本發明涉及醫學技術領域，尤其涉及一種山牡荊抗腫瘤化合物的研究方法。
背景技術：
惡性腫瘤是一種嚴重危害人類健康和生命的疾病，也是世界醫學界的重大難題。2008年，全球惡性腫瘤患者1270萬人，死亡人數高達760萬。世界范圍內因惡性腫瘤死亡的人數，比艾滋病、瘧疾和結核病加起來還要多。如果不采取有效措施，預計到2030年，每年將出現2600萬新增惡性腫瘤病例，死亡人數將達到1700萬。我國每年惡性腫瘤的發病人數約為200萬，死亡人數超過140萬，并有逐年上升的趨勢。攻克惡性腫瘤難關已成為醫藥工作者和化學工作者當務之急的任務。
近年來中藥及其有效成分抗腫瘤研究工作取得了一系列的成果，從植物中得到的抗腫瘤成分主要包括生物堿類、萜類、黃酮類、植物多糖類、多酚類、有機酸類和木脂素類等化合物。當今國際上常用的抗腫瘤植物藥和輔助化療的中藥主要包括紫杉醇、喜樹堿、長春花堿、白藜蘆醇、鬼臼毒素等。這些植物藥基本上已用于所有種類的癌癥的治療或輔助治療，如紫杉醇已用于喉癌、卵巢癌，黃芪等用于肝癌、五加多糖用于胃癌，魔芋用于腹水腫瘤，山豆根等用于治療消化道癌等。
目前，世界上對抗腫瘤藥用植物的研究工作已經涉及300余科植物，從植物中篩選出的抗癌活性成分已達617萬種。美國國立癌癥研究所自1957年以來，每年篩選出1500-5000中植物提取物的抗癌活性成分。中國的中醫藥具有2500多年的歷史，它們在治療各種疑難雜癥中顯現出了神奇的療效。但我國對植物有效成分的提取分離工作開展較晚，目前約對3000余種(占我國植物總數的10％左右)植物進行了有效成分的研究工作，發現不足300種植物有效成分具有抗癌活性，研究較多的有200余種。因此，我們必須加大對中醫藥的研究力度和深度，力爭從植物中獲得毒性低而抗腫瘤作用顯著的新衍生物。
牡荊屬植物Vitex是馬鞭草科喬木或灌木，全世界約250種，主要分布于熱帶和溫帶地區。我國有14種，7變種，3變型，主要分布在長江以南地區，少數種類在西北、東北、華北等地也有分布。牡荊屬植物含有多種化學成分，迄今從該屬植物中獲得的天然產物類型有黃酮類、二帖類、甾類、環烯醚萜類、三萜類、苯丙素類、倍半萜類等。現代藥理研究表明，本屬植物所含成分具有多種藥理活性，如抗腫瘤、調節內分泌、解熱鎮痛、抗炎作用、保肝作用、抗氧化作用、抗菌作用、殺蟲作用以及呼吸系統活性等。國內外許多研究機構對牡荊屬的抗腫瘤作用具有濃厚的興趣，抗腫瘤活性成為該屬植物目前研究的熱點之一。該屬植物提取物可以通過多種途徑抑制腫瘤增殖和誘導腫瘤細胞的凋亡，發揮抗腫瘤活性。
技術實現要素：
本發明的目的是為了解決現有技術中存在的缺點，而提出的一種山牡荊抗腫瘤化合物的研究方法。
一種山牡荊抗腫瘤化合物的研究方法，包括以下步驟；
S1：探索山牡荊有效成分的最佳提取方法，應用傳統提取方法、超聲波提取方法、微波提取方法和超臨界流體萃取提取方法分別對山牡荊有效成分進行提取，選取最佳的提取方法；
S2：對山牡荊中的有效成分進行分離和純化，采用有效的分離方法對山牡荊中的有效成分進行分離制備；
S3：將分離出的山牡荊有效成分進行結構鑒定，利用化學手段和現代儀器技術對分離得到的山牡荊各成分進行鑒定；
S4：篩選對山牡荊最敏感的腫瘤細胞和有效的抗腫瘤藥物濃度，并進行抗腫瘤細胞實驗，配制不同濃度的山牡荊提取物，進行山牡荊體外抗腫瘤活性實驗，篩選對山牡荊和單葉蔓荊最為敏感的腫瘤細胞和有效的抗腫瘤藥物濃度，并用最敏感的腫瘤細胞進行有效成分抗腫瘤細胞實驗，確定抗腫瘤活性成分的抗腫瘤效果；
S5：進行活體抗腫瘤實驗；
S6：對化合物進行結構改造，發掘山牡荊抗腫瘤化合物，以活性較好的化合物作為先導化合物，通過進一步的結構簡化，考察分子中各結構片段對抗腫瘤活性的影響，并利用化學手段，結合計算機輔助藥物設計及構效關系研究，對其進行結構改造，合成大量化合物，結合活性評價，發掘抗腫瘤效果好的山牡荊化合物。
優選的，所述山牡荊中有效成分的分離方法采用色譜分離法，所述色譜分離法包括高效液相制備色譜、中壓制備液相色譜和逆流色譜。
優選的，所述活體抗腫瘤實驗的具體方法為：選用對山牡荊抗腫瘤成分最敏感的腫瘤細胞構建小鼠腫瘤模型，將山牡荊和單葉蔓荊抗腫瘤成分的高、中、低三個劑量設為實驗組，以生理鹽水為空白組進行體內抗腫瘤實驗，定期監測小鼠皮下瘤體生長情況并對動物進行生存觀察，觀察結束后，處死小鼠并取動物腫瘤及相關臟器組織進行HE、免疫組化及凋亡染色，分析動物有無系統性損害。
本發明提出的一種山牡荊抗腫瘤化合物的研究方法，能夠對山牡荊的有效成分進行提取和分離，系統的研究山牡荊活性成分的化學多樣性，探索山牡荊的抗腫瘤活性成分，發掘山牡荊抗腫瘤化合物，并為研究新型抗腫瘤藥物提供科學依據和理論基礎。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步解說。
本發明提出的一種山牡荊抗腫瘤化合物的研究方法，包括以下步驟；
S1：探索山牡荊有效成分的最佳提取方法，應用傳統提取方法、超聲波提取方法、微波提取方法和超臨界流體萃取提取方法分別對山牡荊有效成分進行提取，選取最佳的提取方法；
S2：對山牡荊中的有效成分進行分離和純化，采用有效的分離方法對山牡荊中的有效成分進行分離制備；
S3：將分離出的山牡荊有效成分進行結構鑒定，利用化學手段和現代儀器技術對分離得到的山牡荊各成分進行鑒定；
S4：篩選對山牡荊最敏感的腫瘤細胞和有效的抗腫瘤藥物濃度，并進行抗腫瘤細胞實驗，配制不同濃度的山牡荊提取物，進行山牡荊體外抗腫瘤活性實驗，篩選對山牡荊和單葉蔓荊最為敏感的腫瘤細胞和有效的抗腫瘤藥物濃度，并用最敏感的腫瘤細胞進行有效成分抗腫瘤細胞實驗，確定抗腫瘤活性成分的抗腫瘤效果；
S5：進行活體抗腫瘤實驗；
S6：對化合物進行結構改造，發掘山牡荊抗腫瘤化合物，以活性較好的化合物作為先導化合物，通過進一步的結構簡化，考察分子中各結構片段對抗腫瘤活性的影響，并利用化學手段，結合計算機輔助藥物設計及構效關系研究，對其進行結構改造，合成大量化合物，結合活性評價，發掘抗腫瘤效果好的山牡荊化合物。
本發明中，所述山牡荊中有效成分的分離方法采用色譜分離法，所述色譜分離法包括高效液相制備色譜、中壓制備液相色譜和逆流色譜。
本發明中，所述活體抗腫瘤實驗的具體方法為：選用對山牡荊抗腫瘤成分最敏感的腫瘤細胞構建小鼠腫瘤模型，將山牡荊和單葉蔓荊抗腫瘤成分的高、中、低三個劑量設為實驗組，以生理鹽水為空白組進行體內抗腫瘤實驗，定期監測小鼠皮下瘤體生長情況并對動物進行生存觀察，觀察結束后，處死小鼠并取動物腫瘤及相關臟器組織進行HE、免疫組化及凋亡染色，分析動物有無系統性損害。
按照本發明提出的方法對山牡荊進行提取和分離，得到二十多個單體化合物，其中主要有以下幾種：
其中，1為紫花牡荊素；
2為β-谷甾醇；
3為胡蘿卜甾醇；
4為ro tundifuran；
5為3,5-O-雙咖啡酰基奎寧酸；
6為3-羥基-9-苯丁酮-4-氧-葡萄糖苷；
7為7-羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-羥甲基-6-甲氧基-1,2二氫-3-萘甲醛；
8為vitrofolal C；
9為木犀草素；
10為mussaenosidic acid；
11為turkesterone；
12為vitexifolin E；
13為4,5,7,3’,4’,5’-六羥基-6,8-二甲氧基二氫黃酮醇。
對以上化合物進行初步活性測試，測試結果表明：紫花牡荊素對人胃癌SGC27901細胞和人肝癌Hep G2細胞生長有明顯的抑制作用(0.15μg/ml濃度時，抑制率分別為75％和60％)，ro tundifuran和木犀草素對人宮頸癌Hela細胞有明顯的抑制作用(0.30μg/ml濃度時，抑制率分別為80％和65％)，3,5-O-雙咖啡酰基奎寧酸對人肝癌Hep G2細胞生長有一定的抑制作用(0.50μg/ml濃度時，抑制率為55％)。
本發明提出的一種山牡荊抗腫瘤化合物的研究方法，能夠對山牡荊的有效成分進行提取和分離，系統的研究山牡荊活性成分的化學多樣性，探索山牡荊的抗腫瘤活性成分，發掘山牡荊抗腫瘤化合物，并為研究新型抗腫瘤藥物提供科學依據和理論基礎。
以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。