羰基還原酶、突變體及其在制備抗真菌類藥物中間體中的應用的制作方法

文檔序號：12056346閱讀：485來源：國知局

本發明屬于生物工程技術領域，尤其是涉及木糖發酵酵母羰基還原酶及其催化性能提高的突變體，該羰基還原酶及其突變體的編碼基因和氨基酸序列，含有所述編碼基因的重組表達載體和重組表達轉化體，以及利用該羰基還原酶或重組表達轉化體催化潛手性羰基化合物不對稱還原，制備光學純手性醇，特別是催化2-氯-2’,4-二氟苯乙酮和2,2’,4’-三氯苯乙酮不對稱還原以制備光學純抗真菌類藥物中間體(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇和(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇的應用。

背景技術：

(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇和(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇是合成咪康唑、嗌康唑及氟康唑等眾多抗真菌類咪唑藥物的重要手性中間體。這類抗真菌咪唑類藥物合成的手性羥基砌塊的光學純度對藥物的藥效有極其重要的影響。

潛手性羰基化合物的不對稱還原是制備高光學純度手性醇的重要方法。手性醇的獲得主要分為化學法和生物法。在化學方法中，常用硼氫化鈉作為還原劑，在金屬催化劑與相應手性配體配合作用下，催化生成相應的手性醇，但產品光學純度往往不高，并且貴重的手性催化劑以及極端的催化條件限制了工業化的應用。

作為化學催化法強有力的競爭者，生物催化法正在起著越來越重要的作用。2005年，楊立榮等將2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮用硼氫化鈉還原為消旋的2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇，再利用脂肪酶催化動力學轉酯化拆分得到相應的(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇和(S)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇乙酸酯，然后在室溫下將(S)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇乙酸酯水解為(S)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇，ee值分別為90.2％和94.5％。該方法操作步驟復雜，酶法拆分的理論得率僅為50％，并且反應的對映選擇性偏低(CN 1765887B)。2009年，方巖雄等利用面包酵母中的氧化還原酶合成了(S)-2-氯-1-苯基乙醇衍生物，且ee值在97％以上。但是野生型面包酵母中還原酶表達量較低，并且本身含有多種雜酶，反應副產物較多。在所述的方法中面包酵母干細胞的添加量高達120g/L，導致產物的分離比較困難(CN 101503714A)。

專一性不對稱催化還原2-溴-2’,4’-二氯苯乙酮、2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮及2,2’,4’-三氯苯乙酮的還原酶越來越多地被報道。例如，Duming Zhu等人利用醇脫氫酶PFADH成功獲得ee值高達99％的(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇、(R)-2-氯-1-(3’,4’-二氯苯基)乙醇以及(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇，但酶的活性偏低，反應時空產率僅為20g L^-1d^-1(J.Mol.Catal.B:Enzym.2009,56,272-276)。Gotor等人篩選了多種醇脫氫酶(ADH-T,ADH-CP,ADH-A等)，但在眾多酶中僅ADH-T具有較好的活性及對映選擇性，但是酶的底物耐受性差，最高底物濃度僅為6.7g/L(J.Org.Chem.2011,76,2115-2122.)。

綜上所述，在合成光學純(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇、(R)-2-溴-1-(2,4-二氯苯基)乙醇、(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇等抗真菌類咪唑藥物合成中間體的研究中存在許多的不足之處，已知的還原酶存在著催化活性低，底物耐受濃度低以及生產效率不高等問題。因此，需要更好的酶催化劑來滿足催化反應效率高、對映選擇性高、底物濃度高，操作簡單、產物易分離的工業化需求。

技術實現要素：

本發明的目的就是針對現有技術中羰基還原酶的不足，而提供一種木糖發酵酵母CBS 6054羰基還原酶，使用該酶及其突變體催化2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮、2,2’,4’-三氯苯乙酮及其結構類似物的不對稱還原，具有反應底物濃度高、反應條件溫和、環境友好、產率高、產品光學純度高等顯著優點。

本發明提供了木糖發酵酵母菌CBS 6054所表達的羰基還原酶SsCR及羰基還原酶SsCR的突變體、其編碼基因、表達該羰基還原酶及其突變體的重組表達載體和重組轉化體，所述羰基還原酶在催化潛手性羰基化合物不對稱還原制備手性仲醇，特別是(R)-2-氯-1-(3’,4’-二氯苯基)、(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇及(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇的應用。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

本發明第一方面，提供了一種新羰基還原酶SsCR的氨基酸序列，如序列表SEQ ID No.2所示。制備本發明所述羰基還原酶SsCR的方法包括但不限于：1)從木糖發酵酵母菌CBS 6054的細胞中直接提取分離獲得；2)按照本領域常規技術通過所述羰基還原酶編碼基因的異源重組表達來獲得。

本發明第二方面，提供了多種突變體，與母本相比，所述突變體均有活力提高，其中部分突變體熱穩定性也有所提高。

這些突變體氨基酸序列如下：

(1)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸；

(2)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第126位的纈氨酸替換為丙氨酸，第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸；

(3)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸；

(4)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸，第215位的甲硫氨酸替換為亮氨酸；

(5)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸，第130位的絲氨酸替換為甘氨酸；

(6)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第64位的苯丙氨酸替換為亮氨酸，第130位絲氨酸突變為甘氨酸；

(7)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸，第165位的甘氨酸替換為酪氨酸，同時第169位的苯丙氨酸突變為半胱氨酸；

(8)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第64位的苯丙氨酸替換為亮氨酸；

(9)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第64位的苯丙氨酸替換為亮氨酸，第308位賴氨酸突變為精氨酸；

(10)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第64位的苯丙氨酸替換為亮氨酸，第308位賴氨酸突變為精氨酸，第136位的甘氨酸突變為絲氨酸；

(11)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第64位的苯丙氨酸替換為亮氨酸，第308位賴氨酸突變為精氨酸，第130位的絲氨酸突變為甘氨酸；

(12)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第64位的苯丙氨酸替換為亮氨酸，第308位賴氨酸突變為精氨酸，第130位的絲氨酸突變為甘氨酸，第158位的組氨酸突變為天冬氨酸，第290位的賴氨酸突變為精氨酸；

(13)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第64位的苯丙氨酸替換為亮氨酸，第308位賴氨酸突變為精氨酸，第130位的絲氨酸突變為甘氨酸，第32位的絲氨酸突變為亮氨酸，第327位的賴氨酸突變為天冬酰胺；

(14)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第57位的纈氨酸替換為天冬氨酸，第132位的脯氨酸突變為谷氨酸；

(15)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第64位的苯丙氨酸替換為亮氨酸，第308位賴氨酸突變為精氨酸，第130位的絲氨酸突變為甘氨酸，第201位的賴氨酸突變為精氨酸；

(16)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第64位的苯丙氨酸替換為亮氨酸，第308位賴氨酸突變為精氨酸，第130位的絲氨酸突變為甘氨酸，第235位的苯丙氨酸突變為絲氨酸；

(17)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第64位的苯丙氨酸替換為亮氨酸，第308位賴氨酸突變為精氨酸，第130位的絲氨酸突變為甘氨酸，第164位的苯丙氨酸突變為酪氨酸；

(18)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第64位的苯丙氨酸替換為亮氨酸，第308位賴氨酸突變為精氨酸，第130位的絲氨酸突變為甘氨酸，第243位的賴氨酸突變為精氨酸；

(19)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸，第160位的纈氨酸替換為天冬氨酸；

(20)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第126位的纈氨酸替換為異亮氨酸，第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸；

(21)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸，第158位的組氨酸替換為天冬氨酸；

(22)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位的纈氨酸替換為天冬氨酸，第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸；

(23)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸，第165位的甘氨酸替換為酪氨酸；

(24)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸，第169位的苯丙氨酸替換為半胱氨酸；

(25)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸，第160位的纈氨酸替換為丙氨酸；

(26)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為丙氨酸，同時第57位的纈氨酸替換為丙氨酸，第182位的賴氨酸突變為谷氨酸；

(27)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸，第158位的組氨酸替換為脯氨酸；

(28)將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸，第168位的谷氨酰胺替換為亮氨酸。

本發明中的羰基還原酶SsCR的突變體的獲得方法為隨機突變。

本發明第三方面，提供了羰基還原酶的編碼基因，以及含有所述編碼基因的重組表達載體。所述的重組表達載體可通過本領域常規方法將本發明還原酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構建而成。所述的載體可為本領域常規的各種質粒載體，優選質粒pET28a。較佳的，可通過下述方法制得本發明的重組表達載體：將通過PCR擴增所得的還原酶基因產物用限制性內切酶EcoR I和Xho I雙酶切，然后與同樣用EcoR I和Xho I雙酶切的質粒pET28a混合，經T4 DNA連接酶連接，形成含有本發明所述還原酶基因的重組表達載體。

本發明第四方面，提供一種包含本發明還原酶基因或其重組表達載體的重組表達轉化體。可通過將已經構建好的重組表達載體轉化至宿主細胞來制備重組表達轉化體。所述宿主細胞可以是本領域的各種常規宿主細胞，要求是所述的重組表達載體能夠穩定地自行復制并能通過誘導劑誘導后有效表達。本發明首選大腸桿菌作為宿主細胞，更優選大腸桿菌(E.coli)DH5α用于高效復制重組表達載體，優選大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)用于重組表達載體高效表達目標蛋白。

本發明第五方面，提供一種重組羰基還原酶及其突變體的制備方法，其包括如下步驟：培養本發明的重組表達轉化體，獲得重組羰基還原酶。其中，培養所述重組表達轉化體所用的培養基可選自本領域的常規培養基，前提是可使轉化體生長并能生產本發明所提到的還原酶。對于所述的宿主細胞，優選LB培養基：氯化鈉10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，pH 6.5-7.0。培養條件沒有明確的限制，前提是轉化體能夠生長并且產生所述的還原酶，優選的方法如下：將已經成功導入重組表達載體的大腸桿菌(E.coli BL21(DE3))按常規接種量接種至含卡那霉素的LB培養基中，在37℃下培養，當培養液的OD₆₀₀達到0.6左右時，加入終濃度為0.1～1.0mmol/L的IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導后在16℃培養24h即可得到所需的重組還原酶蛋白。

本發明第六方面，還提供了利用所述相關重組表達轉化體的培養物或所得羰基還原酶在不對稱還原潛手性羰基化合物中的應用，其中所述潛手性羰基化合物可選自如下通式：

其中，化合物1：R₁為-H，R₂為-Cl，R₃為-H，R₄為-H；

化合物2：R₁為-H，R₂為-H，R₃為-CH₃，R₄為-H；

化合物3：R₁為-CH₂CH₂Cl，R₂為-H，R₃為-H，R₄為-H；

化合物4：R₁為-CH₂Cl，R₂為-H，R₃為-Cl，R₄為-Cl；

化合物5：R₁為-CH₂Cl，R₂為-Cl，R₃為-H，R₄為-Cl；

化合物6：R₁為-CH₂Cl，R₂為-F，R₃為-H，R₄為-F。

具體的，所述化合物4為2,3’,4’-三氯苯乙酮,化合物5為2,2’,4’-三氯苯乙酮，化合物6為2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮。

在前述應用中，潛手性羰基化合物的濃度可為2～500mmol/L，所述羰基還原酶的用量可選為50～200U/mmol潛手性羰基化合物。反應中所需的NADPH或NADP⁺的用量為0～10mM。反應過程中可利用葡萄糖作為輔底物，通過葡萄糖脫氫酶催化實現宿主細胞內NADPH的輔酶循環，所述葡萄糖脫氫酶的用量可為50～200U/mmol潛手性羰基化合物，所述葡萄糖的用量可為0.18～0.27g/mmol潛手性羰基化合物。不對稱還原過程中所需的磷酸鹽緩沖液為本領域常規磷酸鹽緩沖液，如磷酸鈉緩沖液，其濃度較佳為50～100mmol/L。所述的不對稱還原反應是在振蕩或攪拌條件下進行。所述的不對稱還原反應的溫度為20～40℃，優選30℃。所述的不對稱還原反應的時間以底物完全反應完或反應自行終止的時間為準，優選反應時間小于24h。

與現有技術相比，本發明的改善進步效果在于：本發明提供了一種新的羰基還原酶，高效催化2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮、2,2’,4’-三氯苯乙酮及其結構類似物的不對稱還原，制備光學純的(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇、(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇及其結構類似物，將該羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶偶聯實現輔酶原位再生，減少輔酶用量。所述的羰基還原酶能夠在催化濃度高達500mM的疏水性芳香酮底物時，實現99％以上的轉化率，產物的光學純度高達99.9％。相對于其他的疏水性芳香酮底物不對稱還原方法，本發明具有羰基還原酶催化活性高，耐受高濃度底物，反應產物光學純度高，反應過程中可以無需額外添加輔酶等優勢，本發明羰基還原酶易于獲得，反應條件溫和，環境友好，理論得率高達100％，反應過程簡單高效，易于操作，產物易于提取，因此具有很好的工業應用前景。

附圖說明

圖1為重組質粒pET28a-SsCR構建示意圖。

具體實施方式

本發明通過分析生物信息學的方法，分析預測可能對2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮具有明顯還原活性的羰基還原酶的基因，并將其分選出來進行克隆表達，驗證其功能。采用這種方法，從木糖發酵酵母菌中克隆獲得一個高效催化2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮和2,2’,4’-三氯苯乙酮不對稱還原，制備獲得抗真菌類咪唑藥物合成中間體(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇和(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇的羰基還原酶基因，重組表達的羰基還原酶催化2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮和2,2’,4’-三氯苯乙酮的還原，產物的ee值高達99.9％，該羰基還原酶命名為SsCR，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

編碼本發明所述羰基還原酶SsCR的核酸分子的較佳來源有：以木糖發酵酵母菌(Scheffersomyces stipitis)CBS 6054的基因組DNA為模板，采用本領域常規技術方法(如聚合酶鏈反應PCR)，獲得編碼所述羰基還原酶SsCR的完整核酸分子。其中涉及的合成引物，優選的如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示：

正向引物SEQ ID No.3：CCG GAATTC ATGACTACCTCAGTTTTCGT

反向引物SEQ ID No.4：CCG CTCGAG TTAACCTTGTACCTTCAAAA

其中，正向引物中以下劃線標出的堿基序列為EcoR I酶切位點，反向引物中以下劃線標出的堿基序列為Xho I酶切位點。然后以木糖發酵酵母菌CBS 6054的基因組DNA為模板，利用聚合酶鏈式反應(PCR)進行基因擴增，獲得羰基還原酶SsCR全長基因的PCR產物，其堿基序列如SEQ ID No.1所示，全長1005bp，其起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，序列中無內含子，編碼序列(CDS)從第1個堿基起至第1005個堿基，所編碼的蛋白質的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

采用易錯PCR的方法對重組酶SsCR進行了隨機突變改造，通過一個氨基酸的改變獲得的突變體SsCR_M1的活力是SEQ ID No.2活力的2倍，其氨基酸序列為：將如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替換為纈氨酸。在此基礎上，進一步通過大規模易錯PCR突變以及高通量篩選，獲得一批酶活性顯著提高的突變體。這些突變體與母本相比，其活力提高了2～8倍。

本發明所述的羰基還原酶SsCR及其突變體可由相應的核酸序列編碼。包含所述編碼基因的核酸分子包括但不限于：從生物體內提取天然存在的編碼羰基還原酶SsCR的核酸分子，或通過基因克隆技術對已有核酸片段進行基因工程操作制得的編碼羰基還原酶SsCR及其突變體的核酸分子，或通過人工合成方法得到的編碼所述羰基還原酶SsCR及其突變體的核酸分子。術語“核酸”和“核酸分子”在本文中可互換使用，指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。

本發明的重組表達載體可通過下述示例性方法制得：將通過PCR擴增所得的包含羰基還原酶SsCR基因(如SEQ ID No.1所示)的PCR產物用限制性內切酶EcoR I和Xho I雙酶切，形成互補的粘性末端，同時將表達載體pET28a用限制性內切酶EcoR I和Xho I雙酶切，經T4 DNA連接酶連接經過酶切的基因片段和表達載體生成含有本發明的羰基還原酶基因的重組表達質粒pET28a-SsCR，如圖1所示。將所述重組表達質粒pET28a-SsCR轉化至大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)中，即可獲得本發明優選的重組表達羰基還原酶SsCR的基因工程菌株，即大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a-SsCR。采用類似的方法，可以很方便地獲得表達本發明所述的羰基還原酶SsCR的各種突變體的基因工程菌株。

當所述重組表達轉化體是大腸桿菌時，優選LB培養基進行重組表達轉化體的培養以及誘導產酶，該培養基含有蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培養方法和培養條件沒有特殊的限制，可以根據宿主細胞類型和培養方法等因素的不同按本領域普通知識進行適當的選擇，只要使轉化體能夠生長并高效產生本發明所述羰基還原酶即可。重組表達轉化體的培養和羰基還原酶的產生，可優選下述方法：將本發明涉及的重組大腸桿菌(優選E.coli BL21(DE3))接種至含卡那霉素的LB培養基中培養，當培養液的光密度OD₆₀₀達到0.5～0.7(優選0.6)時，在終濃度為0.1～1.0mmol/L(優選0.2mmol/L)的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導下，即可高效表達本發明的重組羰基還原酶。

本發明中，羰基還原酶的收集與儲存方法如下：將重組大腸桿菌的發酵液(包括搖瓶培養以及發酵罐培養發酵液)，在高速離心機以15,000rpm離心10min，收集重組大腸桿菌細胞。細胞可以用pH 6.5的PBS緩沖液(100mM)重懸，在冰水浴的條件下進行超聲破碎(超聲破碎儀的設定功率為400W，工作4s，間歇6s，共循環99次)。破碎液在4℃低溫離心機里15000rpm離心40min，取上清液進行活力測定以及蛋白純化。另外所收集的細胞在-80℃下冷凍12h后，用真空冷凍干燥機低溫干燥20h，即可得到凍干細胞，儲存在4℃冰箱內。凍干細胞保留了胞內羰基還原酶和輔酶的活性，在進行酶促反應時易于定量和添加。

本發明中所述羰基還原酶的活力可用如下方法測定：將含2mmol/L 2,2’,4’-三氯苯乙酮和0.1mmol/L NADPH的1mL反應體系(100mmol/L PBS緩沖液，pH 6.5)預熱至30℃，然后加入適量的羰基還原酶，30℃保溫反應，在分光光度計上檢測340nm處NADPH的吸光度變化，記錄1分鐘內吸光度的變化值。

所述葡萄糖脫氫酶的活力可用如下方法測定：將含10mmol/L葡萄糖、1mmol/L NADP⁺的1mL反應體系(100mmol/L PBS緩沖液，pH 6.5)預熱至30℃，然后加入適量葡萄糖脫氫酶。30℃條件下，在分光光度計比色皿中保溫反應，并原位檢測340nm處NADPH吸光度的變化，記錄1分鐘內吸光度的變化值。

按上述方法測定所述羰基還原酶的活力時，可用下式計算得到酶活力：

酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×1)

式中，EW為1分鐘內340nm處吸光度的變化；V為反應液的體積，單位為ml；6220為NADPH的摩爾消光系數，單位為L/(mol·cm)；1為光程距離，單位為cm。對于羰基還原酶而言，1個活性單位對應于上述條件下每分鐘氧化1μmol NADPH所需的酶量。

本發明還公開了所述羰基還原酶SsCR及其突變體在催化潛手性羰基化合物不對稱還原生成抗真菌類咪唑藥物合成中間體及其他光學純手性仲醇中的應用。所述的應用包括以所述羰基還原酶或重組表達轉化體作為催化劑，在pH 6.0～7.5(例如pH 6.5)的緩沖液中，加入待轉化的潛手性羰基化合物、葡萄糖以及葡萄糖脫氫酶，經過適當時間的生物轉化，即可生成光學純的手性羥基化合物，例如，(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇、(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇及其結構類似物。

本發明中所用的緩沖液為本領域常規緩沖液。在一種實施方式中，所述緩沖液為pH 6.5的PBS緩沖液，其他可用的緩沖液包括Tris-HCl緩沖液、磷酸鉀緩沖液，只要其能滿足pH 6.0～7.5的緩沖范圍即可。緩沖液的濃度范圍可為10～200mM，優選為50～100mM。

提及化合物時，術語“化學純”是指與不需要的雜質相比，化合物占總量的85％或更高(例如，90％、95％或更高)的純化物。本發明中，光學純度一般以術語“對映體過量”或符號“ee”表示，該術語是指混合物中一種對映體相對于另一種的過量。除非另有說明，說明書中涉及純度或ee值時，“>99％”表示殘余底物或某異構體含量低于檢測下限而無法準確測定。本文中，ee值的分析可通過將提取后的產物進行手性氣相色譜分析來實現，示例性的氣相色譜條件為：采用手性氣相柱CP-Chirasil-DEX CB，以氮氣為載氣，進樣口溫度280℃，檢測器溫度280℃，柱溫為梯度升溫：150℃保持6min，20℃/min升至200℃，保持10min。

所述的不對稱還原反應較佳地在適度振蕩或攪拌條件下進行。反應溫度可選20～40℃，底物濃度可選為2～500mmol/L，羰基還原酶用量可選地為50～200U酶/mmol底物；葡萄糖脫氫酶用量可選地為50～200U酶/mmol底物；葡萄糖用量可選為0.18～0.27g/mmol底物；過程中NADPH或NADP⁺的添加量為0～10mmol/L。反應中，間歇取樣測定反應轉化率，反應時間以轉化率達到99％以上為準，一般為1～24小時。轉化率可采用氣相色譜法來分析，例如，利用手性氣相柱CP-Chirasil-DEX CB，以氮氣為載氣，進樣口溫度280℃，檢測器溫度280℃，柱溫為梯度升溫：150℃保持6min，20℃/min升至200℃，保持10min。

待不對稱還原反應結束后，反應液用等量水不溶性有機溶劑，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、異丙醚、甲基叔丁基醚，進行萃取，重復萃取兩次，合并萃取液，加入無水硫酸鈉干燥過夜。旋轉蒸發除去溶劑，即得光學純手性產物的粗提物。粗提物通過常規方法如減壓蒸餾、重結晶等進一步純化即可得高度化學純和光學純的產物。

本發明提供的木糖發酵酵母CBS 6054羰基還原酶SsCR及突變體，可用于高效催化2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮、2,2’,4’-三氯苯乙酮及其結構類似物的不對稱還原，生成光學純(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇及(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇。利用該酶法催化技術，底物濃度達500mmol/L，轉化率可超過99％，產物ee值高于99.9％。相對于其他(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇及(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇的不對稱還原制備方法，本發明具有產物濃度高和光學純度高的優勢，有利于實現(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇及(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇等抗真菌類咪唑藥物合成中間體的高效、低成本生產，具有工業化應用前景。

前述各反應或檢測條件，可根據本領域常識進行組合或更改，并可用通過實驗得到驗證。以下實施例舉例說明了本發明示例性的實施方式，來幫助本領域技術人員理解本申請的其它目標、特征、優點和各方面。應當理解，雖然表明了本申請的優選實施方式，但以下描述和具體實施例僅是為了說明而給出，而不對本發明的范圍構成限制。本發明的范圍根據所附權利要求書確定。

除非另有說明，下列實施例中的具體實驗按照本領域常規方法和條件進行，或遵照商品說明書。

下列實施例中的材料來源為：

木糖發酵酵母CBS 6054購自荷蘭微生物菌種保藏中心；

表達質粒pET28a購自Novagen公司；

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受態細胞、2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。

限制性內切酶EcoR I和Xho I均為Takara公司的市售產品。

實施例1 羰基還原酶SsCR的基因克隆

根據羰基還原酶SsCR的開放閱讀框，設計上、下游引物如下：

上游引物SEQ ID No.3：

CCG GAATTC ATGACTACCTCAGTTTTCGT

下游引物SEQ ID No.4：

CCG CTCGAG TTAACCTTGTACCTTCAAAA

其中，上游引物下劃線部分為EcoR I酶切位點，下游引物下劃線部分為Xho I酶切位點。

以木糖發酵酵母CBS 6054的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR體系為：2×Taq PCR MasterMix 25μl，上游引物和下游引物(10ng/μl)各2.5μl，基因組DNA(100ng/μl)1μl和ddH₂O 19μl。PCR擴增程序為：95℃預變性5分鐘后進行32次如下循環：94℃變性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分鐘；最后72℃再延伸10分鐘。PCR擴增產物進行凝膠電泳純化后，用DNA回收試劑盒回收目的片段。經過DNA測序，該序列中編碼的開放閱讀框全長1005bp，其堿基序列如SEQ ID No.1所示。

實施例2 羰基還原酶重組表達質粒和重組表達轉化體的制備

如圖1所示，將實施例1中PCR擴增所得的羰基還原酶目的片段以及pET 28a空質粒同時用限制性內切酶EcoR I和Xho I雙酶切過夜，然后經瓊脂糖凝膠電泳純化、DNA試劑盒回收。將回收的經酶切目的片段和空質粒載體在T4 DNA連接酶的作用下，于4℃連接12小時，得到重組質粒pET28a-SsCR。

將所得重組質粒轉化至E.coli DH 5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB培養基平板上，37℃培養8小時，對長出來的菌落進行菌落PCR驗證，挑取菌落PCR擴增出長度約1000bp的目的條帶的陽性克隆。經測序驗證后，提取相應的質粒，進一步轉化至E.coli BL21，挑取陽性克隆，即獲得重組表達轉化體E.coli BL21(DE3)/pET28a-SsCR。

實施例3 羰基還原酶SsCR突變體構建

采用易錯PCR技術構建羰基還原酶SsCR的隨機突變庫：以pET28a_SsCR作為模板，以For_EcoR I和Rev_Xho I為引物，用Taq DNA聚合酶進行易錯PCR。為了獲得合適的突變率，選擇一系列不同的MnCl₂濃度梯度(100μM～300μM的MnCl₂)構建突變庫。PCR反應條件如下：總體積為50μL的PCR反應體系中，加入模板0.5～20ng，5μL 10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)，5μL dNTP(各2.0mM)，5μL MnCl₂(1mM)，一對突變引物各2μL(10μM)，0.5μL Taq DNA polymerase，加滅菌蒸餾水至50μL。PCR反應程序：(1)95℃變性3min；(2)94℃變性10sec，(3)60℃退火30sec，(4)72℃延伸90sec，步驟(2)～(4)共進行30個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存產物。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析驗證后切膠純化回收，對回收之后的目的基因及pET 28a用限制性內切酶EcoRI和XhoI在37℃雙酶切12h。雙酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分析驗證后切膠純化回收，用T4 DNA連接酶將得到的線性化pET 28a質粒與目的基因片段置于16℃進行連接。將連接產物轉入E.coli BL21(DE3)感受態細胞并涂布于含有Kan抗生素的平板中，置于37℃培養箱中靜置培養約12h。將所得到的單克隆菌落挑取到96孔深孔板中進行培養，對表達的蛋白進行高通量活力篩選，對活性較高的突變體進行純化表征，對相應的基因進行測序。

表1提供本發明公開的具有相關活性的特定序列的羰基還原酶SsCR突變體的列表。在下表中，序列標號分別指表1后面的一系列序列，在活性列中，一個加號“+”表示突變體蛋白比由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列組成的蛋白質的比活力提高了0.1～2倍；兩個加號“++”表示突變體蛋白比SEQ ID No.2所示氨基酸序列組成的蛋白質的比活力提高了2～4倍。三個加號“+++“表示突變體蛋白比SEQ ID No.2所示氨基酸序列組成的蛋白質的比活力提高了4～9倍。在熱穩定性列中，一個加號“+”對應于突變體蛋白的T₅₀¹⁵值提高0℃～3℃；兩個加號“++”表示突變體蛋白比SEQ ID No.2所示氨基酸序列組成的蛋白質的T₅₀¹⁵值提高3℃～6℃；三個加號“+++“表示突變體蛋白比SEQ ID No.2所示氨基酸序列組成的蛋白質的T₅₀¹⁵值提高6℃～9℃。

表1：羰基還原酶SsCR突變體序列和相應的活性改進列表

其氨基酸序列分別如下：