毛酸漿的分子特異性標記引物及鑒別方法與流程

本發明屬于利用分子生物學方法鑒別毛酸漿Physalis pubescens L.的技術領域，涉及一種鑒別毛酸漿的特異性標記引物，以及一種利用該特異性引物對毛酸漿進行快速鑒別的方法。

背景技術：

毛酸漿(Physalis pubescens L.)，別名黃菇蔦、洋菇娘，是茄科(Solanaceae)酸漿屬(Physalis)一年生草本植物。其原產美洲，在我國吉林、黑龍江、遼寧及內蒙東部東南邊緣區域有栽培或逸為野生，多生于草地或田邊路旁。毛酸漿是一種非常重要的藥用食用兼備植物。作為一味民間傳統中藥，毛酸漿在《神農本草經》中最早收錄，并列為中品，其帶萼果實或全草稱為燈籠草，性味酸平，入肺經，具有清熱解毒、利尿止血的功效，可治愈腮腺炎、咽喉腫痛、小便不利及肺熱咳嗽，等。除了藥用功效外，毛酸漿還被用作高檔的新型營養保健“本草水果”，其果實清香可口，味道甜美，果實內含有豐富的維生素C、胡蘿卜素、鈣、鐵等20多種礦物質和18種人體所需要的氨基酸，營養豐富，深受人們喜愛。此外，毛酸漿果實還可加工制成果汁、果脯蜜餞、罐頭等，風味獨特，成人兒童喜食，老幼咸宜。酸漿屬植物(毛酸漿Physalis pubescens、小酸漿P.minima、苦蘵P.angulata及酸漿Physalis alkekengi var.franchetii)的形態學特征極其相似，利用傳統分類方法很難將毛酸漿與其他酸漿屬相似植物區分開。因此，將其他酸漿屬植物誤認為毛酸漿進行使用的情況時有發生，這為毛酸漿資源的安全使用和保護帶來了很大困難。

DNA分子標記尤其是特異性分子標記技術彌補和克服了傳統分類方法的一些缺陷和難題，可以通過基因序列差異比較分析為植物鑒別、系統分類提供直接的證據。本專利首先運用SCoT分子標記技術，采用PCR技術獲得酸漿屬植物SCoT指紋圖譜。經過大量篩選試驗，獲得毛酸漿特異性條帶，通過切膠回收、TA克隆、測序等方法，開發設計了用于毛酸漿快速鑒別的特異性標記引物，為毛酸漿種質資源的準確鑒別及保護提供有效的分子技術依據。迄今為止，尚未有分子特異性標記應用于毛酸漿鑒別的研究報道。

技術實現要素：

本發明第一個目的是針對現有技術的不足，提供毛酸漿的分子特異性標記引物(ST3MSJF/ST3MSJR)，該特異性標記引物序列如下：

上游引物ST3MSJF：5’-ATTGATAGGGTAAACCATG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物ST3MSJR：5’-CTGTAATAAAACAAAAGCG-3’，如SEQ ID NO.2所示。

該引物組合是采用常規PCR技術，經過大量篩選實驗，采用SCoT標記獲得毛酸漿特異性DNA片段，通過切膠回收、TA克隆、測序，獲得該DNA序列，在此基礎上設計毛酸漿特異性標記引物，以該引物對酸漿屬植物進行PCR擴增，只與毛酸漿樣本DNA發生反應，獲得1479bp大小的特異性片段，而不與其他酸漿屬植物樣品反應。運用該特異性引物，通過常規PCR反應即可以快速鑒別出毛酸漿樣品。

本發明的第二個目的是提供上述分子特異性標記引物鑒別毛酸漿的方法。該方法為：采用上述引物組合(ST3MSJF/ST3MSJR)作為特異性擴增引物，以待測酸漿屬植物基因組DNA為模板，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現分子量為1479bp大小的特異性片段，則待測酸漿屬植物樣品為毛酸漿，反之則不是。

具體的本發明所述方法如下：

(1)基因組DNA的提取：剪取待測酸漿屬植物樣品新鮮葉片100mg放入研缽，立即加入液氮研磨至粉末，然后使用UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(購于上海生工生物工程有限公司)提取基因組DNA，所得DNA用0.8％瓊脂糖膠進行電泳檢測，并用紫外分光光度計檢測濃度，稀釋至50ng/μl。

(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物(ST3MSJF/ST3MSJR)作為擴增引物，進行PCR擴增。

PCR擴增體系(總體積20μl)：2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂(25mM)，0.8μl dNTPs(10mM)，1μl引物ST3MSJF(10μM)，1μl引物ST3MSJR(10μM)，1μl模板DNA(50ng/μl)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，11.7μl ddH₂O。

PCR反應程序：94℃預變性5min；35個循環(94℃變性50s，56℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

(3)利用1.5﹪瓊脂糖凝膠對步驟(2)PCR產物進行電泳檢測，經凝膠成像系統拍照檢測，若電泳結果出現分子量為1479bp大小的DNA條帶，則待測樣品為毛酸漿，反之則不是。

本發明實驗樣品用量少；結果準確、靈敏度高，ST3MSJF/ST3MSJR為毛酸漿專一性擴增引物，若為其他酸漿屬植物樣品，為陰性反應；方法簡便，采用常規PCR技術進行檢測，耗時短，半日即可完成。

附圖說明

圖1是利用本發明設計的特異性標記引物ST3MSJF/ST3MSJR對酸漿屬植物樣品進行PCR擴增后的電泳圖，其中M為DNA分子量標準marker DL2000；通道1～4：小酸漿P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸漿P.alkekengi var.franchetii；18～20：毛酸漿P.pubescens。電泳圖顯示只有毛酸漿樣品擴增出分子量為1479bp大小的特異性DNA條帶。

具體實施方式

本發明可以從分子水平上較為快速準確的鑒別毛酸漿樣品，通過以下實施例對本發明做進一步說明，但本發明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1：毛酸漿分子特異性標記引物開發設計

1.基因組DNA的提取

剪取酸漿屬植物樣品新鮮葉片100mg放入研缽，其中樣品包括小酸漿(采自1：河北唐山、2：山東菏澤、3：安徽六安、4：浙江麗水)、苦蘵(5-6：浙江杭州、7：湖北黃岡、8：云南紅河、9：江蘇南京、10：浙江臺州、11：浙江溫州、12：浙江金華、13：山東德州)、酸漿(14：遼寧沈陽、15-16：遼寧丹東、17：山東濟南)及毛酸漿(18：遼寧沈陽、19：黑龍江肇東、20：吉林長春)。立即加入液氮研磨至粉末，然后使用UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(購于上海生工生物工程有限公司)提取基因組DNA，所得DNA用0.8％瓊脂糖膠進行電泳檢測，并用紫外分光光度計檢測濃度，稀釋至50ng/μl。用于后續PCR擴增。

2.設計分子特異性標記引物

經過大量SCoT-PCR擴增篩選實驗，通過切膠回收、TA克隆、以及測序獲得毛酸漿特異性核苷酸序列，在此基礎上設計獲得ST3MSJF/ST3MSJR引物序列(ST3MSJF：5’-ATTGATAGGGTAAACCATG-3’；ST3MSJR：5’-CTGTAATAAAACAAAAGCG-3’)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

實施例2：分子特異性標記引物PCR擴增及電泳檢測

用設計合成的引物ST3MSJF/ST3MSJR對不同酸漿屬植物樣品(具體見附圖說明)進行PCR檢測。

PCR反應體系(總體積20μl)：2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂(25mM)，0.8μl dNTPs(10mM)，1μl引物ST3MSJF(10μM)，1μl引物ST3MSJR(10μM)，1μl模板DNA(50ng/μl)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，11.7μl ddH₂O。

PCR反應程序：94℃預變性5min；35個循環(94℃變性50s，56℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

利用1.5﹪瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳檢測，電泳圖如圖1所示，從圖1(圖中，通道M為DNA分子量標準marker DL2000；通道1～4：小酸漿P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸漿P.alkekengi var.franchetii；18～20：毛酸漿P.pubescens)可以看出，只有毛酸漿(通道18～20)能擴增出特異性片段，將毛酸漿的特異性片段送去測序，其序列長度為1479bp。而其他酸漿屬植物樣品沒有擴增出任何條帶，這表明本發明的特異性引物具有極高的專一性，因此可以用于毛酸漿樣品的快速鑒別。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州師范大學

<120> 毛酸漿的分子特異性標記引物及鑒別方法

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工合成

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