控制大白菜生長的BrVQ3?1基因及其應用的制作方法

本發明涉及一種控制大白菜生長的BrVQ3-1基因及其應用，特別是一種負調控大白菜生長的BrVQ3-1基因及其應用，屬于分子生物學技術領域。

背景技術：

大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)起源于中國，是我國乃至世界性的重要蔬菜作物之一。葉球是大白菜食用的最主要器官，其大小是目前開展大白菜育種工作所要考慮的一個重要經濟性狀。多年的生產實踐表明，大白菜葉球的大小受嚴格的遺傳控制，受相關基因表達調控的影響。開展大白菜葉球大小相關基因的研究對于遺傳上控制葉球的大小，提高作物產量和品質有重要的理論意義和實用價值。

不同物種間，植物器官的大小有著顯著的差異，但在物種內個體之間器官的大小相對一致，說明植物器官的大小受到嚴格的遺傳控制。已有的研究表明，在植物體中存在多個控制器官大小的基因，例如ANT、AtGRF1-AtGRF5、ARGOS、BrARGOS、AtGIF1、STN1、AtMRB1、ANGUSTIFOLIA、AtEXP10、ARL、ROT3、RON2/LUG以及BPE基因等。它們可通過協調細胞分裂和生長來決定器官大小。例如，過量表達AtGRF1和AtGRF2的擬南芥產生較大的葉片和子葉。相反，atgrf1-atgrf2-atgrf3三突變體產生較小的葉片和子葉，這些表型變化是由于細胞體積的增加或減小所致，這表明AtGRF蛋白調節葉片和子葉組織細胞的延伸。由于在葉寬軸方向上的細胞數目減少，GIF1功能缺失突變體產生了較窄的葉片和花瓣，說明GIF1基因控制葉片和花瓣的生長和形狀。

VQ蛋白是一類與生長發育以及響應外界環境脅迫等功能相關的植物特異性轉錄調控輔助因子，其氨基酸序列僅在VQ結構域：“FxxxVQxLTG”(其中x代表任意氨基酸)處高度保守，而其他位置的序列則相對多變。對擬南芥部分VQ基因的生物學功能的研究發現，其在調控種子、下胚軸、花、葉等器官的生長發育過程中具有重要作用。例如，Cheng等對擬南芥VQ8基因的研究發現，其功能缺失突變株在其整個生長發育期都表現出葉片黃綠和生長發育遲緩等表型，而且VQ17、VQ18和VQ22的過量表達植株的生長也受到了嚴重的抑制。由于VQ基因僅在近幾年才被科學家所認知，所以大部分生物VQ基因的功能未知，甚至作為模式植物的擬南芥的大部分VQ家族成員的生物學功能也未被研究。

技術實現要素：

本發明針對現有技術的不足，提供一種控制大白菜生長的BrVQ3-1基因及其應用。

一種控制大白菜生長的BrVQ3-1基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述BrVQ3-1基因全長693bp，編碼230個氨基酸，在進化上，與BrVQ3-1基因具有較近親緣關系的為擬南芥AtVQ3基因；二者的核苷酸序列一致性僅為72.22％，氨基酸序列一致性僅為67.35％，種間差異較大。另外，到目前為止關于擬南芥等生物的VQ3基因功能仍未知。

一種由上述BrVQ3-1基因編碼的調控因子，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一種插入上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重組載體。

上述BrVQ3-1基因、重組載體在經濟作物生產改良中的應用。

根據本發明優選的，所述經濟作物為大白菜。

有益效果

本發明從大白菜中首次克隆了BrVQ3-1基因，并驗證了該基因具有負調控植物細胞生長的功能，經試驗，通過過量表達該基因，可以獲得比野生型植株體型小的轉基因植株。本發明的基因可為培育農作物新品種提供理論依據和基因來源。

附圖說明

圖1為1/2MS培養基上暗處生長6天的野生型和轉基因擬南芥植株下胚軸的對比圖；

圖中：A為野生型和轉基因植株下胚軸的表型照片，B為野生型和轉基因植株下胚軸的測量數據柱狀圖；

圖2為1/2MS培養基上生長10天的野生型和轉基因擬南芥植株根的對比圖；

圖中：A為野生型和轉基因植株根的表型照片，B為野生型和轉基因植株根的測量數據柱狀圖；

圖3為蛭石上生長30天的野生型和轉基因擬南芥植株的對比圖；

圖中：A為野生型和轉基因植株整體表型照片，B為野生型和轉基因植株不同葉位葉的表型照片，C為野生型和轉基因植株不同葉位葉的面積測量數據柱狀圖。

具體實施方式

下面結合實施例及說明書附圖對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護范圍不限于此。

實施例

大白菜mRNA的提取

以大白菜品種福山包頭10天苗齡幼苗的地上部分為材料，置于液氮預冷的研缽中，加入液氮快速磨成粉末，將100mg粉末裝入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol(購自Invitrogen公司)顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。在4℃，12000rpm離心10分鐘，取上清液移至新的1.5ml離心管中。加入200μl氯仿，用手劇烈搖晃15秒鐘，室溫靜置2-3分鐘。4℃，12000rpm離心10分鐘。取無色上層水相至一新的離心管中，加入600μl-20℃冰箱預冷異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4℃，12000rpm離心10分鐘，除上清液。加入1ml 75％(v/v)乙醇，渦旋震蕩。4℃，7500rpm離心3分鐘。室溫干燥3-5分鐘，加入30μl的無RNase的水溶解沉淀，然后置于55℃水浴中溶解10分鐘，迅速冰浴5分鐘后瞬時離心，制得mRNA。

BrVQ3-1基因的獲得

利用RT-PCR方法擴增BrVQ3-1基因的核苷酸序列，具體操作方法如下：

將制得的mRNA反轉錄成第一鏈cDNA，所用反轉錄酶為Takara公司生產的M-MLV reverse transcriptase，反應體系為20μl。依次加入1μl oligo dT、2μg RNA和無RNase水至13.5μl，在70℃水浴中變性5分鐘，迅速冰浴5分鐘，瞬時離心，然后依次加入1μl 10mM dNTP，4μl 5×RT緩沖液，0.5μl RNase inhibitor和1μl反轉錄酶。混合均勻，42℃反應60分鐘，70℃水浴10分鐘使酶失活，制得第一鏈cDNA。

以第一鏈cDNA為模板擴增目的基因，引物核苷酸序列如下：

BrVQ3-1-C-F:5'-GCTCTAGACGGGATCCATGGATAATAAATCTC-3'(SEQ ID NO.3)

BrVQ3-1-C-R:5'-AACTGCAGGCGACCTAACAATCAAAAAAA-3'(SEQ ID NO.4)

PCR反應體系為25μl，依次加入10×PCR緩沖液2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，第一鏈cDNA 2μl，10mM正向引物0.5μl，10mM反向引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，最后加水至25μl。

PCR反應條件：預變性94℃3分鐘；變性94℃30秒，退火58℃30秒，延伸72℃2分鐘，30個循環；最后延伸10分鐘，4℃保存。

將上述PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，加入pUC18 DNA vector中：pUC18 DNA vector由Takara公司產售，經連接反應，然后將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞進行檢測，取陽性菌株，制得連接好的載體；

上述連接體系10μl，各組分為：1μl pUC18 DNA vector，2μl PCR產物，1μl T4 DNA連接酶，1μl 10×反應緩沖液，加水補至10μl；上述連接條件為：16℃水浴中反應12-16小時。

將連接好的載體進行測序，確認正確無誤，經檢測，BrVQ3-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全長693bp，編碼230個氨基酸。在進化上BrVQ3-1基因與擬南芥AtVQ3基因具有較近的親緣關系；二者的核苷酸序列一致性為72.22％，氨基酸序列一致性為67.35％。

轉基因植株的獲得

將上述連接好的載體用Takara公司生產的XbaI和PstI內切酶酶切，操作如下：

反應體系50μl，包括7.5μl 10×T緩沖液，20μl連接好的載體，2μl XbaI內切酶，2μl PstI內切酶和18.5μl水；反應條件為：在37℃水浴4個小時；

將酶切后的BrVQ3-1基因經瓊脂糖凝膠電泳后，用杭州博日科技有限公司產售的Biospin Gel Extraction Kit回收基因片段，操作如下：用干凈、鋒利的手術刀，將含有BrVQ3-1基因的瓊脂糖凝膠切下，并放入1.5ml離心管中。按體積比1:3的比例加入Extraction buffer。于50℃恒溫水浴中直到凝膠融化。將混合液全部轉入Spin column內，于6000rpm離心1分鐘，棄去接液管內液體。向Spin column中加入500μl Extraction buffer，于12000rpm離心1分鐘，棄去接液管內液體。向Spin column中加入750μl Wash Buffer，于12000rpm離心1分鐘，棄去接液管內液體。再次于12000rpm離心1分鐘，然后將Spin column轉移至無菌的1.5ml離心管內。向Spin column中加入50μl Elution Buffer，并于室溫放置1分鐘。12000rpm離心1分鐘，收集含有BrVQ3基因的溶液。上述詳細操作可參見Biospin Gel Extraction Kit的產品使用說明書。

將上述酶切回收的BrVQ3-1基因片段連接入植物表達載體pCAMBIA2300-35S-OCS(購自Biovector公司)中，操作如下：

反應體系10μl，包括1μl pCAMBIA2300-35S-OCS，5μl含有BrVQ3-1基因的溶液，1μl10×T4連接酶緩沖液和1μl T4連接酶，加水至10μl；反應條件為：在16℃下連接12～16小時；

經上述反應，制得質粒DNA，然后將質粒DNA轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，提取質粒進行鑒定，制得構建好的質粒DNA。

將構建好的質粒DNA轉入農桿菌LBA4404(購自Biovector公司)中，操作如下：

取100μl農桿菌LBA4404細胞溶液經電擊制備農桿菌感受態細胞，加入3μl構建好的質粒DNA，冰浴5分鐘，液氮冷凍1分鐘，37℃水浴5分鐘，然后加入1ml LB培養基(1升LB培養基含：5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、10g氯化鈉)，28℃，200rpm振蕩3小時。10000rpm離心1分鐘，棄上清，加入100μl LB培養基重懸細胞，涂布于含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的LB平板培養基上(1升LB平板培養基含：5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、10g氯化鈉、15g瓊脂)，28℃培養2～3天，選取經轉化后的農桿菌LBA4404；

通過浸花法將上述經轉化后的農桿菌LBA4404轉化擬南芥(Columbia ecotype)，操作如下：

將經轉化后的農桿菌LBA4404接種于5ml LB培養基中，28℃，200rpm振蕩過夜，按2wt％的接種量接種于200ml新鮮LB培養基中，繼續培養至OD₆₀₀為1.0，4500rpm離心5分鐘收集菌體，重懸于侵染液中，將擬南芥的花序浸入侵染液中30秒，把花盆側放于托盤中，蒙上地膜避光24小時，第二天取下地膜，將花盆直立；

上述侵染液含有5wt％蔗糖，0.03wt％Tween(吐溫)-20。

制備1/2MS篩選平板(1/2MS培養基加50mg/L卡那霉素，100mg/L羧芐青霉素)，T₁代種子用70％(v/v)乙醇消毒5分鐘，2wt％次氯酸鈉消毒10分鐘后播種于1/2MS篩選平板，每板播種100μg的擬南芥種子。4℃春化3天后放于培養箱(22℃，16小時光照/8小時黑暗)中。6天后選出綠色的生長正常的陽性植株，移入蛭石中培養，單株收獲T₂代種子。繁殖后獲得T₃代，鑒定T₃代，獲得純合的轉基因株系10株。

BrVQ3-1基因功能的鑒定

純合的轉基因株系和野生型擬南芥種子在4℃冰箱中春化3天，消毒后將種子播于1/2MS培養基平板。一部分于22℃，16小時光照/8小時黑暗培養箱中6天，選取轉基因株系中的任意兩株檢測下胚軸的長度(結果如圖1所示)。一部分置于培養間(22℃，16小時光照/8小時黑暗)中培養，生長10天時檢測根的長度(結果圖2所示)。

待1/2MS培養基平板上生長的幼苗的子葉完全張開后，將轉基因株系和野生型幼苗轉入蛭石中，然后置于培養間(22℃，16小時光照/8小時黑暗)中培養，培養30天后觀察純合的轉基因株系和野生型植株的表型(結果如圖3所示)。通過觀察發現純合的轉基因株系比野生型植株顯著減小，說明BrVQ3-1基因的過量表達抑制了植物的生長，從而使得植物器官減小。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省農業科學院蔬菜花卉研究所

<120> 控制大白菜生長的BrVQ3-1基因及其應用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 693

<212> DNA

<213> Brassica rapa L. ssp. Pekinensis

<400> 1

atggataata aatctccaag atcaaaagaa atcttgggac caagaccaac tccattgaaa 60

atccgtaaag actctcacaa gatcatcaag aagccaccac tagcgccaca accactacaa 120

tcacaaccac cgcagctaca cgagcaagaa ccatcacaac tattgcctcc acgcggtcca 180

gtgataatat acactgtatc tcccaagatt atacatacac atcctaataa cttcatgaca 240

ttggttcaac gtctcacagg caaaacctct acccccacaa ttccatcctc ctcttctcca 300

taccccttag cactagacta cacatctgca tcaagagaca cgtcagcagt gttcgatgca 360

tcccgtggtt cgatatctcc ggcggctagg tatgctgcga tggagaaagc taatgtttca 420

aatgaactag ggtttgtggg tggcatagag agcacgaatc aatattacca acatgaccat 480

catcaaaacc gagctaccga acgtgctgga atcttgtctc cagggcccgc ttctctaccg 540

cagatatcgc cagatttctt ttctacggtt ggaggatctg atcctcaagg tttttcgtcg 600

ttcttcaatg actttagctc aatcctacaa gccactccaa cgatcccgtc tccttcttcc 660

atggaccttt tcacaaattt ttttgattgt tag 693

<210> 2

<211> 230

<212> PRT

<213> Brassica rapa L. ssp. Pekinensis

<400> 2

Met Asp Asn Lys Ser Pro Arg Ser Lys Glu Ile Leu Gly Pro Arg Pro

1 5 10 15

Thr Pro Leu Lys Ile Arg Lys Asp Ser His Lys Ile Ile Lys Lys Pro

20 25 30

Pro Leu Ala Pro Gln Pro Leu Gln Ser Gln Pro Pro Gln Leu His Glu

35 40 45

Gln Glu Pro Ser Gln Leu Leu Pro Pro Arg Gly Pro Val Ile Ile Tyr

50 55 60

Thr Val Ser Pro Lys Ile Ile His Thr His Pro Asn Asn Phe Met Thr

65 70 75 80

Leu Val Gln Arg Leu Thr Gly Lys Thr Ser Thr Pro Thr Ile Pro Ser

85 90 95

Ser Ser Ser Pro Tyr Pro Leu Ala Leu Asp Tyr Thr Ser Ala Ser Arg

100 105 110

Asp Thr Ser Ala Val Phe Asp Ala Ser Arg Gly Ser Ile Ser Pro Ala

115 120 125

Ala Arg Tyr Ala Ala Met Glu Lys Ala Asn Val Ser Asn Glu Leu Gly

130 135 140

Phe Val Gly Gly Ile Glu Ser Thr Asn Gln Tyr Tyr Gln His Asp His

145 150 155 160

His Gln Asn Arg Ala Thr Glu Arg Ala Gly Ile Leu Ser Pro Gly Pro

165 170 175

Ala Ser Leu Pro Gln Ile Ser Pro Asp Phe Phe Ser Thr Val Gly Gly

180 185 190

Ser Asp Pro Gln Gly Phe Ser Ser Phe Phe Asn Asp Phe Ser Ser Ile

195 200 205

Leu Gln Ala Thr Pro Thr Ile Pro Ser Pro Ser Ser Met Asp Leu Phe

210 215 220

Thr Asn Phe Phe Asp Cys

225 230

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gctctagacg ggatccatgg ataataaatc tc 32

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aactgcaggc gacctaacaa tcaaaaaaa 29