一種農桿菌介導的高效洋蔥瞬時表達體系建立的方法與流程

本發明屬于植物基因工程技術領域，是一種農桿菌介導的高效的研究外源基因在洋蔥內表皮的亞細胞定位以及蛋白與蛋白互作的瞬時轉化方法。

背景技術：

目標基因的瞬時表達是分析生物學功能的一個簡單并且有用的的方法(Zhou et al.2009)。基因的瞬時表達在研究蛋白功能例如蛋白活性分析、亞細胞定位以及蛋白與蛋白互作方面提供了非常有用的信息(Lee et al.2008；Ueki et al.2009；Hollender and Liu 2010)。與操作復雜、昂貴且費時的穩定轉化體系相比(Scott et al.1999)，瞬時轉化的方法即快捷靈活又不影響染色體的位置并且可以用于高度分化的植物組織(Fischer et al.1999)。瞬時轉化已經越來越多的被用于作為穩定轉化的補充，加速深入研究的進程(Wroblewski et al.2005)。

在研究基因功能上瞬時轉化可以作為穩定轉化的很好的補充，目前實施瞬時轉化主要的植物材料是煙草或者洋蔥。洋蔥作為單子葉植物，對于從單子葉植物中克隆的基因的亞細胞定位可信度可能更高，因此我們選擇洋蔥作為我們瞬時轉化體系建立的對象。洋蔥表皮細胞具有容易獲得、單層細胞、透明且無葉綠體干擾等優點，是研究生理學活性、蛋白活性、細胞動力學、基因瞬時表達、蛋白亞細胞定位及蛋白與蛋白互作非常理想的實驗材料(Scott et al.1999；Walter et al.2004；Cheng et al.2009；Hollender and Liu 2010；Zhang et al.2011)。

基因槍法和農桿菌介導的轉化方法是目前瞬時轉化的主要方法。基因槍法受載體的限制較小并且可以用于單子葉植物和雙子葉植物組織，在洋蔥中常規的轉化方法主要是應用基因槍法(Christou 1995；Eady et al.1996；Scott et al.1999；Arnim 2007；Cheng et al.2009；Hollender and Liu 2010)。但是，利用基因槍法進行轉化有轉化效率低、轉化過程昂貴并且受儀器設備及輔助材料的限制。

近年來，也有報道稱用農桿菌介導的方法進行洋蔥瞬時轉化(Sun et al.2007；Xu et al.2014)。它的優點是只需要常規的菌株、載體以及培養基不需要昂貴的儀器設備和金粉等，并且操作簡單，成本低，拷貝數低。但是目前的轉化效率還不是很高，體系的應用上還沒有蛋白與蛋白互作方面成功的報道。

技術實現要素：

本發明就是針對上述存在的缺陷而提供一種農桿菌介導的高效洋蔥瞬時表達體系建立的方法。本發明要解決的技術問題是優化農桿菌介導的洋蔥瞬時轉化體系，提高轉化效率。利用本發明體系首先可以快速的判斷新構建的用于穩定轉化的帶有熒光蛋白標簽的載體是否有活性，避免穩定轉化的過程中浪費人力物力；同時還可以進行目標蛋白的亞細胞定位以及蛋白與蛋白的互作等工作，為基因功能的分析提供輔助手段。

本發明的一種農桿菌介導的高效洋蔥瞬時表達體系建立的方法通過以下技術方案來實現：將洋蔥表皮細胞侵染在含有農桿菌的侵染培養基中，20～22℃侵染10～20分鐘，光下培養24小時。

所述的侵染培養基是以MS培養基為基礎，通過調節葡萄糖和蔗糖的含量，增加了農桿菌侵染液的滲透勢；同時添加0.01％的Silwet L-77，增加了農桿菌在洋蔥表皮上的富集，提高了轉化效率。

所述的一種農桿菌介導的高效洋蔥瞬時表達體系建立的方法，包括以下步驟：

(1)取洋蔥內表皮塊；

(2)含有目標基因的農桿菌侵染培養基的配置：將活化一次的攜帶雙元載體的農桿菌接種到10ml YEB液體培養基中，28℃200rpm搖動培養過夜；將菌液再次轉接到新鮮的10ml YEB液體培養基中，28℃200rpm搖動45小時，OD₆₀₀＝0.5～0.8；將菌液4℃低溫4000rpm離心6min后倒掉上清，用侵染培養基將菌體重懸致濃度OD₆₀₀＝0.3，添加Silwet L-77；

(3)洋蔥表皮侵染：在無菌條件下，將洋蔥內表皮塊放到含有菌體的添加了Silwet L-77的侵染培養基中，輕輕晃動，侵染10～20min；侵染后將洋蔥表皮靠近葉肉的一側朝下放到共培養培養基上；共培養培養皿放到光下20±2℃24個小時。

步驟(1)具體為：將洋蔥鱗莖，去除外層1～2層鱗葉，將洋蔥鱗莖消毒后在超凈工作臺內用無菌水將鱗莖洗干凈，縱切開洋蔥鱗莖，取中層靠內的較肥厚的鱗葉，在這些鱗葉內部用解剖刀輕畫1cm²的十字方塊若干，撕下這些洋蔥內表皮塊。

所述洋蔥鱗莖消毒是70～75％(體積濃度)的乙醇消毒。

步驟(2)中所述農桿菌菌株為EHA105或GV3101(來自中科院植物所景海春課題組)。攜帶與GUS、GFP或YFP等報告基因融合的外源基因導入洋蔥表皮細胞。

步驟(2)中將活化一次的攜帶雙元載體的農桿菌接種到10ml YEB液體培養基中，體積比為1:100，YEB液體培養基含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素或者100μg/ml壯觀霉素，100μM乙酰丁香酮；

將菌液再次轉接到新鮮的10ml YEB液體培養基中，體積比1:10；YEB液體培養基含有100μM乙酰丁香酮。

步驟(2)中用侵染培養基將菌體重懸致濃度OD₆₀₀＝0.3，所用的侵染培養基為高粱浸染培養基，侵染培養基中添加0.01％的Silwet L-77。

添加了Silwet L-77的高粱侵染培養基每L包括以下成分：MS培養基4.43g，葡萄糖36g，蔗糖68.5g，MES培養基0.5g，Silwet L-770.01％(體積百分比)，乙酰丁香酮100μM，pH 5.8。

步驟(3)中共培養培養基為高粱共培養培養基，每L包括以下成分：MS培養基4.43g，葡萄糖10g，蔗糖20g，MES培養基0.5g，瓊脂8g,乙酰丁香酮100μM，pH 5.8

為了減少農桿菌對洋蔥表皮細胞的侵害，使轉化效率更加穩定，優化了步驟(2)中侵染培養基中菌體的濃度，選擇侵染培養基菌體的濃度為OD₆₀₀＝0.3。

本發明與現有技術相比具有以下優點：本發明的侵染培養基是以MS培養基為基礎，通過調節葡萄糖和蔗糖的含量，增加了農桿菌侵染液的滲透勢；同時添加0.01％的Silwet L-77，增加了農桿菌在洋蔥表皮上的富集，提高了轉化效率。

利用本發明體系首先可以快速的判斷新構建的用于穩定轉化的帶有熒光蛋白標簽的載體是否有活性，避免穩定轉化的過程中浪費人力物力。

本發明不依賴于基因槍等昂貴的實驗材料，成本低；轉化過程簡單快捷，全程僅需2～3天；不受例如煙草、擬南芥等需要種植后才能轉化的植物材料的限制；轉化效率高達90％以上；可以進行較為準確的亞細胞定位研究和蛋白與蛋白互作的研究，為基因功能的分析提供輔助手段。

附圖說明

圖1所示為實施例1和實施例2中所用載體構架；

圖2所示為實施例3中所用載體構架；

圖3所示為農桿菌介導的洋蔥表皮瞬時轉化程序；其中，a：新鮮鱗莖，b：將鱗莖縱切開，c：洋蔥內表皮切1cm2小塊，d：在離心管中對洋蔥表皮進行侵染，e：共培養，f：將共培養后洋蔥表皮放在載玻片上準備顯微觀察，標尺＝1cm；

圖4所示為實施例1p3300-GFP綠色熒光的表達；其中，a：p3300-GFP綠色熒光圖，b：明場，c：a與b疊加圖，d：空白對照(未轉化洋蔥表皮細胞)，e：明場，f：d與e疊加圖，標尺＝100微米；

圖5所示為菌液濃度對轉化效率的影響；

圖6所示為CWIN10B-mCherry融合蛋白在洋蔥表皮的亞細胞定位；a：p1300-CWIN10B-mCherry紅色熒光蛋白(質壁分離圖)，b：明場，c：a與b疊加圖，d空白對照(未轉化洋蔥表皮細胞)，e明場，f：d與e疊加圖；標尺＝100微米；

圖7所示為利用洋蔥表皮細胞檢測CYCH與CDKD；2的互作；a：pSPYNE-CYCH-YCHA/CDKD；2-YNEE蛋白與蛋白互作黃色熒光，b：明場，c：a與b疊加圖，d：pSPYNE-YCHA/YNEE陰性對照，無互作黃色熒光，e：明場，f：d與e疊加。

具體實施方式：

為了更好地理解本發明，下面用具體實例來詳細說明本發明的技術方案，但是本發明并不局限于此。

實例1

農桿菌介導的洋蔥表皮細胞亞細胞定位體系的優化

(1)選取生長旺盛，活力強的洋蔥鱗莖，去除最外層1～2層鱗葉(圖3a)，將洋蔥鱗莖在70～75％乙醇中浸泡10分鐘消毒，然后在超凈工作臺內用無菌水將鱗莖洗滌3-5次，用無菌解剖刀縱切開洋蔥鱗莖(圖3b)，取中層靠內的較肥厚的鱗葉，在這些鱗葉內表皮(凹面)用解剖刀輕畫約1cm²的十字方塊若干，撕下這些洋蔥內表皮塊(圖3c)；

(2)以GFP為報告基因，優化轉化體系。將GFP報告基因連入pCAMBIA3300載體中，構建表達載體pCAMBIA3300-ubi-gfp雙元表達載體(圖1)。將該載體導入農桿菌EHA105中，將經鑒定為陽性克隆并活化一次的攜帶雙元載體的農桿菌接種到10ml YEB液體培養基中(體積比1:100；含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素、100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm搖過夜；將菌液再次轉接到新鮮的10ml YEB液體培養基中(體積比1:10；100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm搖4-5小時，OD₆₀₀＝0.5～0.8；將菌液4℃低溫4000rpm離心6min后倒掉上清，用侵染培養基SbIM、AtIM和TnIM(添加或不添加0.01％的Silwet L-77)(浸染培養基請見表1)將菌體重懸致濃度OD₆₀₀＝0.1、0.3和0.5。

(3)洋蔥表皮侵染：在無菌條件下，將5-10塊洋蔥內表皮塊放到含有菌體的不同的侵染培養基中(侵染液放在2ml離心管中)(圖3d)，輕輕晃動，侵染10～20min。侵染后將洋蔥表皮靠近葉肉的一側朝下放到共培養培養基上(SbCOM)(圖3e)。共培養培養皿放到光下20±2℃24個小時，將洋蔥表皮在無菌水中清洗幾遍，然后放到載玻片上，蓋上蓋玻片(圖3f)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察結果如圖4所示，洋蔥表皮細胞有明顯的綠色熒光表達(見說明書附圖圖4)。由圖5柱狀圖我們可以看出，當菌液濃度為OD₆₀₀＝0.3時，轉化效率高達92％以上，顯著高于OD₆₀₀＝0.1時，與OD₆₀₀＝0.3時差異不顯著(見說明書附圖圖5)。為提高轉化效率，本發明優化了步驟(2)中侵染培養基的組成，所述農桿菌侵染培養基和共培養培養基見表1；IM侵染培養基是以MS培養基為基礎，通過調節葡萄糖和蔗糖的含量，增加了農桿菌侵染液的滲透勢；同時添加0.01％的Silwet L-77，增加了農桿菌在洋蔥表皮上的富集，提高了轉化效率(如表2所示)。

為了減少農桿菌對洋蔥表皮細胞的侵害，使轉化效率更加穩定，優化了步驟(2)中侵染培養基中菌體的濃度，選擇侵染培養基菌體的濃度為OD₆₀₀＝0.3。

表1不同侵染培養基及共培養培養基(SbCOM)

注：SbIM(高粱侵染培養基)，SbIM+s(高粱侵染培養基添加了Silwet L-77)，SbCOM(高粱共培養培養基)，TnIM(煙草侵染培養基)，TnIM+s(煙草侵染培養基添加了Silwet L-77)，AtIM(擬南芥侵染培養基)，AtIM+s(擬南芥侵染培養基添加了Silwet L-77)。

表2不同侵染培養基及不同侵染時間對洋蔥轉化效率的影響

注：大寫字母A-D表示轉化效率在0.01顯著水平上差異極顯著，小寫字母a-e表示轉化效率在0.05水平上差異顯著，利用SPSS13統計分析軟件及Duncan方法對不同處理間轉化效率進行顯著性差異分析；+s：培養基中添加Silwet L-77。

由表格可知，高粱侵染培養基添加了Silwet L-77的轉化效率高達90％,遠高于其他侵染培養基,同時也遠高于高粱侵染培養基未添加Silwet L-77的50～60％的轉化效率。

實施例2

農桿菌介導的洋蔥表皮細胞的轉化方法應用于蛋白亞細胞定位的研究

(1)選取生長旺盛，活力強的洋蔥鱗莖，去除最外層1～2層鱗葉(圖3a)，將洋蔥鱗莖在70～75％乙醇中浸泡10分鐘消毒，然后在超凈工作臺內用無菌水將鱗莖洗滌3～5次，用無菌解剖刀縱切開洋蔥鱗莖(圖3b)，取中層靠內的較肥厚的鱗葉，在這些鱗葉內表皮(凹面)用解剖刀輕畫約1cm²的十字方塊若干，撕下這些洋蔥內表皮塊(圖3c)；

(2)以mCherry為報告基因，將CWIN10B連入pCAMBIA1300-mCherry載體中，構建表達載體pCAMBIA1300-CWIN10B-mCherry雙元表達載體(圖1)。將該載體導入農桿菌GV3101中，將經鑒定為陽性克隆并活化一次的攜帶雙元載體的農桿菌接種到10ml YEB液體培養基中(體積比1:100；含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素，100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm搖過夜；將菌液再次轉接到新鮮的10ml YEB液體培養基中(體積比1:10；100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm搖4～5小時，OD₆₀₀＝0.5～0.8；將菌液4℃低溫4000rpm離心6min后倒掉上清，用侵染培養基SbIM(添加0.01％的Silwet L-77)(表1)將菌體重懸致濃度OD600＝0.3。

(3)洋蔥表皮侵染：在無菌條件下，將5～10塊洋蔥內表皮塊放到含有菌體的不同的侵染培養基中(侵染液放在2ml離心管中)(圖3d)，輕輕晃動，侵染10-20min。侵染后將洋蔥表皮靠近葉肉的一側朝下放到共培養培養基上(SbCOM)(圖3e)。共培養培養皿放到光下20+2℃24個小時，將洋蔥表皮在無菌水中清洗幾遍，然后放到載玻片上，蓋上蓋玻片(圖3f)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結果顯示CWIN10B蛋白定位在細胞壁上(圖6)。

該實施例說明了此方法可以快速的進行較為準確的基因亞細胞定位研究

實施例3

農桿菌介導的洋蔥表皮細胞的轉化方法應用于蛋白與蛋白互作的研究

(1)選取生長旺盛，活力強的洋蔥鱗莖，去除最外層1～2層鱗葉(圖3a)，將洋蔥鱗莖在70～75％乙醇中浸泡10分鐘消毒，然后在超凈工作臺內用無菌水將鱗莖洗滌3～5次，用無菌解剖刀縱切開洋蔥鱗莖(圖3b)，取中層靠內的較肥厚的鱗葉，在這些鱗葉內表皮(凹面)用解剖刀輕畫約1cm²的十字方塊若干，撕下這些洋蔥內表皮塊(圖3c)；

(2)將CYCH和CDKD；2分別連入pSPYNE-YCHA和pSPYNE-YNEE載體中構成pSPYNE-CYCH-YCHA/CDKD；2-YNEE載體，pSPYNE-YCHA和pSPYNE-YNEE空載作為陰性對照(圖2)。將所有載體導入農桿菌EHA105中，將經鑒定為陽性克隆并活化一次的攜帶雙元載體的農桿菌接種到10ml YEB液體培養基中(體積比1:100；含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素，100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm搖過夜；將菌液再次轉接到新鮮的10ml YEB液體培養基中(體積比1:10；100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm搖4～5小時，OD₆₀₀＝0.5～0.8；將菌液4℃低溫4000rpm離心6min后倒掉上清，用侵染培養基SbIM(添加0.01％的Silwet L-77)(表1)將菌體重懸致濃度OD₆₀₀＝0.3。

(3)洋蔥表皮侵染：在無菌條件下，將5～10塊洋蔥內表皮塊放到含有菌體的不同的侵染培養基中(侵染液放在2ml離心管中)(圖3d)，輕輕晃動，侵染10～20min。侵染后將洋蔥表皮靠近葉肉的一側朝下放到共培養培養基上(SbCOM)(圖3e)。共培養培養皿放到光下20±2℃24個小時，將洋蔥表皮在無菌水中清洗幾遍，然后放到載玻片上，蓋上蓋玻片(圖3f)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結果表明轉了pSPYNE-CYCH-YCHA/CDKD；2-YNEE的洋蔥表皮細胞在細胞核和細胞質中出現了強烈的黃色熒光，陰性對照中沒有熒光出現(圖7)。

該實施例證明了本發明技術方案可應用于較為準確的蛋白與蛋白互作的研究。