本發明涉及基因工程技術改造微生物，使得重組菌能以酒糟為原料生產γ-氨基丁酸的方法，屬于基因工程和生物工程領域。
背景技術：
γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)是天然存在于某些生物體內的非蛋白質氨基酸，其為哺乳動物中樞神經系統重要的抑制性神經遞質，具有抗焦慮、降血壓、鎮定安神、增強記憶、調節激素分泌、促進生殖、利尿，鎮痛等生理功能，在食品、飼料、醫藥等領域都具有廣泛的應用。
正如以授權專利(CN201110209999.7)的技術背景所述，目前報道的利用酒糟的技術主要有：烘干去稻殼直接生產飼料；經微生物發酵生產菌體蛋白飼料；進行固態發酵，生產酶類飼料添加劑；厭氧發酵生產沼氣；也有利用酒糟的水解液發酵生產丁二酸的報道。但未見利用微生物發酵酒糟生產γ-氨基丁酸的報道。
因此，針對當前酒糟的處理方式是直接用來做飼料的應用附加值極低，且其中大部分的營養成分均未有效開發與利用等問題。發明人利用研究室前期通過菌種選育保藏Bacillus amyloliquefaciens B10-127(CCTCC NO：M2012349，已在已授權專利中公開，授權號：ZL201310342414.8)分泌的復雜胞外酶系，在一定條件下利用酒糟作為碳源進行生長和代謝的特性，通過基因工程技術改造該菌種使其能生物發酵轉化酒糟為γ-氨基丁酸。有效開發利用酒糟，生產高附加值物質，減少酒糟對環境的污染，在一定程度上能帶來可觀的經濟效益。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是提供一種微生物利用酒糟發酵生產γ-氨基丁酸的方法。
本發明提供一株可利用酒糟發酵生產γ-氨基丁酸的基因工程菌種。
所述的酒糟為發酵酒醪經壓榨、分離去除酒液后留下的固形物，經預粉碎處理的基質。
本發明的技術方案：通過基因工程技術，構建一株能以廉價酒糟為碳源直接發酵生產γ-氨基丁酸的重組解淀粉芽孢桿菌。
所述的重組菌發明人按分類命名為B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD.
所述重組菌的構建方法如下：
(1)以植物乳桿菌GB01-21(CCTCCM209102)的基因組DNA為模板，利用正向引物F(5’-TTCCATATGATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3’，酶切位點NdeI)，反向引物R(5’-GGCGGATCCCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT-3’，酶切位點BamHI)進行PCR擴增即得到植物乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因全長1401bp，所述核苷酸序列是SEQ ID N0.1所示的序列。
(2)將上一步得到的重組基因序列，連接到pMA5表達載體中，得到重組質粒pMA5-GAD，重組質粒化轉化B.amyloliquefaciens B10-127，獲得重組解淀粉芽孢桿菌，命名為B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD。
發酵培養基：酒糟100g/L，葡萄糖30g/L，玉米漿5g/L，尿素3g/L，檸檬酸鈉6g/L，K2HPO44g/L，MgSO40.2g/L；將上述發酵培養基用5mol/L的NaOH調節其pH至6.5(接種后添加商品化500U/mL左右糖化酶、300U/mL左右復合纖維素酶和少量氨基酸氧化酶，不用添加淀粉酶)。其中葡萄糖的作用是保證發酵前期菌體快速生長。
本發明的效益：在一定條件下利用酒糟作為碳源進行生長和代謝的特性，通過基因工程技術改造該菌種使其能生物發酵轉化酒糟為γ-氨基丁酸。有效開發利用酒糟，生產高附加值物質，減少酒糟對環境的污染，在一定程度上能帶來可觀的經濟效益。
具體實施方式
實施例1含谷氨酸脫羧酶重組載體的構建
(1)谷氨酸脫羧酶基因片段獲得：以植物乳桿菌GB01-21(CCTCCM209102)的基因組DNA為模板，利用正向引物F(5’-TTCCATATGATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3’，酶切位點NdeI)，反向引物R(5’-GGCGGATCCCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT-3’，酶切位點BamHI)進行PCR擴增。
(2)將重組基因與pMA5分別用BamHI、NdeI雙酶切，純化后用T4DNA連接酶16℃過夜連接。連接產物化學法轉化JM109感受態細胞。轉化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取質粒，雙酶切驗證構建的重組質粒，命名為pMA5-GAD。測序工作由上海生工完成。
實施例2重組解淀粉芽孢桿菌的構建
將實施例1得到的重組質粒pMA5-GAD化學法轉化入B.amyloliquefaciensB10-127感受態細胞，具體方法如下：
(1)轉化實驗所需溶液如下(g/L)：
Sp-A：(NH4)2SO4 4，K2HPO4 28，檸檬酸鈉12Sp-B：MgSO4·7H2O 0.4
100×CAYE：Casamino acid 20，酵母粉100 Sp I培養基：Sp-A 49％，Sp-B 49％，50％葡萄糖2％，100×CAYE 2％Sp II培養基：Sp I培養基98％，50mmol/LCaCl2 1％，250mmol/L MgCl2 1％。115℃濕熱滅菌。
(2)將B.amyloliquefaciens B10-127的單菌落接種至2mL Sp I培養基中(50mL離心管)，37℃、200r/min培養過夜；
(3)取100μL培養液至5mL Sp I培養基中，37℃、200r/min培養至對數期(OD600值為1左右)，約4～5h；
(4)取200μL培養液至2mL Sp II培養基中，37℃、200r/min培養90min，取出后加入20μL 10mmol/L EGTA，于37℃、200r/min繼續培養10min，然后分裝成500μL每管，加入5μL重組質粒pMA5-GAD，混勻，37℃、200r/min培養90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培養12h，挑取陽性轉化子驗證。得到重組菌B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD。
實施例3：重組菌B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD利用酒糟發酵產γ-氨基丁酸。
將實施例2構建的重組菌B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD接種于l0mL含卡那霉素的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜，搖床轉速160r/min，培養時間為12h左右，種子培養基組成：淀粉10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
將上述培養好的種子液按4％接種量接種于發酵培養基中進行發酵培養，發酵溫度37℃，空氣流量為120m3/h·m3培養基，攪拌轉速為350r/min。定時取樣測定細胞濃度、底物殘留量和γ-氨基丁酸生產量，發酵培養60h，即刻停止發酵。發酵結束后，γ-氨基丁酸產量達到48.9g/L。
雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
序列表
<110> 江南大學
<120>一種微生物利用酒糟發酵生產γ-氨基丁酸的方法
<160> 2
<210> 2
<211> 1401
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum GB01-21
<400> 1
1 ATGGCAATGT TATACGGTAA ACACAATCAT GAAGCTGAAG AATACTTGGA ACCAGTCTTT
61 GGTGCGCCTT CTGAACAACA TGATCTTCCT AAGTATCGGT TACCAAAGCA TTCATTATCC
121 CCTCGAGAAG CCGATCGCTT AGTTCGTGAT GAATTATTAG ATGAAGGCAA TTCACGACTG
181 AACTTGGCAA CTTTTTGTCA GACCTATATG GAACCCGAAG CCGTTGAATT GATGAAGGAT
241 ACGCTGGCTA AGAATGCCAT CGACAAATCT GAGTACCCCC GCACGGCCGA GATTGAAAAT
301 CGGTGTGTGA ACATTATTGC CAATCTGTGG CACGCACCTG ATGACGAACA CTTTACGGGT
361 ACCTCTACGA TTGGCTCCTC TGAAGCTTGT ATGTTAGGCG GTTTAGCAAT GAAATTCGCC
421 TGGCGTAAAC GCGCTCAAGC GGCAGGTTTA GATCTGAATG CCCATCGACC TAACCTCGTT
481 ATTTCGGCTG GCTATCAAGT TTGCTGGGAA AAGTTTTGTG TCTACTGGGA CGTTGACATG
541 CACGTGGTCC CAATGGATGA GCAACACATG GCCCTTGACG TTAACCACGT CTTAGACTAC
601 GTGGACGAAT ACACAATTGG TATCGTCGGT ATCATGGGCA TCACTTATAC CGGTCAATAT
661 GACGACCTAG CCGCACTCGA TAAGGTCGTT ACTCACTACA ATCATCAGCA TCCCAAATTA
721 CCAGTCTACA TTCACGTTGA CGCAGCGTCA GGTGGCTTCT ATACCCCATT TATTGAGCCG
781 CAACTCATCT GGGACTTCCG GTTGGCTAAC GTCGTTTCGA TCAACGCCTC CGGGCACAAG
841 TACGGTTTAG TTTATCCCGG GGTCGGCTGG GTCGTTTGGC GTGATCGTCA GTTTTTACCG
901 CCAGAATTAG TCTTCAAAGT TAGTTATTTA GGTGGGGAGT TGCCGACAAT GGCGATCAAC
961 TTCTCACATA GTGCAGCCCA GCTCATTGGA CAATACTATA ATTTCATTCG CTTTGGTATG
1021 GACGGTTACC GCGAGATTCA AACAAAGACT CACGATGTTG CCCGCTACCT AGCAGCTGCT
1081 CTGGATAAAG TTGGTGAGTT TAAGATGATC AATAACGGAC ACCAACTACC TCTGATTTGT
1141 TACCAACTAG CCCCGCGCGA AGATCGTGAA TGGACCCTTT ATGATTTATC GGACCGCCTA
1201 TTAATGAACG GCTGGCAAGT ACCAACATAT CCTTTACCTG CTAATCTAGA ACAACAAGTC
1261 ATCCAACGAA TCGTCGTTCG AGCTGACTTT GGCATGAATA TGGCACACGA TTTCATGGAT
1321 GACCTGACCA AGGCTGTCCA TGACTTAAAC CAAGCCCACA TTGTCTATCA TCATGACGCG
1381 GCACCTAAGA AATACGGATT CACACACTGA