一種人臍帶血免疫細胞庫的構建方法與流程

本發明涉及一種細胞庫的構建方法，尤其涉及一種人臍帶血構建免疫細胞庫的方法。

背景技術：

免疫細胞，泛指所有參與免疫反應的細胞，也特指能識別抗原，產生特異性免疫應答的淋巴細胞。免疫細胞治療是采集人體免疫細胞，在多種免疫活性因子的作用下，經過體外培養，大量擴增免疫效應細胞后，再回輸到體內，殺滅血液及組織中的病原體和癌細胞。目前，用于臨床治療的免疫細胞主要有樹突狀細胞（DC）、細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK）、DC刺激的CIK細胞（DC-CIK）、自然殺傷細胞（NK）、腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL）等。

免疫細胞治療已成為繼手術、化療、放療三大傳統療法后的第四種腫瘤治療技術，彌補了手術、放化療等常規療法無法完全殺滅體內殘余癌細胞的缺點，還能防止腫瘤復發與轉移，達到控制甚至治愈癌癥的目的，在臨床上的使用越來越廣泛。

目前，臨床上的免疫細胞治療均是將血液中分離的單個核細胞誘導擴增成足量的免疫細胞后回輸。而這種治療方式存在幾個不可避免的問題：（1）由于釆血后的單個核細胞分離及誘導培養，病人若選擇免疫細胞治療至少需等待兩周時間，容易錯過最佳治療期，且住院時間延長；（2）癌癥患者尤其是晚期癌癥患者，體質虛弱、免疫功能低下，一般不能耐受反復抽血（如容易誘發缺血性貧血等），因此所得的自體血量較少，而一次培養只能擴增70-80倍左右，難以滿足免疫細胞治療所需細胞數量，臨床醫生需在細胞治療和反復抽血之間平衡；（3）病人自體血液的質量不高，尤其是抗原遞呈細胞（DC細胞即是最高效的抗原遞呈細胞）數量較少，而免疫抑制細胞（Treg細胞）數量較多，誘導培養時免疫抑制細胞數量也在不斷增加，將在一定程度上繼續抑制效應細胞；（4）臨床上的免疫細胞治療（DC-CIK）多選用全抗原負載的模式（如CN102861107B），治療的靶向性不強，存在移植物抗宿主反應的風險。

臍帶血是臍帶及胎盤內近胎兒一側血管內的血液，來源充足，采集方便，免疫源性較弱，能更大程度上耐受HLA（人類的主要組織相容性復合體）配型不服；臍帶血內的淋巴細胞絕對數量高，具有較強的增殖潛力；由臍帶血分離誘導后進行免疫細胞治療，可突破免疫細胞只進行自體治療的瓶頸，滿足不同人群對細胞治療的需求。

在免疫細胞庫建設過程中還需考慮細胞凍存的問題，目前的細胞凍存液中DMSO（二甲基亞砜）的含量一般均在10%-15%，即便是在凍存免疫細胞的專利（CN102758259B）中，依然將DMSO控制在10%。但是單個核細胞，尤其是誘導后的淋巴細胞是脆弱的，由于DMSO的毒性作用及凍存過程中的機械操作，易造成免疫細胞膜上的某些蛋白構型的改變，從而引起細胞亞型變化，導致穿孔素分泌量下降；另一方面，細胞在復蘇處理時還需注意對DMSO的清除處理，已有報道指出細胞治療的不良事件發生率與DMSO的回輸量有關。

綜上所述，研究一種可以滿足臨床中細胞治療需要的免疫細胞庫的構建方法，顯得尤為重要。

技術實現要素：

針對上述問題，本發明提供一種人臍帶血構建免疫細胞庫的方法，該方法可提高細胞質量，增強細胞治療效果。

為實現本發明的上述目的，本發明提供一種人臍帶血免疫細胞庫的構建方法，該構建方法包括以下步驟。

步驟1、臍帶血的采集及運輸。

步驟2、從臍帶血中分離單個核細胞。

步驟3、將步驟2得到的單個核細胞內的CD34^＋細胞誘導成DC細胞：用AIM-V培養基調整單個核細胞密度；然后接種至培養瓶中，同時加入DC誘導因子，置二氧化碳培養箱中進行培養；培養至第2-3天時，加入rhGM-CSF、rhIL-4和rhIL-15，置二氧化碳培養箱繼續培養。

步驟4、從上清培養液中分離懸浮的淋巴細胞：步驟3培養的細胞培養至第3-4天時，將培養液轉至無菌離心管中，再往培養瓶中加入生理鹽水，晃動洗滌，收集殘留懸浮的淋巴細胞。

步驟5、獲得成熟的DC細胞：向步驟4洗滌后的培養瓶中加入AIM-V培養基，加入rhSCF、rhFLT-3L、TPO、rhGM-CSF和rhIL-4，置二氧化碳培養箱，繼續培養貼壁細胞；當培養至第6天時，半量換液，回收移出液中的懸浮細胞，補充rhGM-CSF和rhIL-4，并加入單一特異性腫瘤抗原肽進行負載，置二氧化碳培養箱中，繼續培養；當培養至第7天時，加入rhTNF-α，置二氧化碳培養箱，繼續培養；當培養至第9天時，細胞變為毛刺狀懸浮細胞，即為成熟的DC細胞，終止培養。

步驟6、獲得CIK細胞：將步驟4中的懸浮的淋巴細胞離心棄上清，用AIM-V培養基調整細胞密度后，接種到培養袋中，加入IFN-γ混勻，置二氧化碳培養箱培養；培養24h后，加入rhIL-2、rhIL-15、CD3；然后每2-3天，2倍量添加培養液AIM-V培養基, 并補加rhIL-2；當培養至第7天時，將培養袋內的懸浮細胞轉移到WAVE Bioreactor system 10中，繼續進行培養8天，獲得CIK細胞。

步驟7、收集DC-CIK細胞：將步驟5得到的成熟的DC細胞離心，用AIM-V培養基重懸細胞，加入WAVE Bioreactor system 10中，與步驟6培養至第8天得到的懸浮細胞（CIK細胞）共培養；然后再添加AIM-V培養基，并補加rhIL-2、rhIL-15；共同培養至第14-16天時，離心收集共培養的細胞，即為DC-CIK細胞。

步驟8、對收集的DC-CIK細胞進行檢測。

步驟9、檢測合格后，放入免疫細胞庫凍存，并建立細胞檔案：將檢測合格的DC-CIK細胞與預冷的細胞凍存液混合后封裝，附上標簽，轉至液氮罐內。

步驟10、根據臨床診斷從免疫細胞庫內選擇對應的效應細胞種類，復蘇培養24h后，回輸。

所述步驟1中臍帶血采集后需加入抗凝劑；所述的抗凝劑為肝素或枸櫞酸鈉。

所述步驟3中采用的DC誘導因子為rhSCF、rhFLT-3L、TPO、rhIL-3和rhIL-11，各誘導因子的用量均為5-100ng/ml。

所述步驟5中腫瘤抗原肽是針對各種腫瘤疾病的特異性抗原肽，優選CEA癌胚抗原、AFP甲胎蛋白。

所述步驟5中獲得的成熟DC細胞是針對單一腫瘤抗原肽的效應細胞。

所述步驟9中細胞凍存液的配方為5%DMSO，10%羥乙基淀粉，85%穩定劑；其中穩定劑由25%人血白蛋白，5%乙二醇，70%培養基組成；羥乙基淀粉可用右旋糖酐40代替。

所述步驟9細胞檔案需詳細記錄抗原肽負載類型；細胞檔案需建立電子版檔案和紙質版檔案。

所述步驟9免疫細胞庫是針對不同腫瘤抗原肽的多種效應細胞的集合。

所述步驟9凍存的細胞密度控制在1-5×10⁸/ml。

所述步驟10細胞復蘇培養需加入rhIL-2、rhIL-6、rhIL-15進行培養。

本發明的有益效果。

本發明提供的人臍帶血免疫細胞庫的構建方法，采用人臍帶血作為免疫細胞庫的細胞來源，不僅活性高，擴增速度快，而且臍帶血中含有豐富的造血干細胞，可塑性好，免疫原性低，大量實踐證明臍帶血來源的造血干細胞可幫助白血病患者完成造血和免疫功能的重建，采用人臍帶血作為免疫細胞庫的細胞來源，在保證血源充足的同時，既可避免采血給病人帶來的痛苦，又可提高細胞質量（臍帶血內的淋巴細胞絕對數量高，增值潛力強，且不存在免疫抑制細胞），增強細胞治療效果。

本發明與現有的構建方法相比，本發明構建方法的構建速度快，且通用性好。構建的免疫細胞庫是各種腫瘤抗原肽效應細胞的集合，患者可在需要進行細胞治療時選擇合適的效應細胞復蘇回輸，單一抗原肽產生的效應細胞回輸能降低移植物抗宿主反應，增強效應細胞靶向性，減少等待細胞培養的時間，把握最佳治療期，提高臨床治療效果。該構建方法將CD34^＋細胞誘導成DC細胞，進而可增加負載抗原的DC數量，亦能在共培養過程中更好地刺激懸浮細胞的生長；并且，利用單一腫瘤特異性抗原肽對DC進行抗原負載，并根據腫瘤臨床檢測結果進行組合應用，增強免疫細胞治療的靶向性，降低移植物抗宿主病發生幾率，提高治療安全性。抗凝劑不采用EDTA,EDTA是鈣鎂等離子螯合劑，能夠抑制核酸酶的活性，影響細胞分裂。本發明的細胞凍存液采用5%的DMSO，DMSO能顯著地改變細胞內許多酶的活性，抑制蛋白的合成；改變細胞的呼吸功能，使細胞耗氧量下降；它還是一種自由基清除劑，可減輕冷凍及復溫過程中產生的自由基對細胞的損害，但DMSO有一定的毒性，并且研究表明5%濃度的DMSO比10%濃度的 DMSO更有利于減少CD34^＋細胞的凋亡和壞死，凍存后細胞的活力也高。

附圖說明

圖1為培養至第6天時，初分化的DC細胞在倒置顯微鏡下的形態，放大倍率為5×。

圖2為培養至第9天時，成熟的DC細胞在倒置顯微鏡下的形態，放大倍率為20×。

圖3為培養至第7天時，CIK細胞在倒置顯微鏡下的形態，放大倍率為20×。

圖4為培養至第9天時，CIK細胞在倒置顯微鏡下的形態，放大倍率為20×。

圖5為培養至第15天時，共培養細胞在倒置顯微鏡下的形態，放大倍率為20×。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。

實施例1。

本實施例提供一種人臍帶血免疫細胞庫的構建方法，包括以下步驟。

步驟1、臍帶血的采集及運輸。

需要采集：臍帶血采集時需對母體血和臍帶血進行傳染病篩查，并記錄臍帶血內CD34^＋細胞數，CD34^＋細胞的數目跟造血干細胞的數目直接相關，而本實施例的DC細胞由造血干細胞分化而來，對CD34^＋細胞的數量要求是不低于1×10⁵，篩查合格后方可使用。臍帶血采集后需加入抗凝劑，抗凝劑為肝素。血樣需在4℃條件下保存，12h內運至實驗室。

步驟2、分離單個核細胞。

（1）稀釋血樣本：將血液分裝至無菌離心管每管25ml，1200g條件下離心處理10min， 然后將上部血漿層用移液管吸出，下層為紅細胞、白細胞、血紅蛋白和血小板等有形成分；用生理鹽水稀釋剩余的有形成分，并充分混勻，定容至45ml，得到稀釋的血標本。

（2）離心處理：取稀釋的血標本，緩慢加入裝有人淋巴細胞分離液（天津灝洋生物科技有限公司，批號1501012600）的無菌離心管中，500g條件下離心處理30min。

（3）細胞處理：離心完畢后，離心管內出現明顯的分層，由下到上分別為：紅細胞層、粒細胞層、人淋巴細胞分離液Ficoll層、單個核細胞層和血漿生理鹽水層；吸取血漿生理鹽水層棄之，直至距單個核細胞層5mm處；將粒細胞層之上的所有液體轉移至無菌離心管中，向離心管中補充與轉移液體等體積的生理鹽水，混勻后300g離心10min，去除上清，得到單個核細胞。

步驟3、將單個核細胞內的CD34^＋細胞誘導成DC細胞，從而增加貼壁細胞總量。

用AIM-V培養基（Gibco無血清T細胞培養基）將單個核細胞調整到2-5×10⁶/ml，之后接種至T75培養瓶中，每瓶約接種20ml細胞懸液；向每個培養瓶中加入DC誘導因子1ml（成分為：50ng/ml的rhSCF（重組人干細胞生長因子）、30ng/ml的rhFLT-3L（重組人Fms樣酪氨酸激酶受體3-配體）、30ng/ml的TPO（促血小板生成素）、20ng/ml的rhIL-3（人重組白介素3）、20ng/ml的rhIL-11（人重組白介素11）；均為商業購買），置37℃、5% CO₂的二氧化碳培養箱培養。

培養至第2天時，加入1000U/ml的rhGM-CSF（重組人巨噬細胞集落刺激因子）200ul、500U/ml rhIL-4（重組人白介素4）200ul和500U/ml 的rhIL-15（重組人白介素15）200ul，置37℃、5% CO₂的二氧化碳培養箱繼續培養。

步驟4、分離來自單核細胞層和Ficoll層的懸浮的淋巴細胞。

培養至第3天時，將培養液轉至無菌離心管中，再緩慢往T75瓶中加入20ml生理鹽水，輕輕晃動洗滌T75瓶，收集殘留非貼壁細胞，即懸浮的淋巴細胞。

步驟5、選擇腫瘤抗原肽對DC細胞進行抗原負載，獲得成熟的DC細胞。

向洗滌后的T75培養瓶中加入30ml AIM-V培養基，加入1500ng的rhSCF、900ng的rhFLT-3L、900ng的TPO、30000U的rhGM-CSF和15000U rhIL-4，置37℃、5% CO₂的二氧化碳培養箱，繼續培養貼壁細胞。

當貼壁細胞培養至第6天時，見圖1，半量換液，200g離心處理10min，回收移出液中的懸浮細胞，補充20000U rhGM-CSF和10000UrhIL-4，并加入選定的特異性腫瘤抗原肽（肺癌的CEA,CK19抗原）進行負載，置37℃、5% CO₂二氧化碳培養箱中，繼續培養。

當貼壁細胞培養至第7天時，加入1000U/ml 的rhTNF-α（人重組腫瘤壞死因子-α）300ul，置37℃、5% CO₂二氧化碳培養箱，繼續培養。

貼壁細胞培養至第9天左右時，在顯微鏡下觀察細胞，部分細胞已經開始懸浮在培養液中，細胞長出許多突出的樹突，細胞變為毛刺狀懸浮細胞，見圖2，即得到成熟的DC細胞，終止培養。

將添加誘導因子的臍血組記為A組，未添加誘導因子的臍血組記為B組，按照CD80，CD86，HLA-DR，CD1a⁺細胞標志物比例計數，比較各組DC細胞數量，結果見表1。

表1：各組DC細胞數量表。

從表1中可知：添加了細胞誘導因子的A組所得的DC細胞數量遠遠大于未添加的B組所得的DC數量，說明所添加的誘導因子成功誘導擴增了由臍血CD34⁺細胞轉化成的DC細胞。

步驟6、對懸浮的淋巴細胞進行培養，獲得CIK細胞。

將步驟4中的懸浮淋巴細胞200g離心10min，棄上清，用AIM-V培養基調整細胞密度至0.5-2.0×10⁶/ml，接種到培養袋中，加入1000U/ml的IFN-γ300ul（γ干擾素）混勻，置37℃、5.0% CO₂的二氧化碳培養箱培養。

培養24h后，向二氧化碳培養箱培養得到的懸浮培養細胞中，加入2000U/ml的rhIL-2（白介素2）300ul、500U/ml的rhIL-15（白介素15）300ul、50ng/ml的CD3（單克隆抗體）300ul。

根據懸浮細胞培養狀態，每2天2倍添加培養液AIM-V培養基, 并補加培養液終體積1%的4000U/mlrhIL-2。

當培養至第7天時，將培養袋內的懸浮細胞轉移到WAVE Bioreactor system 10中，繼續進行培養8天，獲得CIK細胞。顯微鏡下觀察細胞，細胞呈橢圓形，可見小的細胞克隆團，見圖3。

步驟7、將DC細胞加入CIK細胞內進行大規模共培養。

將步驟5收集的成熟DC細胞1200r離心處理10min，用AIM-V培養基重懸細胞，加入步驟6中的WAVE Bioreactor system 10中，與懸浮細胞共同培養。逐漸添加AIM-V培養基，并補加培養液終體積1%的4000U/mlrhIL-2和500U/ml rhIL-15。

共同培養至第9天時，見圖4，可見較大的細胞克隆團。共同培養至第15天時，培養容器內的細胞可擴增至6×10¹⁰個（50mL的臍帶血），1200r離心10min收集共培養的細胞，即為所需的免疫細胞（DC-CIK細胞）。細胞共培養后，DC細胞把T細胞和CIK細胞聚集到周圍完成抗原的遞呈，見圖5，圖中可看到明顯的兩團細胞的聚集，中間為DC細胞。

步驟8、對成熟的DC-CIK細胞進行檢測。

同時選取一名肺癌病人，提取其血液進行檢測，檢測項目包括流式檢測、無菌檢測、支原體檢測和內毒素檢測等。進行細胞免疫表型的比較，結果見表2。

表2：細胞免疫表型的比較（%）。

由表2可知：臍帶血來源的免疫細胞表面抗原表達率優于病人自體血的免疫細胞表型；臍帶血來源的免疫細胞在凍存前后免疫表型基本無變化。

步驟9、檢測合格后放入免疫細胞庫凍存，并建立細胞檔案；所述免疫細胞庫是針對不同腫瘤抗原肽的多種效應細胞的集合；該種細胞庫的構建即可避免抽血給病人帶來的痛苦，又可減少患者因細胞培養增加的住院時間。

將收集的免疫細胞按照0.1-10×10⁸/ml的密度與預冷的細胞凍存液混合，裝于細胞凍存管或凍存袋內，附上標簽，標簽上描述清楚所負載的腫瘤抗原肽種類，經程序降溫儀以 -1-3℃/min的速度降溫后，轉至液氮罐內。

細胞檔案詳細記錄抗原肽負載類型，細胞檔案需建立電子版檔案和紙質版檔案留存查檔。

所述細胞凍存液配方為5%的DMSO，10%的羥乙基淀粉，85%穩定劑，配制完成后置于4℃冰箱保存備用。穩定劑為25%人血白蛋白，5%乙二醇，70%培養基。

用于針對DC-CIK的細胞凍存液，通過降低DMSO用量，減輕對免疫細胞的侵襲損害，提高細胞復蘇后的質量。凍存液中不同DMSO濃度，在相同凍存時間內，細胞活率的比較結果，見表3。

表3：不同DMSO濃度凍存后的細胞活率比較。

由表3可知：隨著凍存液中DMSO濃度的增加，在相同凍存時間內，細胞活率呈明顯的下降趨勢，因此，在免疫細胞庫的建設中，所用凍存液DMSO的濃度越低越有利于保護細胞活率，5%為最佳。

步驟10、根據肺癌患者的臨床診斷從免疫細胞庫內選擇效應細胞，復蘇培養24h后回輸。

臨床診斷肺癌，其常規腫瘤標志物主要包括CEA、CK19，即可從細胞庫內提取負載CEA和CK19的效應細胞（DC-CIK細胞）。

用AIM-V培養基重懸復蘇后的DC-CIK細胞，并按照4.0-6.0×10⁶/ml的密度接種于細胞培養袋內，按照500U/ml的濃度加入rhIL-2、rhIL-6（白介素6）、rhIL-15，培養24h后，200g離心10min，洗滌，收集免疫細胞進行回輸。所述復蘇培養過程中，增加了rhIL-6、rhIL-15的使用，促進凍存后細胞亞型的恢復。穿孔素表達水平比較結果，見表4。

表4：穿孔素表達水平比較（%）。

由表4可知：免疫細胞凍存后其分泌穿孔素的量明顯下降，但使用本發明實施例1提供的因子組合培養24h后，即可恢復至凍存前水平。