本發明屬于抗蟲轉基因水稻Bt63的檢測技術，尤其涉及抗蟲轉基因水稻Bt63的現場定量檢測技術，具體為米或米制品中是否含有轉基因水稻Bt63的檢測法。
背景技術：
：近年來，全球轉基因作物的商業化迅猛發展，種植面積由1996年的170萬公頃增加至2014年的1.8億公頃，19年中增加了100多倍。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在我國糧食生產中占有舉足輕重的地位，轉基因水稻研發進展也較為迅速，已經有多個轉基因水稻優良品系進入環境釋放階段，申請商業化種植。與此同時，轉基因技術對環境和食品安全的潛在風險已引起全球的廣泛關注，國際貿易糾紛時有發生。2012年初，歐盟委員會發布了《對中國出口大米制品中含有轉基因成分采取緊急措施的決定》，歐盟將對中國25種米制品采取強制性轉基因成分檢測，并依據檢測結果采取退貨和銷毀處理措施，中國官方必須在向歐盟出口前提交米制品非轉基因證明的檢驗報告，表明是否含有轉基因成分。2006年以來，已有法國、德國、意大利和奧地利等7個國家因為轉基因大米污染對我國出口米制品采取了拒絕入境或撤架、召回等措施。另一方面，目前公眾關注的焦點已從“是否是轉基因”轉移到“含有哪些轉基因成分及各自的含量”上來，為滿足公眾知情權、管理水平和檢測技術能力的需求，許多國家紛紛出臺了轉基因限量規定，如歐盟規定轉基因作物的成分超過0.9％，必須進行標識；而日本的現行標準為5％；我國目前的標準最為嚴格，對轉基因產品實行“零容忍”，只要在產品中檢出轉基因成分就需要進行標識，考慮到轉基因低水平混雜等客觀實際，目前這一“零容忍”政策在技術執法角度來講過于苛刻。因此，從我國各口岸轉基因檢測水平的實際出發，為國家政策部門提出合理的轉基因閾值迫在眉睫，首當其沖的便是開發轉基因成分的精準定量檢測方法，實現對轉基因產品的絕對定量。技術實現要素：鑒于目前食品安全領域對食品安全檢測技術和產品的迫切需求，本發明基于微滴式數字PCR技術，開發了一款可用于抗蟲轉基因水稻Bt63的精準定量檢測方法和試劑盒。所述檢測方法即為一種米或米制品中是否含有轉基因水稻Bt63的微滴式數字PCR檢測方法，包括：(1)設計引物探針：設計抗蟲轉基因水稻Bt63的內源和品系特異性引物探針：PLD-Forward：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCPLD-Reverse：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCPLD-Probe：FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCT-TAMRABt63-Forward：AGAGACTGGTGATTTCAGCGGBt63-Reverse：GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATBt63-Probe：FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCC-BHQ1(2)提取待測樣品、陽性對照、陰性對照的DNA：(3)數字微滴式PCR擴增：將步驟2)所得的待測樣品的DNA、陽性對照的DNA、陰性對照的DNA分別利用步驟1)所得的引物探針進行以下操作：①步驟1)所得的引物引物探針用DEPC處理水進行溶解稀釋，引物稀釋至濃度為900nM，探針稀釋至濃度250nM；②設置擴增反應體系：PCR反應體系從而分別得待測樣品反應體系、陽性對照反應體系、陰性對照反應體系；③所述待測樣品反應體系、陽性對照反應體系、陰性對照反應體系分別進行以下操作：將反應體系加入微滴發生板的樣品孔中(避免產生氣泡)，在相應微滴發生油孔中加入70μL微滴發生油，裝好膠條，置于微滴發生器中形成微滴。之后，將發生好的微滴用8道移液器轉移至0.2mLPCR反應管中(緩吸緩放)，用配套鋁箔封口后，置于PCR儀上進行PCR反應，PCR反應參數為：95℃/10min；94℃/30s，57℃/30s，40個循環；98℃/10min。Ramprate2℃/s。從而分別得待測樣品反應液、陽性對照反應液、陰性對照反應液；(4)結果檢測與分析：將步驟(3)所得的反應液放入微滴式數字PCR儀的微滴分析器中，并在軟件QuantaSoft上設定檢測模式為ABS，檢測FAM的熒光信號。儀器會自動分析每個微滴中熒光信號，然后，由QuantaSoft計算各樣品相關基因拷貝數濃度。本發明所述的引物可委托TAKARA公司制備，HPLC純化。本發明的步驟(3)的設置擴增反應體系中：2×ddPCRTMSupermixforProbes可通過市購的方式獲得。本發明還提供一種米或米制品中是否含有轉基因水稻Bt63的微滴式數字PCR檢測試劑盒，包括：抗蟲轉基因水稻Bt63的內源引物和探針：PLD-Forward：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCPLD-Reverse：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCPLD-Probe：FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCT-TAMRA抗蟲轉基因水稻Bt63品系的特異性引物和探針：Bt63-Forward：AGAGACTGGTGATTTCAGCGGBt63-Reverse：GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATBt63-Probe：FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCC-BHQ1。所述試劑盒還包括2×ddPCRTMSupermixforProbes。在本發明中，提取待測樣品、陽性對照、陰性對照的DNA可使用CTAB分步離心法進行DNA提取，或使用性能等同或超過本方法的DNA提取試劑盒(如QIAGENDNA提取試劑盒等)，當采用商業試劑盒時，則操作步驟參照試劑盒說明書進行。本發明屬于基于核酸的食品安全檢測領域，不同于傳統的核酸擴增，檢測靈敏度高，能實現精準定量檢測，實現對轉基因產品的絕對定量。并且該方法還具有很強的前瞻性，可以方便的增加所需要檢測的其他轉基因品種。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。以下實施例1中所用到的5份樣品，預先按照傳統的熒光定量PCR方法進行檢測，具體檢測結果如表1所示。表1熒光定量PCR方法檢測結果備注說明：1、陽性對照(positive)為Bt63轉基因水稻標準品。2、陰性對照(negative)為非轉基因稻米。實施例1米或米制品中是否含有轉基因水稻Bt63的檢測以表1中的樣品1～5作為待測樣品，以Bt63轉基因水稻標準品為陽性對照，以非轉基因稻米為陰性對照；依次進行以下步驟：1)設計引物：設計轉基因水稻Bt63的對應探針引物，已采用實時熒光PCR方法對設計合成的內源基因和品系基因引物探針進行檢測，結果表明所有引物探針均能有效擴增出靶基因(表1)，具體為：PLD-Forward：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCPLD-Reverse：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCPLD-Probe：FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCT-TAMRABt63-Forward：AGAGACTGGTGATTTCAGCGGBt63-Reverse：GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATBt63-Probe：FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCC-BHQ12)待測大米或米制品的前處理，依次進行以下步驟：使用CTAB分步離心法進行DNA提取，從而提取獲得待測樣品(即樣品1～5)的DNA、陽性對照的DNA、陰性對照的DNA。3)數字微滴式PCR擴增：將步驟2)所得的待測樣品的DNA(即，樣品1～5的DNA)、陽性對照的DNA、陰性對照的DNA分別利用步驟1)的引物組進行以下操作：引物的溶解稀釋：引物用DEPC處理水稀釋至濃度成900nM；探針用DEPC處理水稀釋至濃度成250nM。設置擴增反應體系，見表2：表2PCR反應體系從而分別得待測樣品反應體系、陽性對照反應體系、陰性對照反應體系；③所述待測樣品反應體系、陽性對照反應體系、陰性對照反應體系分別進行以下操作：將反應體系加入微滴發生板的樣品孔中(避免產生氣泡)，在相應微滴發生油孔中加入70μL微滴發生油，裝好膠條，置于微滴發生器中形成微滴。之后，將發生好的微滴用8道移液器轉移至0.2mLPCR反應管中(緩吸緩放)，用配套鋁箔封口后，置于PCR儀上進行PCR反應，PCR反應參數為：95℃/10min；94℃/30s，57℃/30s，40個循環；98℃/10min。Ramprate2℃/s。從而分別得待測樣品反應液、陽性對照反應液、陰性對照反應液；4)結果的判讀：將步驟3)所得的反應液放入微滴式數字PCR儀的微滴分析器中，并在軟件QuantaSoft上設定檢測模式為ABS，檢測FAM的熒光信號。儀器會自動分析每個微滴中熒光信號，然后，由QuantaSoft計算各樣品相關基因拷貝數濃度。具體結果如表3所示。表3微滴式數字PCR檢測結果檢測結果陽性對照(positive)檢出陰性對照(negative)未檢出轉基因大米Bt63(1)檢出轉基因大米科峰6號(2)未檢出轉基因大米克螟稻(3)未檢出轉基因大米LLRICE601(4)未檢出米粉(5)未檢出實施例2以非轉基因大米及含量為0.1％、1％、10％的轉基因水稻Bt63樣品為模板，進行3次的重復定量試驗，驗證數字PCR檢測方法的定量靈敏度。在非轉基因大米定量結果為0％時，10％轉基因大米Bt63樣品檢測結果為9.94％，1％轉基因大米Bt63樣品檢測結果為1.01％，0.1％轉基因大米Bt63樣品檢測結果為0.114％，表明本研究建立的ddPCR方法對轉基因大米Bt63的定量檢測靈敏度可達0.1％，檢測結果見表4。表4不同含量Bt63水稻樣品定量檢測結果理論值(％)重復1重復2重復3平均值(％)109.959.899.979.9410.9751.0181.0231.010.100.1120.1090.1210.1140000/當前第1頁1 2 3