一種用金屬離子沉淀劑制備胰激肽釋放酶的方法與流程

本發明涉及的是用金屬離子沉淀劑制備胰激肽釋放酶的方法。以豬胰臟或生產胰島素后所剩的胰渣作為原料，水性溶液提取，金屬離子沉淀劑進行沉淀，制備胰激肽釋放酶。

背景技術：

胰臟是重要的生化藥物原料，從胰臟中提取分離生化制品是生物制藥研究的趨勢之一。目前由胰臟提取的生化制品達四十余種，主要包括酶、多肽、激素、核酸等制品。胰激肽釋放酶是其中一種重要的生化制品，多年的基礎實驗和臨床研究證實，激肽釋放酶可用于高血壓、心絞痛、動脈硬化癥等多種心血管疾病的治療；也可用于治療如缺血性腦血管病，糖尿病引起的腎病等多種微循環障礙性疾病。由于人源組織激肽釋放酶來源少及基因重組技術制備激肽釋放酶成本高的雙重限制，目前臨床上廣泛應用豬胰來源的激肽釋放酶。

當今工業制備及文獻報道的激肽釋放酶的制備工藝主要有三種：第一種方法是以胰臟丙酮粉或胰酶為原料，適當處理提取液后使用離子交換層析，再使用丙酮沉淀洗脫液中的激肽釋放酶（[J]. 昆明醫科大學學報, 2002, 23(1):107-108）；第二種方法是將胰臟勻漿提取液用丙酮分級沉淀，除去部分雜蛋白后將激肽釋放酶沉淀出來，再將沉淀溶解后進行層析純化（[D]. 南昌大學, 2006）；第三種方法是將激肽釋放酶的粗品用硫酸銨分級鹽析沉淀，再將沉淀進行層析純化（[D]. 浙江大學材料與化學工程學院 浙江大學, 2008）。以上普遍采用的生產胰激肽釋放酶的方法都需要先從新鮮豬胰臟中制備粗品或胰酶粉，操作步驟繁瑣，并且制備過程中需要使用大量的丙酮（約投料量7倍）使其成本增加，丙酮不僅對人體具有慢性毒性，對環境容易造成污染，易燃易爆，其儲存和應用均存在安全隱患。雖然丙酮對激肽釋放酶沉淀有一定專屬性，但同時可能使蛋白質發生變性，降低活性回收率。

本發明創新性地采用水性溶液提取，金屬離子沉淀劑進行沉淀的方法制備胰激肽釋放酶，簡化了操作步驟，舍棄了丙酮的大量應用，降低成本，減少安全隱患與環境污染。基于激肽釋放酶具有重要的臨床應用價值和經濟價值，且我國胰臟資源豐富，本發明在降低生產成本、簡化操作步驟、提高胰臟原料的利用度方面具有重要意義。

技術實現要素：

本發明提供了一種用金屬離子沉淀劑制備胰激肽釋放酶的方法。以豬胰臟或生產胰島素后所剩的胰渣為原料，水性溶液攪拌提取，離心，調節提取液pH使其大于胰激肽釋放酶的等電點，使激肽釋放酶帶負電荷，與帶正電的金屬離子沉淀劑共沉淀，制備胰激肽釋放酶。

水性溶液主要指水、乙醇濃度小于50%的乙醇溶液以及pH 2～7的酸性水溶液，主要包括磷酸緩沖液、醋酸緩沖液、鹽酸溶液、硫酸溶液。選取的依據為胰激肽釋放酶的溶解性、穩定性及對胰蛋白酶水解作用的抑制。pH小于2時，胰激肽釋放酶不穩定；pH大于7時，由于胰蛋白酶的水解作用加強，胰激肽釋放酶收率和活力降低。

金屬離子主要指二價金屬離子，如Zn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺及其鹽類，并使其終濃度為0.05 mol/L～0.30 mol/L，若濃度過低，沉淀不完全，影響收率；若濃度過高，金屬離子不易除去，影響酶活力。一價金屬離子如Na⁺、K⁺沉淀效果不佳，三價金屬離子如Fe³⁺、Al³⁺對激肽釋放酶的活性有強的抑制作用。

本發明的特征是以水性溶液進行提取，金屬離子沉淀劑進行沉淀。本發明成功建立了一種新型制備胰激肽釋放酶的方法，舍棄制備過程中有機溶劑的大量運用、降低生產成本、簡化操作步驟、減少環境污染及安全隱患。

具體實施方式

實例1

本實例考察以生產胰島素后所剩的胰渣為原料，Zn²⁺作為金屬沉淀劑，制備胰激肽釋放酶。收集中性乙醇提取胰島素后的胰渣（胰島素提取物方法為：稱取150～200g的豬胰臟勻漿，加入原料重量2.6倍體積的85%乙醇，1% （W/W）Na₂HPO₄、1%（W/W）NaCl、1%（W/W）蔗糖，4mol/L氨水調pH至7.0。室溫攪拌提取4h，4000r/min離心15min，上清液用于制備胰島素），加入其重量5倍體積的0.05mol/L NaAc-HAc緩沖液（pH5.0），室溫下攪拌提取約3h，4000r/min離心15min，收集上清液，稀HCl調pH至4.8, 攪拌加入2mol/L ZnCl₂溶液，使Zn²⁺離子終濃度為0.15mol/L，4℃靜置過夜，4000r/min離心15min，收集沉淀。沉淀用丙酮脫水兩次，乙醚脫脂一次，揮干乙醚，稱重，胰激肽釋放酶粗酶收率為1.94%，透析48h后測定胰激肽釋放酶的活性為0.062U/mg。

實例2

本實例考察以生產胰島素后所剩的胰渣為原料，Ca²⁺作為金屬沉淀劑，制備胰激肽釋放酶。收集中性乙醇提取胰島素后的胰渣，加入其重量5倍體積的0.05mol/L NaAc-HAc緩沖液（pH5.0），室溫下攪拌提取約3h，4000r/min離心15min，收集上清液，稀HCl調pH至4.8, 攪拌加入2mol/L CaCl₂溶液，使Ca²⁺離子終濃度為0.15mol/L，4℃靜置過夜，4000r/min離心15min，收集沉淀。沉淀用丙酮脫水兩次，乙醚脫脂一次，揮干乙醚，稱重，胰激肽釋放酶粗酶收率為1.15%，透析48h后測定胰激肽釋放酶的活性為0.030U/mg。

實例3

本實例考察以豬胰臟為原料，Zn²⁺作為金屬沉淀劑，制備胰激肽釋放酶。稱取150～200g的豬胰臟勻漿，加入胰糜質量3倍體積的0.01mol/L NaAc-HAc緩沖液（pH3.0），室溫下攪拌提取4h左右。監測pH，保持溶液的pH值在3.0～3.5之間。將上述提取液以4000r/min離心，收集上清液，加入4mol/L氨水，調pH至4.6，攪拌加入適量2mol/L ZnCl₂溶液，使Zn²⁺終濃度為0.15mol/L，4℃靜置過夜沉淀。4000r/min離心，收集沉淀并稱量，記為沉淀A，沉淀A 溶解于2～2.5倍體積0.05mol/L 磷酸緩沖液（pH7.0）中，4000r/min離心，取上清液，加入預冷丙酮（-20℃）至丙酮體積比為70%，4℃靜置2h，4000r/min離心，取沉淀，丙酮脫水，乙醚脫脂，得胰激肽釋放酶收率為2.50%，透析72后測胰激肽釋放酶活力為0.26U/mg。

實例4

本實例考察以豬胰臟為原料，Zn²⁺作為金屬沉淀劑，制備胰激肽釋放酶。稱取20g的豬胰臟勻漿，加入胰糜質量3倍體積的0.01mol/L NaAc-HAc緩沖液（pH3.0），室溫下攪拌提取4h左右。監測pH，保持溶液的pH值在3.0～3.5之間。將上述提取液以4000r/min離心，收集上清液，加入4mol/L氨水，調pH至4.4，攪拌加入適量2mol/L ZnCl₂溶液，使Zn²⁺終濃度為0.15mol/L，4℃靜置過夜沉淀。4000r/min離心，收集沉淀并稱量，記為沉淀A，沉淀A 溶解于2～2.5倍體積0.05mol/L 磷酸緩沖液（pH7.0）中，4000r/min離心，取上清液，加入預冷丙酮（-20℃）至丙酮體積比為70%，4℃靜置2h，4000r/min離心，取沉淀，丙酮脫水，乙醚脫脂，胰激肽釋放酶收率為2.85%，透析72后測胰激肽釋放酶活力為0.22U/mg。

實例5

本實例考察以豬胰臟為原料，Zn²⁺作為金屬沉淀劑，制備胰激肽釋放酶并進行離子交換層析。稱取150～200g的豬胰臟勻漿，加入胰糜質量3倍體積的0.01mol/L NaAc-HAc緩沖液（pH3.0），室溫下攪拌提取4h左右。監測pH，保持溶液的pH值在3.0～3.5之間。將上述提取液以4000r/min離心，收集上清液，加入4mol/L氨水，調pH至4.6，攪拌加入適量2mol/L ZnCl₂溶液，使Zn²⁺終濃度為0.15mol/L，4℃靜置過夜沉淀。4000r/min離心，收集沉淀并稱量，記為沉淀A，沉淀A 溶解于適量0.01mol/L NaAc-HAc緩沖液（pH5.5），用快流速DEAE-瓊脂糖進行層析，層析比活為72.5U/mg蛋白。

實例6

本實例考察以豬胰臟為原料，Ca²⁺作為金屬沉淀劑，制備胰激肽釋放酶。稱取150～200g的豬胰臟勻漿，加入其重量5倍體積的純化水，室溫下攪拌提取約3h，4000r/min離心15min，收集上清液，稀HCl調pH至4.8, 攪拌加入2mol/L CaCl₂溶液，使Ca²⁺離子終濃度為0.15mol/L，4℃靜置過夜，4000r/min離心15min，收集沉淀。沉淀用丙酮脫水兩次，乙醚脫脂一次，揮干乙醚，稱重，胰激肽釋放酶粗酶收率為1.20%，透析48h后測定胰激肽釋放酶的活性為0.025U/mg。

實例7

本實例考察以豬胰臟為原料，Zn²⁺作為金屬沉淀劑，制備胰激肽釋放酶。稱取150～200g的豬胰臟勻漿，加入其重量5倍體積的50%乙醇溶液，室溫下攪拌提取約3h，4000r/min離心15min，收集上清液，稀HCl調pH至4.8, 攪拌加入2mol/L ZnCl₂溶液，使Zn²⁺離子終濃度為0.15mol/L，4℃靜置過夜，4000r/min離心15min，收集沉淀。沉淀用丙酮脫水兩次，乙醚脫脂一次，揮干乙醚，稱重，胰激肽釋放酶粗酶收率為1.05%，透析48h后測定胰激肽釋放酶的活性為0.020U/mg。