一種灰霉病菌拮抗菌株及其篩選方法和應用與流程

本發明屬于微生物技術及生物防治領域，具體涉及一種解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-KA4及其篩選方法和應用。

背景技術：

灰霉病是一種世界性的植物病害，該病害由半知菌亞門真菌—灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引發，侵染包括黃瓜、西紅柿、葡萄等多種作物，對農業生產構成極大威脅，嚴重影響蔬菜和水果的產量和質量。目前主要采用嘧霉胺、嘧菌酯、多菌靈、乙霉威、速克靈等化學農藥進行防治，化學農藥的大量使用，不僅造成了環境污染，而且引起了灰葡萄孢菌對嘧霉胺、多菌靈、乙霉威等藥劑的抗藥性，王美琴等研究表明，山西晉中地區黃瓜灰霉病菌對乙霉威和速克靈的抗性達到中抗，對多菌靈的抗性為高抗。李興紅等研究發現，北京地區番茄灰霉病對嘧霉胺的抗藥性非常普遍，且以高抗菌株為主，生產上應替換新型殺菌劑防治番茄灰霉病。所以，開發安全、高效、不引起抗性的生物防治途徑是降低灰霉病危害、減少環境污染、保證農業穩產高產的重要途徑，越來越成為灰霉病防治的研究熱點。

目前，已經篩選出多株對灰葡萄孢菌有拮抗作用的菌株。Elad將哈茨木霉T39菌株制成哈茨木霉可濕性粉劑用于控制溫室作物和葡萄灰霉病等病害的發生。Dik等比較了哈茨木霉T39和出芽短梗霉、淺白隱球酵母對黃瓜和番茄灰霉病的防治效果，發現哈茨木霉和出芽短梗霉處理能使莖部病斑與植株的死亡率降低40%~100%，其防效優于殺菌劑對甲抑菌靈和撲海因。魏艷敏等測定了 26 株放線菌菌對5種病原真菌的抑菌作用，其中5株對灰霉病病菌抑菌作用較強，抑菌活性明顯高于50%多菌靈等對照化學藥劑。韓斯琴等從長白山土壤中分離到了一株放線菌D2-4，經平板抑菌試驗、離體葉片試驗和盆栽試驗發現該菌的發酵液對番茄灰霉病病菌具有很強的抑制和防治效果。迄今為止，用于灰霉病防治研究和應用的細菌有10多種，主要有芽胞桿菌、假單胞菌等，可控制番茄、辣椒、草莓、蘋果和葡萄等植物灰霉病的發生和危害。童蘊慧等分離獲得的拮抗性強、抗菌譜廣的地衣芽胞桿菌W l0、W 3 、Y 2-11-1菌株，對番茄灰霉病葉片和果實的防效為70%~80%，優于50%速克靈2000倍液。王偉等研究發現拮抗細菌x-75對番茄灰霉病具有較好的抑制效果。總體來說，我國利用拮抗細菌防治灰霉病的研究還相對很少，王英國等人中分離到1株解淀粉芽胞桿菌，其對于尖孢鐮刀菌、草莓蛇眼病菌等植物病原真菌均有很強的抑制作用。王奕文等人首次從甜瓜果實表面分離到1株解淀粉芽胞桿菌，對灰葡萄孢、鏈格孢、尖孢鐮刀菌、黑曲霉和粉紅單端孢等果蔬采后病原真菌具有顯著且廣譜的拮抗作用。

本研究利用單一靶標初篩、多靶標復篩的篩選體系，從土壤樣品中篩選出了對灰霉病拮抗效果良好、且抑菌譜較廣的解淀粉芽胞桿菌BA-KA4，以期為灰霉病的生物防治提供材料支撐。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種編號為BA-KA4的解淀粉芽胞桿菌，其具有可抑制作物灰霉病病原菌的生長的作用，且抑菌譜較廣，尤其具有可明顯抑制黃瓜灰霉病病原菌的生長的作用。另一方面本發明還提供了上述菌株的篩選方法和用途。

為實現上述目的，本發明所采取的技術方案為：

一種灰霉病菌拮抗菌株，該菌株為解淀粉芽胞桿菌BA-KA4，于2016年3月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為：CGMCC No. 12190。

進一步地，所述的灰霉病菌拮抗菌株，具有抑制辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、煙草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌生長的活性。

一種上述解淀粉芽胞桿菌BA-KA4的篩選方法，包括以下步驟：

（1）對來自不同地區的土壤試樣中的細菌進行分離純化與保藏；

（2）初篩：采用平板對峙法進行拮抗菌的篩選，用直徑5mm的打孔器在黃瓜灰霉病菌邊緣打孔，將菌塊接種于PDA平板中央，挑取4個不同的單菌落均勻接在距離指示菌3cm的位置，22℃ 黑暗培養5d 后，觀察抑菌效果，選出具有抑菌圈的菌株進入復篩；

（3）復篩：以黃瓜灰霉病菌為指示菌，采用十字交叉法將進入復篩的菌株點接在距平板中央3cm處的4 個角上，平板中央同時移入直徑5mm的長有灰霉病菌的瓊脂塊，22℃ 黑暗培養5d 后，觀察抑菌結果，測定抑菌圈直徑，計算抑菌率，篩選出抑菌率60%以上的菌株；進行繼代培養，測定遺傳穩定性，篩選培養10代后抑菌率60%以上的菌株；選擇辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、煙草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌作為指示菌,采用平板對峙法對選出的菌株進行抑菌譜的測定，觀察抑菌效果，測定抑菌圈直徑，計算抑菌率，篩選出對這8種真菌抑菌效果都較好的菌株，即為解淀粉芽胞桿菌BA-KA4。

進一步地，步驟（1）的具體操作為：從云南、黑龍江、新疆、河北地區采來的120個土壤，采用PB培養基，利用稀釋涂平板方法進行土壤分離，于28℃培養箱中培養3d后，挑取菌落形態不同的細菌進行5次劃線純化、編號，并采用15%的甘油在-80℃冰箱保存。

進一步地，所述PB培養基為 ：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15 g，pH 7.4，蒸餾水定容至1L，121℃滅菌20min。

一種上述解淀粉芽胞桿菌BA-KA4在防治作物灰霉病害中的應用。

進一步地，其防治方法為用無菌水將解淀粉芽胞桿菌BA-KA4稀釋成濃度為1×10⁸CFU/mL的菌懸液，121℃滅菌20min后，葉面噴施于作物。

本發明所述的解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens CGMCC No. 12190的形態學特征為：在PB培養基上生長不產生色素，菌落扁平或圓形、乳白色不透明、菌落邊緣整齊，表面有褶皺。革蘭氏陽性，顯微鏡觀察為桿狀、產生芽孢，芽孢橢圓或柱形。參見圖3。

參照《柏杰明細菌鑒定手冊》和《常見細菌鑒定手冊》進行菌株的生理生化鑒定，結果如表1所示，初步鑒定拮抗菌BA-KA4為解淀粉芽胞桿菌。

表1拮抗菌生理生化鑒定結果

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性

本發明的解淀粉芽胞桿菌BA-KA4對辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、煙草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌等多種病原真菌均具有明顯的抑制作用；并且尤其適用于制作為農用制劑用于防治作物灰霉病菌感染而引起的病害。

生物樣品保藏信息

解淀粉芽胞桿菌BA-KA4，分類命名為Bacillus amyloliquefaciens，已于2016年3月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，菌種保藏號為CGMCC No. 12190。

附圖說明

圖1拮抗菌BA-KA4對黃瓜灰霉病菌的拮抗效果

圖2拮抗菌BA-KA4抑菌譜

圖3拮抗菌BA-KA4菌落形態

圖4拮抗菌BA-KA4 依據16S rDNA基因序列的系統發育樹

圖5拮抗菌BA-KA4 依據gyrB基因序列的系統發育樹。

具體實施方式

本發明中所用供試土壤為從云南、黑龍江、新疆、河北等地采集的土樣。

供試病原菌為辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、煙草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌，由本實驗室分離保存。

供試黃瓜種子購于河北省農科院。

供試培養基為：PDA 培養基( 1 L) ：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1L，115℃滅菌20min；PB培養基( 1 L) ：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15 g，pH 7.4，蒸餾水定容至1L，121℃滅菌20min。

實施例1 土壤中細菌的分離純化與保藏

（1）從云南、黑龍江、新疆、河北等地采來的120個土壤，采用PB培養基，利用稀釋涂平板方法進行土壤分離，于28℃培養箱中培養3d后，挑取菌落形態不同的細菌進行5次劃線純化、編號，并采用15%的甘油在-80℃冰箱保存。

（2）采用平板對峙法進行拮抗菌的初篩，用直徑5mm的打孔器在黃瓜灰霉病菌邊緣打孔，將菌塊接種于PDA平板中央，挑取4個不同的單菌落均勻接在距離指示菌3cm的位置，22℃ 黑暗培養5d 后，觀察抑菌效果，選出具有抑菌圈的菌株進入復篩。從129個土樣中分離到的細菌菌株4200株，分別與黃瓜灰霉病菌做平板對峙試驗，初篩得到對黃瓜灰霉病菌具有拮抗作用的細菌191株。

（3）以黃瓜灰霉病菌為指示菌，采用十字交叉法將進入初篩的菌株點接在距平板中央3cm處的4 個角上，平板中央同時移入直徑5mm的長有灰霉病菌的瓊脂塊，22℃ 黑暗培養5d 后，測量、記錄抑菌圈直徑的大小并計算抑制率，篩選出抑菌率60%以上的菌株10株。抑制率（%）=（對照組病原菌菌落直徑-處理組病原菌菌落直徑）/對照組病原菌菌落直徑×100%。進行繼代培養，測定遺傳穩定性，篩選培養10代后抑菌率60%以上的菌株，以上10株菌株培養10代后抑菌率均在60%以上；選擇辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、煙草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌等8種真菌作為指示菌進行多靶標復篩，觀察抑菌效果，測定抑菌圈直徑，計算抑菌率，篩選出對這8種病原真菌具有最好抑菌效果菌株，即為解淀粉芽胞桿菌BA-KA4。結果如圖1和圖2所示，BA-KA4的抑菌率最高，為65%，且穩定遺傳。拮抗菌BA-KA4對8種病原真菌均具有明顯的抑制作用，具有廣泛的抑菌譜，且對不同病原真菌的拮抗能力有所不同。其中對5種病原真菌的抑制率都達到60%以上，分別是：對梨黑斑病菌抑制率為75.9%，對大蒜菌核病菌抑制率為65.9%，對番茄早疫病菌抑制率為62.9%，番茄灰霉病菌抑制率為61.8%，對辣椒疫霉病菌的抑制率為60.6%。

實施例2 拮抗菌BA-KA4的鑒定

（1）拮抗菌的培養特征和形態特征

該菌株BA-KA4，如圖3所示，在PB培養基上生長不產生色素，菌落扁平或圓形、乳白色不透明、菌落邊緣不整齊、表面有褶皺。革蘭氏陽性，顯微鏡觀察為桿狀、產生芽孢，芽孢橢圓或柱形。

（2）拮抗菌的生理生化特征

參照《柏杰明細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》進行：V-P試驗陽性、甲基紅試驗陰性、吲哚試驗陽性、明膠液化試驗陽性、檸檬酸鹽利用試驗陽性、淀粉水解試驗陽性、脂肪酶陰性、H₂S產生試驗陽性、硝酸鹽還原試驗陽性、丙二酸鹽的利用陰性、酪氨酸水解陰性、纖維素分解陽性。

（3） PCR擴增及序列測定

（1）16S rDNA序列分析鑒定

采用天根公司的試劑盒進行細菌基因組DNA的提取，以此DNA為模版，以27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，序列SEQ ID No.1和1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，序列SEQ ID No.2為引物，進行菌株16S rDNA的擴增。PCR擴增條件為: 95℃ 5min；94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 2min，35個循環；72℃10min。將16S rDNA擴增產物在金唯智生物科技有限公司進行測序，測序所得序列通過NCBI數據庫進行BLAST比對，通過MEGA5.2軟件與已知序列進行系統發育分析。以拮抗菌BA-KA4基因組DNA為模板，用引物27F和1492R進行PCR擴增，測得該菌株的16S rDNA核苷酸序列長度為1394bp，如序列SEQ ID No.3所示，與NCBI中已知的16S rDNA序列進行比對分析，發現拮抗菌BA-KA4菌株與Bacillus methylotrophicus strain F29、Bacillus amyloloquefaciens strain CSM11、Bacillus subtilis strain MB8，相似性均為100%，構建 16S rDNA序列的系統發育樹（圖4），可以看出，拮抗菌BA-KA4被鑒定為解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloloquefaciens。

（2）gyrB基因序列分析鑒定

采用天根公司的試劑盒進行細菌基因組DNA的提取，以此DNA為模版，正向引物為UP1(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′)，序列SEQ ID No.4，反向引物為UP2r（5′-AGCAGGGTACGGAT GTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′），序列SEQ ID No.5，擴增gyrB基因序列。PCR擴增條件為： 95℃ 4min；98℃ 10s，62℃ 1min，72℃ 2min，30 個循環；72℃ 8min。將gyrB 基因擴增產物在金唯智生物科技有限公司進行測序，測序所得序列通過NCBI數據庫進行BLAST比對，通過MEGA5.2軟件與已知序列進行系統發育分析。以拮抗菌BA-KA4基因組DNA為模板擴增gyrB基因，序列長度約為1010bp，如序列SEQ ID No.6所示，與NCBI中模式菌株的16S rDNA序列進行比對分析，發現拮抗菌BA-KA4菌株與解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloloquefaciens 的同源性最近，相似性為98%，依據gyrB基因序列構建系統發育樹（圖5），可以看出，拮抗菌BA-KA4與解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloloquefaciens FZB42親緣關系最接近。

綜合菌株的培養特征、形態和生理生化特征及16S rDNA 序列和gyrB基因序列分析結果，可得出拮抗菌BA-KA4菌株為解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloloquefaciens。

實施例3解淀粉芽胞桿菌BA-KA4對黃瓜灰霉病的盆栽防效試驗

制備種子瓶，挑取BA-KA4單菌落接種于裝有20mL PB液體培養基的100 mL三角瓶中，28℃、180rpm搖床震蕩培養24h。從種子瓶中吸取10 mL菌液接種于裝有200mL PB液體培養基的500mL三角瓶中，28℃、180rpm搖床震蕩培養48h后，用無菌水稀釋成1×10⁸CFU/ mL,即為菌懸液。取相同濃度的菌懸液121℃滅菌20min，即為無菌發酵液。嘧菌酯用無菌水稀釋1000倍。用打孔器在生長3d 的灰霉病菌邊緣打孔，將菌塊放入0.9%的生理鹽水中，22℃、180rpm搖床震蕩搖勻30min，用無菌水稀釋成濃度為1×10⁶個/mL的孢子懸液。盆栽黃瓜葉面噴施菌懸液、無菌發酵液、嘧菌酯6h后，接種灰霉病菌孢子懸液，無菌水為陰性對照。黑暗保濕48h，22℃恒溫培養，觀察5d、7d、14d發病情況，計算病情指數。

實驗結果如表2所示，解淀粉芽胞桿菌BA-KA4的無菌發酵液和嘧菌酯對黃瓜灰霉病的防治效果在5d和7d都可以達到100%，但是在14d時嘧菌酯的防效下降，而無菌發酵液防效依然可以達到97.5%。對比嘧菌酯和菌懸液的處理組，無菌發酵液處理后的葉片更加濃綠。對比常用藥劑嘧菌酯，短期內防治效果相當，但該菌株的代謝產物持效期更長。

表2解淀粉芽胞桿菌BA-KA4對黃瓜灰霉病的室內防效試驗

在黃瓜灰霉病比較發生普遍的地區，使用拮抗微生物進行防治，可以減少化學農藥的使用，解決農藥殘留問題，延緩病菌抗藥性產生。

解淀粉芽胞桿菌是一種與枯草芽胞桿菌親緣性很高的細菌，在其自身的生長過程中可以產生一系列的代謝產物，這些代謝產物使得解淀粉芽胞桿菌能夠具有廣泛地抑制真菌和細菌的活性。本研究的盆栽防效試驗表明解淀粉芽胞桿菌BA-KA4的代謝產物對黃瓜灰霉病的防治效果在5d和7d時可達到100%，14d后仍可達到97.5%。對比常用藥劑嘧菌酯，短期內防治效果相當，但該菌株的代謝產物持效期更長。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省科學院生物研究所

<120> 一種灰霉病菌拮抗菌株及其篩選方法和應用

<130> 2016

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggytaccttg ttacgactt 19

<210> 3

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<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢桿菌

<400> 3

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 60

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 120

accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 180

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 240

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 300

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 360

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 420

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 480

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 540

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 600

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 660

agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 720

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 780

tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 840

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 900

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 960

gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1020

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1080

tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1140

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1200

aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1260

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1320

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gaggtaacct ttag 1394

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<213> 人工序列

<400> 5

agcagggtac ggatgtgcga gccrtcnacr tcngcrtcng tcat 44

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<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢桿菌

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tgaaaccatc gaagcgatat aaagtatccg gcggtcttcc ggtgtagggg cgtctgtcgt 60

aacgccttgt cgaccactct tgacgttacg gttcatcgtg acggaaaaat ccactatcag 120

gcgtacgagc gcggtgtacc tgtggccgat cttgaagtga tcggtgatac tgataagacc 180

ggaacgatta cgcacttcgt tccggatccg gaaattttca aagaaacaac cgaatacgac 240

tatgacctgc tttcaaaccg tgtccgggaa ttggccttcc tgacaaaagg tgtaaacatc 300

acgattgaag acaaacgtga aggacaagaa cggaaaaacg agtaccacta cgaaggcgga 360

atcaaaagct atgttgagta cttaaaccgt tccaaagaag tcgttcatga agagccgatt 420

tatatcgaag gcgagaaaga cggcataacg gttgaagttg cattgcaata caacgacagc 480

tatacaagca atatttattc tttcacaaat aatatcaaca catacgaagg cggcacgcac 540

gaagccggat ttaaaaccgg tctgacccgt gttataaacg actatgcaag aagaaaaggg 600

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