圖1所示，第一反向引物對mRNA進行反轉錄。4.1在0.2mlPCR管內按以下體系配制(1個樣品)。組分體積(μL)已消化DNA后得到的RNA(20ng/ul)10第一反向引物(2pmol/ul)1dNTPmix(10mM)1經焦碳酸二乙酯處理水(DEPC水)14.2將混合物置于65℃5分鐘以使RNA變性，變性結束，放置冰上1min，瞬時離心后，將以下混合溶液加至4.1中0.2mlPCR管。組分體積μL5x1鏈緩沖液(5×1ststrandbuffer)4100mMM二硫蘇糖醇(DTT)1RNA酶抑制劑(RNAseOUT)(40U/μL)1反轉錄酶III(SuperScriptTMIII)(200U/μL)1其中，PCR管的總體積為20μL。輕微震蕩混勻。4.3在PCR儀上反應50℃50min。70℃15min4.4加入1μLRNasemix，輕微震蕩并徹底混勻，37℃孵育30min。4.5按照說明書，使用AMpureXP純化cDNA1鏈樣品，以18ul無核酸酶水回收cDNA1鏈樣品。此步驟結束之后，可以將反應混合物儲存于-20℃。5、特殊設計的PCR條件富集目標區域并完成文庫構建PCR使用的引物包括第一正向引物(V區正向引物)及第二引物組，其中第一正向引物和第二正向引物的摩爾比為1:1～1:10，所述第一正向引物與第二正向引物之和與第二反向引物的摩爾比為1:1。此步PCR結束后，目的片段兩端含有完整的測序接頭，文庫構建結束。見圖2和圖3，第一正向引物和第二引物組對cDNA1st進行PCR。5.1將合成得到的cDNA1st作為模板PCR富集。將以下混合溶液在200μL的PCR管中配制PCR反應體系。PCR反應條件為：6、測序文庫純化構建的測序文庫可用三種方法進行純化，分別為磁珠純化、純化柱純化和瓊脂糖膠電泳回收純化。PCR反應結束后，將PCR產物轉移至1個1.5mL離心管中,用AMPureXPDNA純化試劑盒(SPRIbeads)純化擴增后的樣品。7、文庫檢測Agilent2100Bioanalyzeranalysissystem檢測文庫插入片段大小及含量；Q-PCR精確定量文庫的濃度。高通量測序將構建的測序文庫在高通量測序平臺上進行測序，高通量測序平臺包括IlluminaHiseq及Miseq測序平臺，Roche454測序平臺及LifeTechnologies的IonTorrent測序平臺等。測序數據分析將測序得到的數據進行質量過濾和長度過濾去除污染及接頭序列；統計結果包括：測定的序列(Reads)長度、數據產量。然后將得到的序列進行比對分析，按照IMGT上V、(D、)J基因的定義將V、(D、)J基因找出并確定位置，并統計V、(D、)J基因的多樣性。根據IMGT上的定義找出CDR3，并統計CDR3的長度和多樣性。在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“具體示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。上面所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明技術方案所做出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。SEQUENCELISTING<110>廣州精科醫學檢驗所有限公司<120>引物組合物、其用途、構建文庫和確定核酸序列的方法<130>CN83656<160>22<170>PatentInversion3.5<210>1<211>43<212>DNA<213>Artificial<220><223>第一正向引物<400>1ttcctctctatgggcagtcggtgatcacagatgatttccccct43<210>2<211>18<212>DNA<213>Artificial<220><223>目標區域特異性正向引物<400>2cacagatgatttccccct18<210>3<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>第一接頭序列<400>3ttcctctctatgggcagtcggtgat25<210>4<211>62<212>DNA<213>Artificial<220><223>第一反向引物<400>4tcatccctgcgtgtctccgactcagctaaggtaacgatcatccctgcgtgtctccgactc60ag62<210>5<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>目標區域特異性反向引物<400>5tcatccctgcgtgtctccgactcag25<210>6<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>第二接頭序列<400>6tcatccctgcgtgtctccgactcag25<210>7<211>12<212>DNA<213>Artificial<220><223>反向文庫標簽序列<400>7ctaaggtaacga12<210>8<211>41<212>DNA<213>Artificial<220><223>第二正向引物<400>8ccactacgcctccgctttcctctctatgggcagtcggtgat41<210>9<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>第一退火序列<400>9ttcctctctatgggcagtcggtgat25<210>10<211>30<212>DNA<213>Artificial<220><223>第二反向引物<400>10ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag30<210>11<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>第二退火序列<400>11tcatccctgcgtgtctccgactcag25<210>12<211>47<212>DNA<213>Artificial<220><223>第一正向引物<400>12atgggcagtcggtgactaaggtaacgatccgtctctactctgaagat47<210>13<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>目標區域特異性正向引物<400>13tccgtctctactctgaagat20<210>14<211>16<212>DNA<213>Artificial<220><223>第一接頭序列<400>14atgggcagtcggtgat16<210>15<211>46<212>DNA<213>Artificial<220><223>第一反向引物<400>15cgtgtctccgactcagctaaggtaacgatgaaaaacgtgttcccac46<210>16<211>18<212>DNA<213>Artificial<220><223>目標區域特異性反向引物<400>16tgaaaaacgtgttcccac18<210>17<211>16<212>DNA<213>Artificial<220><223>第二接頭序列<400>17cgtgtctccgactcag16<210>18<211>12<212>DNA<213>Artificial<220><223>正/反文庫標簽序列<400>18ctaaggtaacga12<210>19<211>41<212>DNA<213>Artificial<220><223>第二正向引物<400>19ccactacgcctccgctttcctctctatgggcagtcggtgat41<210>20<211>16<212>DNA<213>Artificial<220><223>第一退火序列<400>20atgggcagtcggtgat16<210>21<211>30<212>DNA<213>Artificial<220><223>第二反向引物<400>21ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag30<210>22<211>16<212>DNA<213>Artificial<220><223>第二退火序列<400>22cgtgtctccgactcag16當前第1頁1 2 3