一種可視化檢測葡萄糖的雙功能納米酶的制備方法與流程
本發明屬于化學領域，具體涉及一種用于可視化檢測葡萄糖的雙功能rGO-ZnFe2O4納米酶的制備方法。
背景技術：
糖尿病是一種常見的代謝性疾病,它嚴重地威脅著人類的健康。根據世界衛生組織統計顯示，截至目前，世界上有超過2.85億人患有糖尿病。據估計，到2030年這個數字將會是現在的兩倍或者更多。糖尿病患者一般表現為血糖高，尿糖呈現陽性，因此，監測和控制人體內的血糖水平對于糖尿病人是至關重要的。近年來，科研工作者一直致力于建立檢測與糖尿病相關的葡萄糖含量的方法。目前，人們已經建立了多種測定葡萄糖含量的方法。其中，比色法因其具有簡單、實用的特點，引起了研究人員的特別關注。原則上，優異的比色檢測葡萄糖的方法應具有由分析物引起的比色底物顏色變化明顯、靈敏度高、方法簡單和費用低廉等特點。首先，由于比色底物的氧化還原反應所引起的生成物的吸光度變化不僅具有好的可靠性，還表現出特定的顏色變化，這可以很容易地通過肉眼進行辨識，不需要任何昂貴或復雜的儀器。其次，對葡萄糖檢測而言，高靈敏度是十分重要的。盡管人們血液中血糖的含量不是很低(幾到幾十毫摩爾每升)，然而，血清或者血液的組成非常復雜，會干擾血糖的測定。迄今為止，建立能滿足上述要求的檢測葡萄糖的方法仍存在很大挑戰。
自從Fe3O4納米酶被Yan等首次發現具有類過氧化物生物酶的催化活性以來，該納米酶在比色分析中得到了廣泛應用。但Fe3O4納米酶如果長時間放置，很容易被空氣中的氧氣氧化，影響其催化活性及實際應用。盡管人們已制備了一些過氧化物納米酶，如CeO2納米顆粒、CuO納米顆粒、CuS納米顆粒、Co3O4納米顆粒、V2O5納米線、氧化石墨烯(GO)等，并且這些納米酶也在生物免疫分析以及檢測核苷酸、H2O2、葡萄糖、三聚氰胺等方面得到了應用。但是上述納米酶中有的催化活性較低、有的無磁性導致其催化行為完成后不易從溶液中分離，限制了其在實際檢測中的應用。因此，制備高效能、易分散、易分離的納米酶已成為比色分析領域的研究熱點之一。
技術實現要素：
針對現有檢測方法準確度差，生物酶易氧化，活性低，難分離，適用性窄等技術缺陷，本發明公開了一種合成具有類過氧化物酶性質的rGO-ZnFe2O4納米酶的新方法。在此基礎上，利用該納米酶的催化性能建立了一種檢測尿液中葡萄糖含量的可視化新方法。
本發明的目的是這樣實現的：
(1)rGO-ZnFe2O4納米酶的合成:
A.首先稱取石墨粉于研缽中，加入NaCl固體，研磨后加水進行溶解、過濾、洗滌，然后除去NaCl。
B.將處理過的石墨粉轉移至圓底燒瓶中，加入濃H2SO4，室溫條件下攪拌8小時。再將圓底燒瓶置于冰水浴中，緩慢加入KMnO4固體，于35-40℃攪拌30分鐘，再于65-80℃攪拌45分鐘。加入水，于98-105℃下繼續攪拌30分鐘。
C.加入水和30％H2O2終止反應，溶液顏色變為亮黃色。所得到的產品用5％HCl洗滌后，再用超純水洗滌，12000轉/分離心，重復此過程至無法通過離心分離為止。
D.將得到的黃色懸濁液轉移到透析袋中，于超純水中透析一周至GO溶液為中性為止。最后將該溶液放于培養皿中，90℃干燥，得到GO固體。將所得的GO固體剪碎，備用。
E.將GO，FeCl3·6H2O和ZnCl2于乙二醇中，超聲至分散完全使各物質混合均勻，隨后，加入NaOAc和聚乙二醇，在60℃水浴中攪拌30分鐘，將所得溶液轉移至高壓反應釜中，200℃下反應10小時。反應結束以后，自然冷卻。待降至室溫時，將最終所得到的黑色產物用磁鐵進行分離，然后用乙醇和去離子水交替洗滌得到rGO-ZnFe2O4納米酶。
F.將rGO-ZnFe2O4納米酶置于真空干燥箱中于45℃干燥，備用。
(2)用TEM、XPS、FT-IR等手段對其結構和形貌進行了表征。
(3)對pH值、納米酶用量、溫度、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)用量、H2O2用量、反應時間等進行優化，確定最佳的測定條件，建立測定人體尿液中葡萄糖的可視化方法。
(4)尿液中葡萄糖的測定
(a)將20μL 1.0mg/mL葡萄糖氧化酶與50μL處理過的尿液樣品在37℃下反應30分鐘；(b)將470μL HAc-NaAc緩沖溶液、55μL 20mM TMB、20μL 5mg/mL rGO-ZnFe2O41/2加入到上述反應溶液中，混合均勻；(c)將上述溶液于50℃條件下反應10分鐘，然后將其從水浴中取出，置于冰水中10分鐘終止反應；(d)通過外加磁場將rGO-ZnFe2O41/2與反應液分離；(5)將上述反應溶液用去離子水稀釋至3.0mL，在652nm處測其吸光度。最后，根據標準曲線計算尿液中葡萄糖的含量。
本制備方法操作簡單、不需要復雜設備，所制備的納米酶(rGO-ZnFe2O4)催化活性高、反應完成后易從溶液中分離、可重復使用；所建立的測定人體尿液中葡萄糖的方法選擇性好、靈敏度高、可視化。
附圖說明
圖1 GO(a)、rGO-ZnFe2O41/2(b)、rGO-ZnFe2O4(c)與rGO-ZnFe2O42(d)的紅外光譜圖。
圖2 rGO-ZnFe2O41/2的X射線光電子能譜圖(插圖為Fe2p和Zn2p的高分辨能譜)。
圖3 rGO-ZnFe2O42(a)、rGO-ZnFe2O4(b)與rGO-ZnFe2O41/2(c)的XRD譜圖。
圖4 rGO-ZnFe2O42(a)、rGO-ZnFe2O4(b)與rGO-ZnFe2O41/2(c)的掃描電鏡譜圖。
圖5 rGO-ZnFe2O41/2的透射電鏡譜圖。
圖6 rGO-ZnFe2O4(a)、rGO-ZnFe2O42(b)與rGO-ZnFe2O41/2(c)的磁滯回線。
圖7反應時間對體系(a)TMB+rGO-ZnFe2O4、(b)TMB+H2O2、(c)TMB+H2O2+rGO-ZnFe2O4吸光度的影響。
圖8 pH對rGO-ZnFe2O41/2催化活性(a)與溶液中泄漏鐵離子濃度(b)的影響。
圖9溫度對rGO-ZnFe2O41/2催化性能的影響。
圖10材料用量rGO-ZnFe2O41/2催化性能的影響。
圖11 TMB濃度對rGO-ZnFe2O41/2催化性能的影響。
圖12 H2O2濃度對rGO-ZnFe2O41/2催化性能的影響。
圖13 rGO-ZnFe2O41/2納米酶的穩定性。
圖14 rGO-ZnFe2O41/2納米酶的重復利用性。
圖15葡萄糖的響應曲線(a)和標準曲線(b)(插圖為不同濃度葡萄糖所對應的溶液照片)。
圖16測定葡萄糖的選擇性。
具體實施方式
實施例1
(1)rGO-ZnFe2O4納米酶的合成
A.首先稱取1.0g石墨粉于研缽中，加入NaCl固體50g，研磨10分鐘后，加水進行溶解、過濾、洗滌，然后除去NaCl。將處理過的石墨粉轉移至圓底燒瓶中，加入23mL濃H2SO4，室溫條件下攪拌8小時。再將圓底燒瓶置于冰水浴中，緩慢加入3.0g KMnO4固體，于35-40℃攪拌30分鐘，再于65-80℃攪拌45分鐘。然后加入46mL水，于98-105℃下繼續攪拌30分鐘。最后，加入140mL水和10mL 30％H2O2終止反應，溶液顏色變為亮黃色。所得到的產品用5％HCl洗滌后，再用超純水洗滌，離心(12000轉/分)，重復此過程至無法通過離心分離為止。然后將得到的黃色懸濁液轉移到透析袋中，于超純水中透析一周至GO溶液為中性為止。最后將該溶液放于培養皿中，90℃干燥，得到GO固體。將所得的GO固體剪碎，備用。
B.將100mg GO，0.54g FeCl3·6H2O和0.136g ZnCl2于50mL乙二醇中，超聲至分散完全使各物質混合均勻，隨后，加入3.6g NaOAc和1.0g聚乙二醇，在60℃水浴中攪拌30分鐘，將所得溶液轉移至高壓反應釜中，200℃下反應10小時。反應結束以后，自然冷卻。待降至室溫時，將最終所得到的黑色產物用磁鐵進行分離，然后用乙醇和去離子水交替洗滌若干次得到rGO-ZnFe2O4納米酶。最后將rGO-ZnFe2O4納米酶置于真空干燥箱中于45℃干燥，備用。
實施例2
A.首先稱取1.0g石墨粉于研缽中，加入NaCl固體50g，研磨10分鐘后，加水進行溶解、過濾、洗滌，然后除去NaCl。將處理過的石墨粉轉移至圓底燒瓶中，加入23mL濃H2SO4，室溫條件下攪拌8小時。再將圓底燒瓶置于冰水浴中，緩慢加入3.0g KMnO4固體，于35-40℃攪拌30分鐘，再于65-80℃攪拌45分鐘。然后加入46mL水，于98-105℃下繼續攪拌30分鐘。最后，加入140mL水和10mL 30％H2O2終止反應，溶液顏色變為亮黃色。所得到的產品用5％HCl洗滌后，再用超純水洗滌，離心(12000轉/分)，重復此過程至無法通過離心分離為止。然后將得到的黃色懸濁液轉移到透析袋中，于超純水中透析一周至GO溶液為中性為止。最后將該溶液放于培養皿中，90℃干燥，得到GO固體。將所得的GO固體剪碎，備用。
B.將100mg GO，1.08g FeCl3·6H2O和0.272g ZnCl2于50mL乙二醇中，超聲至分散完全使各物質混合均勻，隨后，加入3.6g NaOAc和1.0g聚乙二醇，在60℃水浴中攪拌30分鐘，將所得溶液轉移至高壓反應釜中，200℃下反應10小時。反應結束以后，自然冷卻。待降至室溫時，將最終所得到的黑色產物用磁鐵進行分離，然后用乙醇和去離子水交替洗滌若干次得到rGO-ZnFe2O4。最后將rGO-ZnFe2O4納米酶置于真空干燥箱中于45℃干燥，備用。
實施例3
A.首先稱取1.0g石墨粉于研缽中，加入NaCl固體50g，研磨10分鐘后，加水進行溶解、過濾、洗滌，然后除去NaCl。將處理過的石墨粉轉移至圓底燒瓶中，加入23mL濃H2SO4，室溫條件下攪拌8小時。再將圓底燒瓶置于冰水浴中，緩慢加入3.0g KMnO4固體，于35-40℃攪拌30分鐘，再于65-80℃攪拌45分鐘。然后加入46mL水，于98-105℃下繼續攪拌30分鐘。最后，加入140mL水和10mL 30％H2O2終止反應，溶液顏色變為亮黃色。所得到的產品用5％HCl洗滌后，再用超純水洗滌，離心(12000轉/分)，重復此過程至無法通過離心分離為止。然后將得到的黃色懸濁液轉移到透析袋中，于超純水中透析一周至GO溶液為中性為止。最后將該溶液放于培養皿中，90℃干燥，得到GO固體。將所得的GO固體剪碎，備用。
B.將100mg GO，0.27g FeCl3·6H2O和0.068g ZnCl2于50mL乙二醇中，超聲至分散完全使各物質混合均勻，隨后，加入3.6g NaOAc和1.0g聚乙二醇，在60℃水浴中攪拌30分鐘，將所得溶液轉移至高壓反應釜中，200℃下反應10小時。反應結束以后，自然冷卻。待降至室溫時，將最終所得到的黑色產物用磁鐵進行分離，然后用乙醇和去離子水交替洗滌若干次得到rGO-ZnFe2O4。最后將rGO-ZnFe2O4納米酶置于真空干燥箱中于45℃干燥，備用。
之后使用TEM、XPS、FT-IR等手段對其結構和形貌進行了表征。再對pH值、納米酶用量、溫度、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)用量、H2O2用量、反應時間等進行優化，確定最佳的測定條件，建立測定人體尿液中葡萄糖的可視化方法。
該rGO-ZnFe2O4納米酶可將其制作為試紙或試劑，作為糖尿病患者檢測和預防時使用，通過顯色現象，可以直觀的判斷患者的條件。從而達到醫療目的。
性能對比：
將實施例1所得產物記錄為標準rGO-ZnFe2O4；實施例2所得產物標記為rGO-ZnFe2O42；實施例3所得產物標記為rGO-ZnFe2O41/2。說明書附圖1至說明書附圖6為產品物理性質譜圖。圖8及圖9說明產品最適宜pH值為3—4，使用溫度為40℃—60℃為宜,TMB使用量為200—350μM，H2O2最佳使用量為1—4mM。圖10及圖11中可以看出，產品有著極好的穩定性以及重復利用性。實驗效果中，實施例3中效果最為突出，為最優實施例，FeCl3·6H2O與ZnCl2摩爾比為2:1。
實施例4
rGO-ZnFe2O4納米酶對于糖尿病的檢測
(a)將20μL 1.0mg/mL葡萄糖氧化酶與50μL處理過的尿液樣品在37℃下反應30分鐘；(b)將470μL HAc-NaAc緩沖溶液、55μL 20mM TMB、20μL 5mg/mL rGO-ZnFe2O41/2加入到上述反應溶液中，混合均勻；(c)將上述溶液于50℃條件下反應10分鐘，然后將其從水浴中取出，置于冰水中10分鐘終止反應；(d)通過外加磁場將rGO-ZnFe2O41/2與反應液分離；(5)將上述反應溶液用去離子水稀釋至3.0mL，在652nm處測其吸光度。最后，根據標準曲線計算尿液中葡萄糖的含量。
表1尿液樣品中葡萄糖的測定結果
以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
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