一種長波長檢測肼的熒光探針及其合成方法與應用與流程

本發明屬于化學分析檢測技術領域，具體涉及一種長波長trun-on型檢測肼的熒光探針及其合方法和在檢測肼方面的應用。

背景技術：

肼(N₂H₄)是一種具有強還原性與雙功能基團的高活性小分子化合物。作為化學燃料，反應起始物在航天與燃料電池及抗氧化劑、高分子化合物、殺蟲劑的合成等領域得到了廣泛的應用。但是肼也具有高毒性及至畸變與致癌性，能通過呼吸系統及皮膚被人體攝入，產生頭痛、惡心等癥狀，以及導致肝腎等器官的損傷。美國國家環境保護局規定了肼的安全限量值為10 ppb (0.3μmol·L^-1)。由于肼的大量工業使用排放及毒害作用，因此，開發高靈敏、高選擇檢測肼的方法對環境檢測與保護是非常必要的。

目前檢測肼的方法主要采用滴定測量、衍生化色譜法(Vessman J. J. Chromatogr. A 1990, 511, 303; Anal. 2009, 49, 529.; Oh J-A. Chromatogr. A 2015, 1395, 73.)及基于修飾電極的電化學方法(Joseph M.B. Anal. Chem. 2015, 87, 10064.; Casella I. G. Electroanalysis 2012, 24, 752; Wang J. Sens. Actuators, B 2017, 239, 898.)等。但這些方法一般都耗時較長、涉及復雜繁瑣的樣品處理過程或需要昂貴的精密儀器等。而利用分子探針熒光法檢測肼具有樣品處理簡潔、成本低廉及操作簡便快速等優點，近年來得到了發展與利用。但目前開發的用于檢測肼的熒光探針分子其激發及發射波長大都在中短波段區域，這樣不利于復雜樣品背景干擾的消除，由于波段的光生物穿透能力弱且存在生物損傷性，因此，不利于生物樣品的檢測。而長波長的熒光探針，特別是激發與發射波長均在長波長處的熒光探針能很好的克服上述問題。

技術實現要素：

對于上述情況，本發明目的是提供一種新的易于制備、性能穩定的長波長熒光分子探針，并提供該探針的合成方法，還在此基礎開發出對肼進行高選擇性和高靈敏度的檢測方法。

為實現本發明目的，本發明利用肼具有較強的親電性，能對缺電子分子或基團進行親電反應，而脂肪酸在一定的溶液環境中羰基能選擇性的與肼發生親電加成與脫出反應，設計酯鍵為響應基團。另一方面，基于三氰呋喃為吸電子基團，酚羥基為給電子基團的大π共軛推拉體系，具有很好的長波長熒光發射性能，且通過在酚羥基位引入不同的吸電子基團能改變原熒光分子的推拉電子體系的特性從而改變其熒光性質，設計大π共軛推拉體系骨架作為發光團，合成用于檢測肼的熒光分子探針。

所述檢測肼的熒光分子探針，結構通式如下：

其中R₁、R₂選自具有1至18個碳原子的烷基鏈中的任一種；n₁為1、2或3；n₂取自0–17的任一整數。優選：R₁、R₂選自具有1至6個碳原子的烷基鏈中的任一種；n₁為1、2；n₂取自0–8的任一整數。優選：R₁、R₂選自具有1至4個碳原子的直鏈烷基鏈中的任一種；n₁為1；n₂取自0–4的任一整數。

R₁、R₂可以相同或不同。

進一步優選為：

其反應流程如下：

其合成方法具體如下：

合成分兩步：

第一步：有機溶劑中，將三氰呋喃化合物3與末端對羥基苯基取代的共軛醛加熱回流，縮合反應得到探針分子的前體化合物2；

第二步：有機溶劑中，加入催化劑，將得到的化合物2與脂肪酸衍生物在室溫下進行縮合反應，分離純化后得到最終目標產物探針分子1。

三氰呋喃化合物3中R₁、R₂選自具有1至18個碳原子的烷基鏈中的任一種，優選為1-6個碳原子中的任一種。更優選1至4個碳原子的直鏈烷基鏈中的任一種。

對羥基苯基取代的共軛醛為：

其中：n₃為具為0、1或2；n₃優選為0或1。

脂肪酸衍生物為：

其中X為OH、Cl或Br；優選X為Cl或Br。n₂取自0–17的任一整數，優選n₂取自0–8的任一整數，更優選n₂取自0–4的任一整數。

第一步反應有機溶劑選自乙醇、甲苯。

第二步反應有機溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮。

所述催化劑選自三乙胺、4-二甲氨基吡啶、二環己基碳二亞胺、N,N-二異丙基碳二亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺其中之一。

上述方法中第一步反應時間為4-12 h。

上述方法中第二步反應時間為12-24 h。

更進一步優選如下：

將化合物3(R₁、R₂均為一個碳原子數的烷基)與對羥基苯甲醛在乙醇溶液中回流，得到化合物2(R₁、R₂均為一個碳原子數的烷基，n₁為1)；將化合物2與乙酰氯加入含有三乙胺的無水二氯甲烷中，室溫下反應過夜，減壓蒸餾除去溶劑后分離純化得到探針分子化合物。

反應流程如下：

利用該分子探針對肼進行定性和定量測定，用于水體、土壤或生物體系中肼的檢測。

采用比色法或熒光法檢測時，分子探針溶解于水與二甲基亞砜的混合緩沖溶液中，對肼進行測試。當加入肼后，肼能親核加成羰基，并進一步通過脫除反應，使熒光團的的酚羥基游離出來形成氧負離子的結構，與探針分子的大π共軛吸電子基團三氰呋喃反應，從而產生強烈的分子內電荷轉移(ICT) 效應，使探針溶液的吸收光譜發生紅移，并伴隨產生強的熒光發射特性。

采用熒光法檢測時，所述熒光分子探針對肼的檢測濃度為1 – 50 μmol·L^-1，檢測限為0.13 μmol·L^-1。

本發明熒光探針分子具有如下特點和優點：

該熒光探針分子具有良好的穩定性和光學性質，反應前最大吸收波長為~410nm，單獨溶液呈黃色，在紅光波段無發射；隨著肼的加入，探針分子在紫外吸收峰紅移至~580 nm，溶液呈紫色，在~620nm處有強的熒光發射性質。

本發明所述的探針分子原料易得，合成產率較高，達85%以上，光學性能穩定（探針母液能在室內穩定存放三個月以上，其光譜性質保持不變），高選擇性，對Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、 HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-有很好的抗干擾沒能力，對肼識別能力強，且響應速度較快，響應范圍為1.0 – 50 μmol·L^-1。高靈敏度，檢測限低（0.13 μM），因此，該類型探針可用于水體、土壤以及生物體系中肼的檢測。

附圖說明

圖1為本發明合成的分子探針的核磁共振氫譜；

圖2 為本發明分子探針與肼反應前后的紫外譜圖A與熒光光譜圖B，其中，A圖中，1-反應前，2-反應后；B圖中，1-反應前，2-反應后；

圖3為本發明5 μmol·L^-1分子探針加入不同濃度肼后熒光發射光譜圖，從a至n，肼濃度分別為0、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol·L^-1，溶液體系為水與二甲基亞砜的混合緩沖溶液（H₂O/DMSO=9/1, v/v, 10 mM HEPES, pH 7.4），橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度。

圖4為肼的濃度標準曲線圖，即5 μmol·L^-1本發明分子探針，反應前后在620nm處熒光發射強度的和肼濃度的線性關系；橫坐標為肼的濃度，縱坐標為熒光強度。

圖5為本發明分子探針對肼選擇性；即5 μM本發明分子探針，加入100 μmol·L^-1不同離子(Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、 HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-)后，在620 nm處熒光發射強度的變化；橫坐標為測試的干擾離子，縱坐標為熒光強度。

圖6為本發明分子探針檢測Hela細胞內肼的成像圖片。(A,B)分別是本發明分子熒光探針(20 μmol·L^-1)培養的HeLa的明場圖片和熒光圖片；(C,D)分別是本發明分子熒光探針(20 μmol·L^-1)和N₂H₄(100 μmol·L^-1)培養的Hela細胞的明場圖片和熒光圖片。標尺：50 μm。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例 1：熒光分子探針的合成

將化合物3(R₁、R₂均為一個碳原子數的烷基)(398 mg, 2.0 mmol)與對羥基苯甲醛(268 mg, (2.2 mmol)加入到乙醇(50 mL)中加熱回流反應12h。反應結束后，減壓蒸餾除去溶劑，柱層析住分離得到棕紅色固體(化合物2)。

將化合物2(303 mg,1 mmol)，乙酰氯(157 mg, 2.0 mmol, 142 mL)加入三乙胺 (304 mg, 2.2 mmol, 416 mL)，溶劑二氯甲烷(20 mL)中室溫反應8h。待反應結束后，減壓蒸餾除去溶劑，柱層析柱分離（洗脫劑為二氯甲烷/甲醇=10/1的混合溶液）得到產物黃色固體293mg (收率：85%)。產物結構式如下:

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.61 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.55 (s, 1H), 7.18 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 2.27 (s, 3H), 1.66 (d, J = 58.5 Hz, 6H). MS [ESI]: m/z, calcd for [M+H]⁺ 346.1192; found 346.1184.。

實施例 2：探針對肼的熒光檢測

將上述制得分子探針溶解于水與二甲基亞砜的混合緩沖溶液（H₂O/DMSO=9/1, v/v, 10 mM HEPES, pH 7.4)）中，配制成5 μmol·L^-1的探針溶液。在3 mL的比色皿中加入2mL配制的5 μmol·L^-1 的本發明探針溶液，然后分別加入不同濃度的肼均勻混合，測試其熒光光譜，結果如圖3所示。以溶液在620nm處熒光發射強度對肼的濃度作圖，肼濃度在1.0 – 50 μmol·L^-1范圍內時，兩者之間呈現良好的線性關系(圖4)，能實現該濃度范圍內肼的定量檢測，而且溶液從黃色變為紫色，也適用于裸眼檢測。并且此探針不受其它一些常見離子的影響，如：Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、 HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-。在上述干擾離子存在的條件下，探針對肼仍具有良好的選擇性和靈敏度(圖5)。

將細胞與含本發明探針培養液培養后，再加入肼，于含肼的溶液中培養。細胞熒光成像可觀測到紅色熒光(圖6)。

可以看出，本發明能實現對肼的定性、定量檢測，靈敏度高，檢測限達0.13 μmol·L^-1，且抗干擾強，并能實現細胞內的肼的檢測。