CYP2C19基因多態性檢測引物、探針及試劑盒的制作方法

本發明涉及基因多態性檢測技術領域，具體涉及CYP2C19基因多態性檢測引物、探針及試劑盒。

背景技術：

氯吡格雷英文名稱Clopidogrel，藥品名稱波立維，化學式為C₁₆H₁₆C_lNO₂S。該藥品為口服抗血小板藥物，可用于防治心肌梗死、缺血性腦血栓、閉塞性脈管炎、動脈粥樣硬化及血栓栓塞引起的并發癥。罹患中風、心肌梗死或確診為外周動脈疾病的患者，用藥后可減少動脈粥樣硬化的發生；經皮冠狀動脈介入治療后的病人，應用氯吡格雷可以降低血栓形成的風險。該藥品經體內P450酶生物轉化后可與血小板表面ADP受體P2Y12發生不可逆的結合，從而抑制ADP誘導的血小板的聚集，達到抗凝血的功效。

在臨床工作中發現，并非所有患者都能在應用氯吡咯雷中獲得預期效果，表現為心血管不良事件的發生，這個現象稱為“氯吡咯雷抵抗”。另外，服用氯吡咯雷也存在出血的風險，嚴重出血事件的發生率為1.4％。氯吡格雷抵抗主要原因是CYP2C19基因突變致使氯吡格雷的活性代謝產物減少。2009年1月，哈佛大學JessicaL.M.等在《新英格蘭醫學雜志》上發表了最新臨床研究結果，證實CYP2C19基因突變所導致的弱代謝個體，其栓塞重新形成的風險增加，心腦血管事件的發生風險增加，病死率升高。目前，公認的與氯吡咯雷代謝減弱相關的CYP2C19基因多態性主要包括CYP2C19*2和CYP2C19*3，與氯吡咯雷代謝增強相關的CYP2C19基因多態性則為CYP2C19*17。基于以上原因，氯吡格雷遭遇了美國食品藥品監督管理局(FDA)的黑框警告，警告內容為“建議服用氯吡格雷的患者做CYP2C19基因檢測”。

目前，針對CYP2C19基因多態性檢測的方法有多種，主要包括DNA測序法、高分辨率溶解曲線法和液相芯片法。DNA測序法雖然是金標準，但步驟繁瑣，耗時長。高分辨率溶解曲線法，快速，簡便，經濟實用，但對儀器的需求較高，絕大部分的實時熒光定量PCR儀無法適用。液相芯片法操作過程復雜，且容易污染，假陽性率高。因此需要建立一種快速操作方便，快速，特異性好、靈敏的基因檢測方法。

技術實現要素：

為了克服現有檢測技術的上述不足，本發明在Taqman探針法的基礎上提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、操作方法簡單的CYP2C19基因CYP2C19*2(G681A)、CYP2C19*3(G836A)和CYP2C19*17(C-806T)多態性位點的引物和探針，本發明的另一目的是提供包括檢測以上多態性位點的試劑盒，以及檢測方法。

本發明提供的檢測CYP2C19基因多態性的引物和探針，用于檢測第681位點、第836位點以及第806位點基因多態性，其具體核苷酸序列如下：

(1)檢測CYP2C19*2(G681A)基因多態性的引物和探針：

G681A位點突變型ARMS上游引物：

5’-CCCACTATCATTGATTATTTCACA-3’(SEQ ID NO.1)，

G681A位點野生型ARMS上游引物：

5’-TTCCCACTATCATTGATTATTGCCGG-3’(SEQ ID NO.2)，

G681A位點公用的下游引物：5’-CCATTTTGATCAGGAAGCAATC-3’(SEQ ID NO.3)，

G681A位點公用的探針：5’-CCTTGCTTTTATGG-3’(SEQ ID NO.4)；

(2)檢測CYP2C19*3(G836A)基因多態性的引物和探針：

G836A位點突變型ARMS上游引物：

5’-GATTGTAAGCACCACCTGA-3’(SEQ ID NO.5)，

G836A位點野生型ARMS上游引物：

5’-GATTGTAAGCACCCACTGG-3’(SEQ ID NO.6)，

G836A位點公用的下游引物：5’-CTAGGCAAGACTGTAGTATTC-3’(SEQ ID NO.7)，

G836A位點公用的探針：5’-CCAGGTAAGGCCAAGT-3’(SEQ ID NO.8)；

(3)檢測CYP2C19*17(C-806T)基因多態性的引物和探針：

C-806T位點突變型ARMS上游引物：

5’-GTGTCTTCTGTTCTCAACGT-3’(SEQ ID NO.9)，

C-806T位點野生型ARMS上游引物：

5’-GTGTCTTCTGTTCTCAAGGC-3’(SEQ ID NO.10)，

C-806T位點公用的下游引物：5’-CTCATAGCTGGCAGAACTGG-3’(SEQ ID NO.11)，

C-806T位點公用的探針：5’-CGCCACGATGGGCATC-3’(SEQ ID NO.12)；

所述探針均為MGB探針，探針核苷酸序列5’端標記熒光報告基團，3’端標記熒光淬滅基團。

優選地，上述檢測CYP2C19基因多態性的引物和探針，所述熒光你報告基團為FAM。

本發明還提供了一種CYP2C19基因多態性檢測試劑盒，包括以上任一所述的檢測CYP2C19基因多態性的引物和探針。

該試劑盒針對不同基因位點，分別采用上述設計的野生型和突變型ARMS引物和Taqman-MGB探針，結合熒光定量PCR反應，對從人外周血中提取的基因組DNA進行檢測，一次性在一條6聯PCR反應條上實現對CYP2C19*2(G681A)、CYP2C19*3(G836A)和CYP2C19*17(C-806T)基因多態性進行檢測，通過實時熒光PCR儀上收集信號，計算野生型和突變型的△Ct值來確定樣本DNA的基因型，準確度好，操作簡單方便。

優選地，所述CYP2C19基因多態性檢測試劑盒，還包括一組內控基因的檢測引物和探針，具體核苷酸序列如下：

上游引物：5’-GGAAAGTGATATTTTGGAGAA-3’(SEQ ID NO.13)，

下游引物：5’-CCATTTTGATCAGGAAGCAA-3’(SEQ ID NO.14)，

內控探針：5’-CACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGAC-3’(SEQ ID NO.15)；

所述內控探針為Taqman探針，探針核苷酸序列的5’端標記熒光報告基團，3’端標記熒光淬滅基團，且熒光報告基團不同于權利要求1所述的MGB探針。

優選地，上述CYP2C19基因多態性檢測試劑盒，內控探針的核苷酸序列5’端標記的熒光報告基團為JOE，3’端標記的熒光淬滅基團為BHQ1。

優選地，所述CYP2C19基因多態性檢測試劑盒，還包括PCR反應液，所述PCR反應液包括dNTPs、PCR緩沖液、Fast Advanced Master Mix、礦物油和超純水。

優選地，所述CYP2C19基因多態性檢測試劑盒，還包括非模板對照和陽性對照。

本發明還提供了上述CYP2C19基因多態性檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

(1)提取待檢測樣品中的DNA；

(2)用權利要求1所述的檢測CYP2C19基因多態性的引物和探針，每個基因型的檢測引物和探針對應一個反應體系，每個反應體系里均含有內控引物和探針，每個反應體系均使用提取的DNA作為模板，進行熒光定量PCR；同時設置非模板對照和陽性對照；

(3)檢測結果分析：

在非模板對照FAM及JOE信號不起線，或Ct>28；陽性對照FAM及JOE信號Ct值≤25；待檢測樣本產生的JOE信號Ct值≤25的情況下，代表擴增正常，按照以下標準判斷基因型：

其中，Ct₁為CYP2C19*2G基因型反應體系的FAM信號Ct值，Ct₂為CYP2C19*2A基因型反應體系的FAM信號Ct值，Ct₃為CYP2C19*3G基因型反應體系的FAM信號Ct值，Ct₄為CYP2C19*3A基因型反應體系的FAM信號Ct值，Ct₅為CYP2C19*17C基因型反應體系的FAM信號Ct值，Ct₆為CYP2C19*17T基因型反應體系的FAM信號Ct值。

本發明具有以下有益效果：

本發明經過大量試驗、研究和分析成功研究出能夠用于快速、靈敏、有效的檢測CYP2C19基因多態性檢測引物、探針和試劑盒。利用這個試劑盒可以檢測出CYP2C19*2(G681A)、CYP2C19*3(G836A)和CYP2C19*17(C-806T)三個位點的基因多態性情況。

與現有技術相比，本發明運用ARMS引物區分野生型和突變型基因，有如下有益效果和顯著進步：

(1)靈敏度高，可以準確檢出低至1ng的基因組DNA。對于保存時間過長，提取濃度很低的樣本能準確檢出。

(2)特異性強，對于高至200ng及以上的基因組DNA不會出現非特異性的結果。

(3)成本低，ARMS分型法相對于Taqman探針分型法，不僅能保留Taqman的高靈敏度和高特異性，而且還能節約成本。

(4)操作簡單，檢測速度快，整個檢測過程只需要120分鐘。

(5)應用Fast Advanced Master Mix預混在反應體系中，減少了酶與樣本混合的步驟，減少了樣本的污染，避免了氣溶膠污染引起的假陽性。

總之，本發明涉及的CYP2C19基因多態性檢測試劑盒適用于臨床多種樣本類型選擇，具有特異性強，靈敏度高，實驗周期短，操作簡單，成本低等顯著優點。

附圖說明

圖1是實施例3中樣本1第1、2孔擴增曲線(CYP2C19*2 G/A)；

圖2是實施例3中樣本1第3、4孔擴增曲線(CYP2C19*3 G/G)；

圖3是實施例3中樣本1第5、6孔擴增曲線(CYP2C19*17 C/C)；

圖4是實施例3中樣本2第1、2孔擴增曲線(CYP2C19*2 G/A)；

圖5是實施例3中樣本2第3、4孔擴增曲線(CYP2C19*3 G/A)；

圖6是實施例3中樣本2第5、6孔擴增曲線(CYP2C19*17 C/C)。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好地理解本發明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。

實施例1：試劑盒組成

本發明所述的檢測試劑盒組成如下表。

注：Fast Advanced Master Mix(簡稱AB premix)，購自美國應用生物系統公司；10×buffer(PCR緩沖液，含Mg²⁺等)購自寶生物工程(大連)有限公司。試劑盒中，內控探針的核苷酸序列5’端標記的熒光報告基團為JOE，3’端標記的熒光淬滅基團為BHQ1。檢測探針均為MGB探針，探針核苷酸序列5’端標記熒光報告基團FAM，3’端標記熒光淬滅基團。

實施例2：樣本基因組DNA的提取

本實施例中收集人體全血樣本，從中提取基因組DNA。

從EDTA抗凝血中提取基因組DNA，并對其進行定量，作為PCR檢測的模板。采用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒，按照說明進行，具體詳述如下：

1、處理血液材料：

(1)當血液樣品體積小于200μL時，可加緩沖液GS補足體積至200μL，再進行下一步實驗(如血液樣品體積為200μL，可直接進行下一步實驗，不需加入GS)。

(2)當血液樣品體積超過200μL時，需用細胞裂解液CL處理，具體步驟如下：在樣品中加入1～2.5倍體積的細胞裂解液CL，顛倒混勻，10,000rpm(～11,500×g)離心1min，吸去上清，留下細胞核沉淀(如果裂解不徹底，可重復以上步驟一次)，向離心收集到的細胞核沉淀中加200μL緩沖液GS，振蕩至徹底混勻。

2、加入20μL roteinase K溶液，混勻。

3、加200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，56℃放置10min，其間顛倒混勻數次，溶液應變清亮。

4、加200μL無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。

5、將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

6、向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

7、向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

8、重復操作步驟7。

9、12,000rpm(～13,400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

10、將吸附柱CB3轉入1.5ml離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200μL洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)離心2min，將溶液收集到離心管中。

11、定量

將提取的DNA用紫外分光光度計進行定量，稀釋DNA濃度到1ng/μL。

實施例3：樣本基因組DNA的檢測

本實施例采用實施例1中所列舉的引物、探針組合來擴增實施例2所提取的基因組DNA樣品。

檢測CYP2C19基因多態性的反應體系組成：

10×buffer(Mg²⁺Plus)：4～8μL，

dNTPs：50～250μM(each)，

各條引物：150～300nM，

各條探針：50～200nM，

FastAdvanced Master Mix：6～12μL，

模板：10μL，

總體積：40μL。

PCR反應條件設置：

檢測方法如下：

1、每次PCR反應中，同時進行非模板對照(No Template Control；NTC)、陽性對照和待測樣本的檢測。

2、將陽性對照取出解凍后震蕩混勻，并離心30sec。

3、將6聯PCR反應條取出解凍后離心30sec，防止反應液在開蓋時濺出。

4、將ddH₂O(NTC)、實施例1中提取的DNA樣本、陽性對照分別加入6聯PCR反應條，每孔10μL。

5、將以上6聯PCR反應條蓋好管蓋于離心機上離心30sec，確保管壁上不沾有液滴。

6、將6聯PCR反應條放于實時PCR儀器中，用預設的反應程序進行PCR擴增。

檢測結果分析：

根據熒光定量PCR擴增儀Ct值分析檢測結果：以非模板對照(NTC)和陽性對照(STD)FAM及JOE信號Ct值作為實驗數據是否有效的判定標準(非模板對照FAM及JOE信號不起線，或Ct>28；陽性對照FAM及JOE信號Ct值≤25，體系性能良好，結果有效)；以待測樣本JOE信號Ct值作為PCR反應是否成功的判定標準(JOE信號Ct值≤25，擴增正常)，以待測樣本每組SNP位點檢測孔FAM信號Ct值的差值作為判斷標準。

注：Ct₁～Ct₆分別表示第1到第6孔的FAM信號Ct值。其中第1、2孔為一組，3、4孔為一組，5、6孔為一組；分別計算三組Ct值的差值。當ct值為Undetermined(無擴增曲線)時，該孔的Ct值記為∞。

附圖1～3中，Ct₂-Ct₁＝-0.39，Ct₄-Ct₃＝∞,Ct₆-Ct₅＝∞。結果顯示樣本1為CYP2C19*2雜合型(G/A)，CYP2C19*3純野生型(G/G),CYP2C19*17純野生型(C/C)。

附圖4～6中，Ct₂-Ct₁＝-0.44，Ct₄-Ct₃＝0.2,Ct₆-Ct₅＝17.81。結果顯示樣本2為CYP2C19*2雜合型(G/A)，CYP2C19*3雜合型(G/A)，CYP2C19*17純野生型(C/C)。

以上所述實施例僅是為充分說明本發明而所舉的較佳的實施例，本發明的保護范圍不限于此。本技術領域的技術人員在本發明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發明的保護范圍之內。本發明的保護范圍以權利要求書為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢海吉力生物科技有限公司

<120> CYP2C19基因多態性檢測引物、探針及試劑盒

<130> WH1610026-1

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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cccactatca ttgattattt caca 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccattttgat caggaagcaa tc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ccttgctttt atgg 14

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<212> DNA

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gattgtaagc accacctga 19

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<212> DNA

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<400> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caccaagaat cgatggacat caacaaccct cgggac 36