一種非核糖體多肽活性產物的獲得方法與流程

本發明涉及一種非核糖體多肽活性產物的獲得方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術：

非核糖體多肽是通過非核糖體途徑合成的一系列低分子量、具有多種藥用價值的多肽類次生代謝產物，在化學結構和生物活性上都具有豐富多樣性。自然界中已經發現了一千多種非核糖體多肽化合物，包含多種抗生素、毒素、免疫抑制劑、生物表面活性劑、激素和抗腫瘤物質等。自然界中真菌能夠合成許多種真菌毒素，像是白僵菌素、類白僵菌素、恩鐮孢菌素等，這些天然物質大都具有廣泛的生物學活性，如抗菌、殺蟲、除草、抗逆轉錄以及化學增敏等活性，還有一些被證明能夠抑制阿茲海默癥中老年斑的形成以及抑制新生腫瘤形成等。這些真菌毒素就是非核糖體多肽中重要的一大類。但是從自然界中獲得可合成以上物質的野生菌非常困難且產量少。所以目前獲取工藝幾乎為通過化工獲取，化工方式的缺陷為產量低，工藝復雜，生物方式合成產量高，且可控，但菌株獲得困難。

以生物的方式指導合成非核糖體多肽需要經由一類稱為非核糖體多肽合成酶來完成，它是一類大的多酶復合物，由一系列被稱為模塊的重復催化單位和結構單位所組成，具有廣泛的催化底物特異性，適合于新型化合物分子的工程化生物合成。充分了解這些酶的催化機 制有利于通過人工途徑獲得非核糖體多肽，也是合成新型化合物的關鍵。

技術實現要素：

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種非核糖體多肽活性產物的獲得方法，通過合理設計并重新構建基因工程菌，更有效地生產非核糖體多肽。

實現本發明的目的可以通過采取如下技術方案達到：一種非核糖體多肽活性產物的獲得方法，其包括：

以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，通過聚合酶鏈式反應分別擴增出具有AscI位點的目標基因片段G1和具有BsrGI位點的目標基因片段G2，然后將G1連接到載體的NheI和PmlI位點之間，構建質粒P1，G2連接到另一個載體的NdeI和PmlI位點之間，構建質粒P2的步驟；和，

以P1和P2為模板，通過重疊延伸PCR技術，擴增出目標基因片段G3的步驟；和，

將G3連接到P1的AscI和PmlI位點之間或P2的BsrGI和PmlI位點之間，獲得重組質粒P3的步驟；和，

將P1、P2或P3與包含NpgA基因片段的質粒P4共轉化導入標準菌株ATCC 208288，得到基因工程菌的步驟；和

將基因工程菌進行培養發酵，提取，得到非核糖體多肽活性產物的步驟。

作為優選，1)構建重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pE SC-URA：

①以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物bbBeas-F:5’-aaGCTAGCatggagccgctcaaaaatgt-3’，

下游引物bbBeas-R:5’-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3’，

通過聚合酶鏈式反應擴增目標基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)，擴增反應的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分鐘，36個循環；

②利用限制性核酸內切酶NheI和PmlI將步驟①擴增得到的目標基因片段連接到pESC-URA載體上的NheI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA；

2)構建重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA：

Ⅰ)以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物bbBsls-F:5′-aaCATATGgagccacccaacaacgc-3′，

下游引物bbBsls-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′，

通過聚合酶鏈式反應擴增目標基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)，擴增反應的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分鐘，36個循環；

Ⅱ)利用限制性核酸內切酶NdeI和PmlI將上述擴增得到的基因片段連接到pESC-URA載體上的NdeI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA；

3)通過以下A、B、C、D、E或F步驟構建重組質粒；

A

A1.以步驟1)得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)inpESC-URA和步驟2)得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)inpESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物BbBEAS with T_2aT_2bC_3(BbBSLS)-R:5'-ggtgccgacttttgcaccatcgtcgtcgtccggg-3'，

下游片段上游引物BbBEAS with T_2aT_2bC_3(BbBSLS)-F:5'-cccggacgacgacgatggtgcaaaagtcggcacc-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

得到目標基因片段(AscI)bbBeas with T_2aT_2bC_3(bbBsls)；

A2.利用限制性核酸內切酶AscI和PmlI將步驟A1中得到的目標基因片段連接到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA的AscI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBeas)T_2aT _2bC_3(bbBsls)in pESC-URA；

B

B1.以步驟1)得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)inpESC-URA和步驟2)得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物BbBEAS with T_2bC_3(BbBSLS)-R:5'-tctttcttgtcctggcctccaccaccattcaaag-3'，

下游片段上游引物BbBEAS with T_2bC_3(BbBSLS)-F:5'-ctttgaatggtggtggaggccaggacaagaaaga-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

得到目標基因片段(AscI)bbBeas with T_2bC_3(bbBsls)；

B2.利用限制性核酸內切酶AscI和PmlI將步驟B1中得到的目標基因片段連接到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA的AscI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBeas)T_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA；

C

C1.以步驟1)得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)inpESC-URA和步驟2)得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)inpESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物BbBEAS with C_3(BbBSLS)-R:5'-gcatcggcggcgggaatgagttgaaacgcagtgt-3'，

下游片段上游引物BbBEAS with C_3(BbBSLS)-F:5'-acactgcgtttcaactcattcccgccgccgatgc-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

得到目標基因片段(AscI)bbBeas with C_3(bbBsls)；

C2.利用限制性核酸內切酶AscI和PmlI將步驟C1中得到的目標基因片段連接到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA的AscI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBeas)-C_3(bbBsls)in pESC-URA；

D

D1.以步驟1)得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA和步驟2)得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物BbBSLS with T_2aT_2bC_3(BbBEAS)-R:5'-ggcttctttttcttcgtctttttgatagctttgg-3'，

下游片段上游引物BbBSLS with T_2aT_2bC_3(BbBEAS)-F:5'-ccaaagctatcaaaaagacgaagaa aaagaagcc-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

得到目標基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2aT_2bC_3(bbBeas)；

D2.利用限制性核酸內切酶BsrGI和PmlI將步驟D1中得到的目標基因片段連接到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-UR A的BsrGI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBsls)T_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA；

E

E1.以步驟1)得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA和步驟2)得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物BbBSLS with T_2bC_3(BbBEAS)-R:5'-gacccttgcttcgcttgaccaccaccggccgaag-3'，

下游片段上游引物BbBSLS with T_2bC_3(BbBEAS)-F:5'-cttcggccggtggtggtcaagcgaagcaagggtc-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

得到目標基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2bC_3(bbBeas)；

E2.利用限制性核酸內切酶BsrGI和PmlI將步驟E1中得到的目標基因片段連接到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-UR A的BsrGI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBsls)T_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA；

F

F1.以步驟1)得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in p ESC-URA和步驟2)得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物BbBSLS with C_3(BbBEAS)-R:5'-aaatcttcaacagacaagagctggaaggcagtgt-3'，

下游片段上游引物BbBSLS with C_3(BbBEAS)-F:5'-acactgccttccagctcttgtctgttgaagattt-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

得到目標基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2bC_3(bbBeas)；

F2.利用限制性核酸內切酶BsrGI和PmlI將步驟F1中得到的目標基因片段連接到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-UR A的BsrGI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBsls)-C_3(bbBeas)in pESC-URA；

4)構建重組質粒NpgA in pESC-TRP：

α)以純化的Emericella nidulans ATCC 38163菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物NpgA-NdeI-5:5'-aaCATATGgtgcaagacacatcaag-3’，

下游引物NpgA-PmeI-3:5'-aaGTTTAAACttaggataggcaatt-3’，

通過聚合酶鏈式反應擴增目標基因片段NpgA，擴增反應的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃1.1分鐘，30個循環；

β)利用限制性核酸內切酶NdeI和PmeI將步驟α)擴增得到的目標基因片段連接到pESC-TRP載體上的NdeI和PmeI位點之間，得到重組質粒NpgA in pESC-TRP；

5)構建工程菌株：

將步驟1)得到的重組質粒、步驟2)得到的重組質粒或步驟3)通過A、B、C、D、E或F得到的重組質粒與步驟4)得到的重組質粒NpgA in pESC-TRP共轉化導入標準菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株；

6)提取非核糖體多肽活性產物：

將步驟5)中獲得的工程菌株培養進行培養，收集培養液并通過色譜分析柱進行洗脫，得到非核糖體多肽活性產物。

再優選地，3)的A、B、C、D、E和F步驟中，重疊延伸PCR技術的擴增反應的條件均為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環。

再優選地，步驟5)中，通過聚乙二醇-醋酸鋰介導的方法將步驟3)通過A、B、C、D、E或F得到的重組質粒與重組質粒NpgA in pESC-TRP共轉化導入標準菌株ATCC 208288中。

再優選地，步驟6)中，將步驟5)中獲得的工程菌株培養在含有1％葡萄糖的YPD培養基中，在溫度30℃，轉速250rpm的條件下震蕩培養3天，得到培養液；

將培養液用等體積的乙酸乙酯提取，得到提取液；

將提取液進行減壓蒸干后，放入MCI色譜分析柱中，進行梯度洗脫，收集含有非核糖體多肽活性產物的組分用乙腈水溶液進行洗脫純化，得到非核糖體多肽活性產物。

再優選地，將提取液進行減壓蒸干后，放入MCI色譜分析柱中，依次用體積比為0:100、20:80、50:50和100:0的甲醇水溶液進行梯度洗脫。

相比現有技術，本發明的有益效果在于：

1、本發明通過合理設計并重新構建基因工程菌，更有效地生產非核糖體多肽；

2、本發明方法具有產物可控的特點，穩定生產非核糖體多肽、產物產率高、不受原料限制、操作過程易控制、生產成本低。

附圖說明

圖1為實施例18的質譜圖；

圖2為實施例19的質譜圖；

圖3為實施例20的質譜圖；

圖4為實施例23的質譜圖。

具體實施方式

下面，結合附圖以及具體實施方式，對本發明做進一步描述：

實施例1

實施例1用于說明質粒P1的構建過程。

構建重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)：

①以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物bbBeas-F:5’-aaGCTAGCatggagccgctcaaaaatgt-3’，

下游引物bbBeas-R:5’-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3’，

通過聚合酶鏈式反應擴增目標基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)(G2)，擴增反應的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分鐘，36個循環；

②利用限制性核酸內切酶NheI和PmlI將步驟①擴增得到的目標基因片段連接到pESC-URA載體上的NheI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)。

其中，目標基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)已編入國際基因 庫，登錄號為EU886196。

實施例2

實施例2用于說明質粒P2的構建過程。

構建重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)：

Ⅰ)以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物bbBsls-F:5′-aaCATATGgagccacccaacaacgc-3′，

下游引物bbBsls-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′，

通過聚合酶鏈式反應擴增目標基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)(G2)，擴增反應的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分鐘，36個循環；

Ⅱ)利用限制性核酸內切酶NdeI和PmlI將上述擴增得到的基因片段連接到pESC-URA載體上的NdeI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)。

其中，目標基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)已編入國際基因庫，登錄號為FJ439897。

實施例1～2中：Beauveria bassiana菌株購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，編號為ATCC 7159；pESC-URA載體(pESC-URAVector)購自安捷倫科技公司(Agilent Technologies)，貨號為217454；DNA聚合酶、限制性核酸內切酶NheI、NdeI和PmlI購自寶生物工程(大連)有限公司；引物組合經設計后由生工生物工程(上海)股份有限公司生產。

實施例3～8

實施例3～8用于說明以P1和P2為模板，通過重疊延伸PCR技術，擴增出目標基因片段G3的步驟；和，將G3連接到P1的AscI和PmlI位點之間，獲得重組質粒P3的步驟。

實施例3

A1.以實施例1得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)inpESC-URA(P1)和實施例2得到的重組質粒

C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)為模板，通過重疊延伸PCR技術，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，上游片段下游引物BbBEAS with T_2aT_2bC_3(BbBSLS)-R:

5'-ggtgccgacttttgcaccatcgtcgtcgtccggg-3'，

下游片段上游引物BbBEAS with T_2aT_2bC_3(BbBSLS)-F:

5'-cccggacgacgacgatggtgcaaaagtcggcacc-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

擴增反應的條件為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環；得到目標基因片段(AscI)bbBeas with T_2bC_3(bbBsls)(G3)。

A2.利用限制性核酸內切酶AscI和PmlI將步驟A1中得到的目標基因片段連接到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)的AscI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBeas)T_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P3)。

實施例4

B1.以實施例1得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)和實施例2得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)為模板，通過重疊延伸PCR技術，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物BbBEAS with T_2bC_3(BbBSLS)-R:

5'-tctttcttgtcctggcctccaccaccattcaaag-3'，

下游片段上游引物BbBEAS with T_2bC_3(BbBSLS)-F:

5'-ctttgaatggtggtggaggccaggacaagaaaga-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

擴增反應的條件為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環；得到目標基因片段(AscI)bbBeas with T_2aT_2bC_3(bbBsls)(G3)。

B2.利用限制性核酸內切酶AscI和PmlI將步驟B1中得到的目標基因片段連接到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)的AscI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBeas)T_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P3)。

實施例5

C1.以實施例1得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)和實施例2得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)為模板，通過重疊延伸PCR技術，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物BbBEAS with C_3(BbBSLS)-R:

5'-gcatcggcggcgggaatgagttgaaacgcagtgt-3'，

下游片段上游引物BbBEAS with C_3(BbBSLS)-F:

5'-acactgcgtttcaactcattcccgccgccgatgc-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

擴增反應的條件為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環；得到目標基因片段(AscI)bbBeas with C_3(bbBsls)(G3)。

C2.利用限制性核酸內切酶AscI和PmlI將步驟C1中得到的目標基因片段連接到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)的AscI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBeas)-C_3(bbBsls)in pESC-URA(P3)。

實施例6

D1.以實施例1得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)和實施例2得到的重組質粒

C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)為模板，通過重疊延伸PCR技術，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物BbBSLS with T_2aT_2bC_3(BbBEAS)-R:

5'-ggcttctttttcttcgtctttttgatagctttgg-3'，

下游片段上游引物BbBSLS with T_2aT_2bC_3(BbBEAS)-F:

5'-ccaaagctatcaaaaagacgaagaaaaagaagcc-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

擴增反應的條件為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環；得到目標基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2aT_2bC_3(bbBeas)(G3)。

D2.利用限制性核酸內切酶BsrGI和PmlI將步驟D1中得到的目標基因片段連接到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA的BsrGI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBsls)T_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P3)。

實施例7

E1.以實施例1得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)和實施例2得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)為模板，通過重疊延 伸PCR技術，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物BbBSLS with T_2bC_3(BbBEAS)-R:

5'-gacccttgcttcgcttgaccaccaccggccgaag-3'，

下游片段上游引物BbBSLS with T_2bC_3(BbBEAS)-F:

5'-cttcggccggtggtggtcaagcgaagcaagggtc-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

擴增反應的條件為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環；得到目標基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2bC_3(bbBeas)(G3)。

E2.利用限制性核酸內切酶BsrGI和PmlI將步驟E1中得到的目標基因片段連接到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA的BsrGI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBsls)T_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P3)。

實施例8

F1.以實施例1得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)和實施例2得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)為模板，通過重疊延伸PCR技術，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物BbBSLS with C_3(BbBEAS)-R:

5'-aaatcttcaacagacaagagctggaaggcagtgt-3'，

下游片段上游引物BbBSLS with C_3(BbBEAS)-F:5'-acactgccttccagctcttgtctgttgaagattt-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

擴增反應的條件為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環；得到目標基因片段(BsrGI)bbBsls with C_3(bbBeas)(G3)。

F2.利用限制性核酸內切酶BsrGI和PmlI將步驟F1中得到的目標基因片段連接到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA的BsrGI和PmlI位點之間，得到重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBsls)-C_3(bbBeas)in pESC-URA(P3)。

實施例3～8中：所使用的限制性核酸內切酶AscI、BsrGI和PmlI均購自寶生物工程(大連)有限公司；引物組合經設計后由生工生物工程(上海)股份有限公司生產。

實施例9

實施例9用于說明質粒P4的構建過程。

構建重組質粒NpgA in pESC-TRP(P4)：

α)以純化的Emericella nidulans ATCC 38163菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物NpgA-NdeI-5:5'-aaCATATGgtgcaagacacatcaag-3’，

下游引物NpgA-PmeI-3:5'-aaGTTTAAACttaggataggcaatt-3’，

通過聚合酶鏈式反應擴增目標基因片段NpgA，擴增反應的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃1.1分鐘，30個循環；

β)利用限制性核酸內切酶NdeI和PmeI將步驟α)擴增得到的目標基因片段連接到pESC-TRP載體上的NdeI和PmeI位點之間，得到重組質粒NpgA in pESC-TRP(P4)。

實施例9中：目標基因片段NpgA已編入國際基因庫，登錄號為AAF12814；Emericella nidulans菌株購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，編號為ATCC 38163；pESC-TRP載體(pESC-TRP Vector)購自安捷倫科技公司(Agilent Technologies)，貨號為217453；DNA聚合酶、限制性核酸內切酶NdeI和PmeI購自寶生物工程(大連)有限公司；引物組合經設計后由生工生物工程(上海)股份有限公司生產。

實施例10～17

實施例10～17用于說明將P1、P2或P3與包含NpgA基因片段的質粒P4共轉化導入標準菌株ATCC 208288，得到基因工程菌的步驟。

實施例10

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導的方法將實施例1得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA與實施例9得到的重組質粒NpgA in pESC-TRP共轉化導入標準菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株37。

實施例11

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導的方法將實施例2得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA與實施例9得到的重組質粒NpgA in pESC-TRP共轉化導入標準菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株42。

實施例12

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導的方法將實施例3得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBeas)T_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA與實施例9得到的重組質粒NpgA in pESC-TRP共轉化導入標準菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株201。

實施例13

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導的方法將實施例4得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBeas)T_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA與實施例9得到的重組質粒NpgA in pESC-TRP共轉化導入標準菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株204。

實施例14

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導的方法將實施例5得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBeas)-C_3(bbBsls)in pESC-URA與實施例9得到的重組質粒NpgA in pESC-TRP共轉化導入標準菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株203。

實施例15

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導的方法將實施例6得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBsls)T_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA與實施例9得到的重 組質粒NpgA in pESC-TRP共轉化導入標準菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株215。

實施例16

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導的方法將實施例7得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBsls)T_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA與實施例9得到的重組質粒NpgA in pESC-TRP共轉化導入標準菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株205。

實施例17

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導的方法將實施例8得到的重組質粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBsls)-C_3(bbBeas)in pESC-URA與實施例9得到的重組質粒NpgA in pESC-TRP共轉化導入標準菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株224。

實施例10～17中，標準菌株ATCC 208288菌株購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，編號為ATCC 208288。

實施例18～25

實施例18～25用于說明將基因工程菌進行培養發酵，提取，得到非核糖體多肽活性產物的步驟，并對非核糖體多肽活性產物進行檢測。

實施例18

將實施例10中獲得的工程菌株37培養在2L含有1％葡萄糖的YPD培養基中，在溫度30℃，轉速250rpm的條件下震蕩培養3天，得到培養液；

所述YPD液體培養基中各組分用量分別是：10g/L酵母提取物； 20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖；滅菌。

將培養液用等體積的乙酸乙酯提取3次，合并提取液；

將提取液進行減壓蒸干后，放入MCI色譜分析柱中，并依次用體積比為0:100、20:80、50:50和100:0的甲醇水溶液進行梯度洗脫，其中20:80的洗脫組分中包含目的化合物，收集含有目的化合物的洗脫組分。

對目的化合物的洗脫組分進行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內，乙腈-水的體積比由50:50逐漸提高到100:0；收集在8.3-8.8分鐘流出液，最終從工程菌株37的培養液中分離得到27.8mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進行檢測：

并用Agilent 6130單四極質譜儀在210nm下進行結構鑒定，并對該化合物進行核磁共振和質譜分析，核磁共振數據如表1所示：

表1實施例18的核磁共振數據

質譜圖如圖1所示，得到目的化合物的化學結構式為：

化學式C₄₅H₅₇N₃O₉，實施例18中的得到的目的化合物為白僵菌素(Beauvericin)。

實施例19

將實施例11中獲得的工程菌株42培養并獲得目的化合物，其中菌株的培養發酵、目的化合物提取步驟與實施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在15.3-15.8分鐘流出液，最終從工程菌株42的培養液中分離得到10.6mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進行檢測，檢測步驟與實施例18相同，得到的核磁共振數據如表2所示：

表2實施例19的核磁共振數據

質譜圖如圖2所示，得到目的化合物的化學結構式為：

化學式C₄₈H₈₄N₄O₁₂，實施例19中得到的目的化合物為球孢交酯(Bassianolide)。

實施例20

將實施例12中獲得的工程菌株201培養并獲得目的化合物，其中菌株的培養發酵、目的化合物提取步驟與實施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在13.0-13.5分鐘流出液，最終從工程菌株201的培養液中分離得到3.2mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進行檢測，檢測步驟與實施例18相同，得到的核磁共振數據如表3所示：

表3實施例20的核磁共振數據

質譜圖如圖3所示，得到目的化合物的化學結構式為：

化學式C₆₀H₇₆N₄O₁₂，實施例20中得到的目的化合物為一種新的環狀化合物，稱為FX1。

實施例21

將實施例13中獲得的工程菌株204培養并獲得目的化合物，其中菌株的培養發酵、目的化合物提取步驟與實施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分 離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在13.0-13.5分鐘流出液，最終從工程菌株204的培養液中分離得到3.8mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進行檢測，檢測步驟與實施例18相同，檢測結果與實施例21相同，亦得到目的化合物為新的環狀化合物，稱為FX1。

實施例22

將實施例14中獲得的工程菌株203培養并獲得目的化合物，其中菌株的培養發酵、目的化合物提取步驟均與實施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在13.0-13.5分鐘流出液，最終從工程菌株203的培養液中分離得到3.5mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進行檢測，檢測步驟與實施例18相同，檢測結果與實施例21相同，亦得到目的化合物為新的環狀化合物，稱為FX1。

實施例23

將實施例15中獲得的工程菌株215培養并獲得目的化合物，其中菌株的培養發酵、目的化合物提取步驟均與實施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分 離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在10.0-10.5分鐘流出液，最終從工程菌株215的培養液中分離得到10.9mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進行檢測，檢測步驟與實施例18相同，得到的核磁共振數據如表4所示：

表4實施例23的核磁共振數據

質譜圖如圖4所示，得到目的化合物的化學結構式為：

化學式C₃₆H₆₃N₃O₉，實施例23中得到的目的化合物為恩鐮孢菌C(Enniatin C)。

實施例24

將實施例16中獲得的工程菌株205培養并獲得目的化合物，其中菌株的培養發酵、目的化合物提取步驟均與實施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分 在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在10.0-10.5分鐘流出液，最終從工程菌株205的培養液中分離得到10.1mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進行檢測，檢測結果與實施例23相同，亦得到目的化合物恩鐮孢菌C(Enniatin C)。

實施例25

將實施例17中獲得的工程菌株224培養并獲得目的化合物，其中菌株的培養發酵、目的化合物提取、洗脫純化及檢測步驟均與實施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在10.0-10.5分鐘流出液，最終從工程菌株224的培養液中分離得到10.7mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進行檢測，檢測結果與實施例23相同，亦得到目的化合物恩鐮孢菌C(Enniatin C)。

對于本領域的技術人員來說，可根據以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬于本發明權利要求的保護范圍之內。